siRNA抑制RRM2表達對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖影響的研究

尋慶英，王玲玲，周懷君

(1.東南大學 醫(yī)學院，江蘇 南京 210009; 2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210008)

·論 著·

siRNA抑制RRM2表達對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖影響的研究

尋慶英1，王玲玲2，周懷君2

(1.東南大學 醫(yī)學院，江蘇 南京 210009; 2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210008)

目的：探討小干擾RNA(siRNA)抑制RRM2基因表達對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖及侵襲能力的影響。方法：針對RRM2基因設計siRNA，利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將siRNA片段導入Ishikawa細胞中。用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，流式細胞術檢測細胞轉(zhuǎn)染率、凋亡率及細胞周期，用MTT比色法檢測siRNA對Ishikawa細胞增殖的影響，半定量q-PCR和Western blot分別檢測RRM2在mRNA和蛋白水平上表達的變化，用transwell小室檢測細胞體外侵襲能力。結果：設計的siRNA能有效地抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的增殖，降低侵襲能力，誘導細胞凋亡，并使細胞阻滯于G1期，減少S和G2期的細胞，同時RRM2在mRNA及蛋白水平上的表達明顯減少，而對照的錯義序列組Ishikawa/Neg-ative-siRNA則沒有上述效應。結論:體外合成的siRNA可降低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中RRM2的表達，且抑制細胞增殖，降低細胞侵襲能力，促進細胞凋亡并誘導生長停滯。

小干擾RNA； RRM2基因； 子宮內(nèi)膜癌； Ishikawa細胞

核糖核苷酸還原酶M2(ribonucleotide reductase small subunit，RRM2)是DNA合成和修復的關鍵限速酶[1]，眾多研究表明RRM2與癌腫生物學行為有直接相關性。Cui等[2]檢測到了RRM2 在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病(gestational trophoblastic disease，GTD) 中的表達部位和表達水平，并從基因的mRMA和蛋白水平證明其存在著高表達。目前，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是一項特異性抑制基因表達的成熟方法。一些短的雙鏈RNA即小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，可以高效、特異地降解相關基因的mRNA，誘導細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型[3]。如果將這一技術應用于臨床致病基因的治療，將有助于克服化療藥物的耐藥性以及對某些惡性腫瘤不敏感等問題[4]。本實驗以RRM2基因為靶目標，設計合成了ds-siRNA，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa，獲得RRM2表達抑制細胞模型，并對該細胞的增殖、侵襲能力、凋亡、生長能力進行體外的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa由北京大學魏麗惠教授惠贈。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(杭州四季青公司)；MEM培養(yǎng)基、Trizol 試劑、Lipofectamine 2000TM 脂質(zhì)體( Invitrogen 公司)；MTT(Sigma 公司)；ECL化學發(fā)光試劑(Santa Cruz 公司); BCA 蛋白濃度測定試劑盒(凱基公司)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq聚合酶(美國Promega公司)；RRM2一抗、GAPDH一抗(abCAM公司); RRM2二抗、GAPDH二抗(CHEMICON公司)。凋亡試劑盒、周期試劑盒及Matrigel(BD公司)；Transwell小室(Costar公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa用含10%滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2.2siRNA設計合成 根據(jù)參考文獻[5]和siRNA 的設計原則，設計干擾序列siRNA為5′-GGATCCCTG TTCTATCCGAACAGCATTTTGATATCCGAATGCTGTTC GGATAGAACAGCGCTCGAG-3′，同時設計出非特異性靶序列為5′-GGATCCCCACGGCCTGCTTAATTAATG TTGATATCCGACATTAATTAAGCAGGCGTGGCGCTCG AG-3′，由Genscript公司合成、測序，測序正確后大量提取質(zhì)粒，-20 ℃保存。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 在6孔培養(yǎng)板中常規(guī)接種Ishikawa細胞，待細胞70%～80%融合后，根據(jù)Lipofectamine2000TM試劑操作指南進行轉(zhuǎn)染。siRNA與Lipofectamine2000TM分別用適量不含血清和抗生素的MEM稀釋，5 min內(nèi)按最佳轉(zhuǎn)染比例混合，室溫靜置20 min后加入細胞孔中，細胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察。將轉(zhuǎn)染了RRM2-siRNA的細胞命名為Ishikawa/RRM2-siRNA，轉(zhuǎn)染了Negative-RRM2的細胞命名為Ishikawa/Negative-siRNA。轉(zhuǎn)染后48 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染效率及凋亡率 收集轉(zhuǎn)染24、48和72 h的Ishikawa細胞，PBS洗滌并重懸細胞至約106ml-1，每組均分2份。一份直接在流式細胞儀上檢測轉(zhuǎn)染效率；另一份按凋亡試劑盒說明操作后在流式細胞儀上檢測。

1.2.5流式細胞術檢測細胞周期 收集不同濃度作用24 h的Ishikawa細胞及對照組Ishikawa細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，PBS洗滌并重懸細胞至約106ml-1，按周期試劑盒說明操作后在流式細胞儀上檢測。

1.2.6MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以每孔104個細胞接種于96孔板，次日按Lipofectamine 2000TM試劑操作指南進行轉(zhuǎn)染。分為轉(zhuǎn)染后24、48和72 h，共3組，每組設5個復孔，到時間點后每孔加入20 μl( 5 mg·ml-1)MTT，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入DMSO 150 μl，避光30 min后，充分振蕩10 min，使結晶充分溶解，選擇570 nm波長，酶標儀測定各孔的吸光度(A)值，實驗重復3次，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率(%)=(1-轉(zhuǎn)染組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.2.7q-PCR檢測RRM2 mRNA表達的變化 收集轉(zhuǎn)染24、48和72 h及未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞，按Trizol操作說明，分別提取總RNA，紫外分光光度計定量。逆轉(zhuǎn)錄反應體系25 μl:2 μg RNA，1 μl Oligo(dT)，1 μl M-MlvRT酶，2 μl dNTP(10 mmol·L-1)，5 μl 5×buffer，DEPC水補至25 μl，按說明書步驟操作。PCR 反應以β-actin 為內(nèi)參照，RRM2上游引物序列為5′-AGAGGCTACCTA TGGTGA ACG-3′，下游引物的序列為5′-GTCTGTCTGCCACAAACTCAA-3′，擴增片斷長度359 bp；β-actin上游引物為5′-GCTCGTCGTCGACAACGG CTC-3′，下游引物為5′ -CAAACATGATCTGGGTCATCTT CTC-3′，擴增產(chǎn)物為241 bp (引物序列設計合成均由Invitrogen公司完成)。反應體系50 μl，含cDNA 模板1 μl，10×buffer 5 μl，2.5 mmol·L-1MgCl23 μl，2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μl，RRM2上、下游引物各1 μl，β-actin 上、下游引物各1 μl，Taq DNA聚合酶0.25 μl，滅菌水補至50 μl。反應條件為: 預變性94 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s，64 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。q-PCR產(chǎn)物以20 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳后，觀察結果及照相，并應用Gelpro分析軟件對電泳條帶進行掃描，檢測各組RRM2 mRNA q-PCR產(chǎn)物與其對應的內(nèi)參β-actin mRNA q-PCR 產(chǎn)物的A值，并將A(RRM2) /A(β-actin)的比值進行統(tǒng)計學分析。

1.2.8Western blot檢測RRM2蛋白表達的變化 收集轉(zhuǎn)染24、48和72 h及未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞，用適量裂解液裂解，BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，上樣50 μg總蛋白，10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，4 ℃封閉過夜后，與RRM2一抗( 1∶2 000 稀釋)和GAPDH一抗( 1∶5 000稀釋)在37 ℃孵育4 h，TBST洗滌15 min×3次，加入RRM2二抗( 1∶100 000 稀釋)和GAPDH二抗( 1∶5 000 稀釋)，37 ℃孵育2 h，TBST洗滌15 min×3次，ECL發(fā)光試劑對PVDF膜進行顯色反應，X膠片曝光，拍照，對條帶進行光密度掃描，檢測各組RRM2蛋白和內(nèi)參GAPDH所對應條帶A值，然后將A(RRM2)/A(GAPDH)的值進行統(tǒng)計學分析。

1.2.9細胞侵襲能力的測定 收集轉(zhuǎn)染48 h及未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×105ml-1，用matrigel鋪蓋于transwell小室的上下室之間的8 μm孔徑的PVP多孔濾膜上，100 μl matrigel/膜,37℃ 0.5h。于transwell小室的下室加入0.8 ml趨化劑，上室中加入各組細胞懸液100 μl，37 ℃體積分數(shù)5 %CO2培養(yǎng)24 h，取出濾膜，經(jīng)體積分數(shù)95%乙醇固定10 min，常規(guī)作0.1%結晶紫染色，隨機于顯微鏡下取上、下、左、右、中心5 個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取每個視野的平均數(shù)表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 細胞瞬時轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染后48 h Ishikawa/RRM2-siRNA組見有綠色熒光細胞，約占細胞總數(shù)的40 %(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染效率的檢測(×200)

Fig 1 The transfection efficiency of Ishikawa cells was detected by fluorescene microscope (×200)

2.2 流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染效率及凋亡率情況

流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染率結果顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h的轉(zhuǎn)染率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h的轉(zhuǎn)染率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA及Ishikawa/RRM2-siRNA 3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中Ishikawa/RRM2-siRNA的轉(zhuǎn)染率明顯高于其它兩組。流式細胞術測凋亡率結果顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h的凋亡率差異則有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Ishikawa/Negative-siRNA及Ishikawa/RRM2-siRNA細胞的凋亡率較Ishikawa組明顯升高，其中Ishikawa/RRM2-siRNA的凋亡率最高。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測3組轉(zhuǎn)染率和細胞凋亡率的比較

Fig 2 The transfection efficiency, apoptotic rate of three groups (Ishikawa, Ishikawa/Negative-siRNA，Ishikawa/RRM2-siRNA) were measured by flow cytometry

2.3 siRNA對Ishikawa細胞周期的影響

轉(zhuǎn)染48 h對Ishikawa細胞周期分布的影響:流式細胞分析表明，Ishikawa/RRM2-siRNA細胞G1期(DNA合成前期)的細胞比例由對照Ishikawa組的(51.08±0.67)% 增至(81.35 ±0.47)%，與Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Ishikawa/RRM2-siRNA與Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA比較S期和G2期(DNA合成期與DNA合成后期)細胞比例降低。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測細胞周期的變化

Fig 3 Cell cycles were measured by flow cytometry

2.4 MTT比色法檢測增殖情況

MTT數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理結果顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但轉(zhuǎn)染48 h和72 h細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA及Ishikawa/RRM2-siRNA 3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義，其中以Ishikawa/RRM2-siRNA增殖最緩慢，其生長抑制率為61.78%。見圖4。

圖4 MTT比色法檢測siRNA對Ishikawa細胞增殖的影響

Fig 4 The proliferation ability of Ishikawa cells was detected by MTT colorimetry

2.5 siRNA對RRM2 mRNA表達水平的影響

瓊脂糖凝膠電泳結果表明，同一時間段內(nèi)各組泳道中細胞內(nèi)源β-actin 基因片段條帶的亮度強弱相似，說明q-PCR 中加入模板的量基本一致，而擴增的RRM2基因電泳帶存在差異。各組ARRM2mRNA/Aβ-actin的統(tǒng)計分析顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h RRM2 mRNA表達的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但轉(zhuǎn)染48 h和72 h RRM2 mRNA表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與Ishikawa組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA組RRM2 mRNA的表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)，與MTT法檢測結果一致。見圖5。

圖5 q-PCR檢測siRNA對Ishikawa細胞RRM2 mRNA表達的影響

Fig 5 The RRM2 mRNA expression in Ishikawa cell(a,b,c, three groups) was detected by q-PCR after transfected siRNA

2.6 siRNA對RRM2蛋白表達水平的影響

Western blot分析結果顯示，同一時間段內(nèi)的GAPDH蛋白條帶亮度幾乎無差異，而轉(zhuǎn)染RRM2-siRNA組的細胞靶基因蛋白表達減少。各組ARRM2/AGAPDH的比值統(tǒng)計分析顯示，轉(zhuǎn)染24 h和48 h后細胞RRM2的蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h后細胞RRM2的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Ishikawa/RRM2-siRNA與Ishikawa、Ishikawa/Negative-siRNA相比，RRM2的蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)。 見圖6。

圖6 Western blot檢測siRNA對Ishikawa細胞RRM2蛋白表達的影響

Fig 6 The RRM2 protein in three groups cell(a,b,c) were detected by Western blot

2.7 細胞侵襲能力的比較

侵襲實驗結果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，Ishikawa/Negative-siRNA組與Ishikawa對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Ishikawa/RRM2-siRNA組與之差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，即RRM2-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后其穿膜細胞數(shù)明顯減少。見圖7。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是國內(nèi)外女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的生命健康，腫瘤細胞浸潤和遠處轉(zhuǎn)移是患者死亡的最主要原因。與腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移有著密切的關系生物大分子RRM2是目前腫瘤領域研究熱點與重點，隨著分子生物學技術的發(fā)展，希望通過阻斷RRM2的表達來抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展，提高腫瘤的治愈率和治療效果。RNA干擾是臨床上阻斷基因表達較好的技術之一。

圖7 轉(zhuǎn)染48 h后各組侵襲能力的比較

Fig 7 Ability of cells invasion was detected with transwell chamber model after cells(a,b,c three groups) transfected 48 h

RNAi 是通過內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA (dsRNA) 誘發(fā)的mRNA 水平上的基因沉默，具有高度特異性[6-10]。siRNA在哺乳動物細胞中可以誘導強有力的特異性RNAi作用，在細胞內(nèi)可產(chǎn)生小發(fā)夾RNA( short hairpin RNA，shRNA)，可延長沉默作用時間[11]，并且可以針對多個基因或基因家族的共有序列來抑制多個基因的表達。對腫瘤細胞關鍵性基因的mRNA進行干擾，可有效地抑制腫瘤生長。因此，本實驗以RRM2 為靶標，根據(jù)siRNA 的設計原則[12]，參考文獻[5]，在體外合成siRNA，探討siRNA 技術對子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa RRM2表達及細胞增殖、凋亡、生長能力和侵襲能力的影響，為siRNA 技術在基因治療中的進一步應用，提供重要的理論依據(jù)和實驗基礎。

首先，我們確認了Ishikawa/RRM2-siRNA轉(zhuǎn)染的效率。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的細胞綠色熒光。轉(zhuǎn)染后48 h Ishikawa/RRM2-siRNA組見有綠色熒光細胞，約占細胞總數(shù)的40 %，即轉(zhuǎn)染后48 h Ishikawa/RRM2-siRNA的轉(zhuǎn)染率約40%。流式細胞術分析顯示，轉(zhuǎn)染48 h后Ishikawa/RRM2-siRNA轉(zhuǎn)染率明顯增高，繼續(xù)延長轉(zhuǎn)染時間到72 h轉(zhuǎn)染率無明顯差異，故48 h是最佳的轉(zhuǎn)染時間。根據(jù)實驗結果選擇24、48、72 h為檢測各項指標的時間點較為合理，這與Cui等[13-14]報道的時間點一致。

RRM2-siRNA轉(zhuǎn)染成功，那么RRM2的表達是否有改變？本實驗用半定量q-PCR和Western blot分別檢測Ishikawa細胞RRM2在mRNA和蛋白水平上表達的變化。不同轉(zhuǎn)染時間比較顯示，RRM2無論在mRNA或蛋白水平上的表達，轉(zhuǎn)染24 h和48 h差異有統(tǒng)計學意義，而48 h和72 h差異則無統(tǒng)計學意義，說明轉(zhuǎn)染達到一定時間后，繼續(xù)增加轉(zhuǎn)染時間并不能增強干擾作用。與對照組及錯義序列組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA組能顯著地降低RRM2的mRNA及蛋白表達，即siRNA可特異性地抑制Ishikawa細胞RRM2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，提示本實驗設計的siRNA可成為干擾RRM2表達的有效工具，為以后應用于子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供了理論依據(jù)。

RRM2的mRNA及蛋白表達被抑制，那么細胞的生物學行為是否變化？本實驗應用流式細胞術分析各時間點細胞凋亡的情況以及細胞周期的改變，采用MTT法檢測Ishikawa細胞體外增殖情況，采用Transwell小室檢測Ishikawa細胞的體外侵襲能力。

轉(zhuǎn)染48 h后Ishikawa細胞周期分布顯示，Ishikawa/RRM2-siRNA細胞G1期的細胞比例由對照Ishikawa組的(51.08±0.67)%增至(81.35±0.47)%，與對照組、錯義序列組比較差異有統(tǒng)計學意義，而Ishikawa/RRM2-siRNA組S期和G2期(DNA合成期與DNA合成后期)細胞比例相對于另外兩組出現(xiàn)明顯的降低，說明了Ishikawa/RRM2-siRNA可將Ishikawa細胞阻斷于G1期，抑制了細胞的生長。MTT法檢測結果顯示，Ishikawa細胞體外增殖有時間上的差異，轉(zhuǎn)染24 h和48 h有明顯的差異，而48 h和72 h無明顯的差異。與對照組、錯義序列組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA增殖最緩慢，其轉(zhuǎn)染48 h的生長抑制率為62.78%，說明轉(zhuǎn)染RRM2-siRNA 48 h生長抑制達到高峰，繼續(xù)延長到72 h其抑制作用無明顯增強，而且有所恢復。以上結果表明，RRM2-siRNA在一定時間內(nèi)可有效地抑制Ishikawa細胞的生長、增殖作用，RRM2-siRNA抑制作用在轉(zhuǎn)染后48 h最強。以上這些結果起因于RRM2是DNA合成和修復的關鍵限速酶[1]，RRM2表達下降，細胞DNA合成水平下降，所以Ishikawa細胞被阻斷于G1期，不能進行有絲分裂。

細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染48 h后，Ishikawa細胞開始出現(xiàn)明顯的凋亡，當轉(zhuǎn)染時間延長到72 h后，凋亡細胞進一步地增多。與對照組及錯義序列組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA組凋亡率最高。以上結果表明，當轉(zhuǎn)染率增高時，凋亡細胞也相應的增加，并且隨著時間的推移凋亡越來越明顯。這可能與ds-siRNA的含量有關，轉(zhuǎn)染率越高，siRNA的含量越高，在一定時間內(nèi)沉默mRNA作用可能越強。RRM2表達水平降低所導致的Ishikawa 細胞凋亡與NF-κB活性降低有關。Duxbury等[5]以表達RRM2特異性siRNA(psiRRM2)的復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體構建了穩(wěn)定表達RRM2的PANC1、MIAPaCa2、BxPC3和Capan2細胞,結果顯示psiRRM轉(zhuǎn)染體NF-κB活性、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達及活性較psiControl 轉(zhuǎn)染體降低。這說明特異性siRNA通過降低RRM2表達破壞NF-κB信號通路。因NF-κB是抑制細胞凋亡的關鍵分子，所以它的活性降低導致腫瘤細胞的凋亡。

采用Transwell小室檢測Ishikawa細胞的體外侵襲能力實驗顯示，細胞轉(zhuǎn)染48 h后，與對照組及錯義序列組比較，Ishikawa/RRM2-siRNA組穿膜細胞數(shù)明顯減少，說明RRM2-siRNA能有效地降低Ishikawa細胞的侵襲能力。此現(xiàn)象的產(chǎn)生與MMP-9表達的降低有關。Vickers等[12，14]發(fā)現(xiàn)，psiRRM2可下調(diào)MMP-9的表達。基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)是細胞外基質(zhì)(ECM)降解的決定者，其中MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中分子質(zhì)量最大的酶，活化后可降解細胞基底膜屏障，促使腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。所以RRM2-siRNA導致Ishikawa細胞的侵襲能力的降低有可能是MMP-9表達降低所介導。此方法將來也可聯(lián)合化療藥物，能更有效地抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、侵蝕和轉(zhuǎn)移。

總之，RRM2的過度表達與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切，且能夠通過siRNA阻斷其表達達到抑制腫瘤的侵蝕、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的目的。

[1] HERRICK J，SCLAVI B.Ribonucleotide reductase and the regulation of DNA replication:an old alory and ancient heritage[J].Mol Microbiol，2007，63(1):22-34．

[2] CUI J Q，SHI Y F,ZHOU H J.The changes of gene expression profiles in hydatidiform mole and choriocarcinoma with hyperplasia of trophoblasts[J].Int J Gynecol Cancer，2004，14(5)：984-997．

[3] SACHSE C,ECHEVERRI C J.Oncology studies using siRNA libraries:the dawn of RNAi2based genomics[J].Oncogene,2004,23(51):8384-8391.

[4] TAKESHITA F,OCHIYA T.Therapeutic potential of RNA interference against cancer[J].Cancer Sci，2006，97(8):689-696．

[5] DUXBURY M S,WHANG E E.RRM2 induces NF-kB-dependent MMP-9 activation and enhances cellular invasiveness[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，354(1):190-196．

[6] 牛曉宇，彭芝蘭，王和.RNA干涉抑制宮頸癌CaSki細胞株HPV16 E6基因的研究[J].癌癥，2004，23(11)：1257-1262.

[7] YAMATO K,FEN J,KOBUCHI H,et al.Induction of cell death in human papillomavirus 18-positive cervical cancer cells by E6 siRNA[J].Cancer Gene Ther,2006,13(3):234-241．

[8] LIEBER M R,MA Y,PANNICKE U,et al.Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2003,4(9):712-720．

[9] VALERIE K,POVIRK L F.Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair[J].Oncogene,2003，22(37):5792-5812．

[10] GULLO C,AU M,FENG G,et al.The biology of Ku and its potential oncogenic role in cancer[J].Biochim Biophys Acta,2006,1765(2):223-234．

[11] CHEN S M,TAO Z Z,HUA Q Q,et al.Inhibition of human telomerase reverse t ranscriptase in hep-2 cells using short hairpin RNA expression vectors[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2006,132(2):200-205．

[12] VICKERS T A，KOO S，BENNETT C F，et al.Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H2 dependent antisense agent s.A comparative analysis[J].Biol Chem，2003，278(9):7108．

[13] CUI J Q,SHI Y F,ZHOU H J.Effect of antisense oligodeoxynucleotide of small subunit component of human ribonucleotide reductase on human choriocarcinoma cell lineinvitro[J].Chin J Obstet Gynecol，2004，39(7):465-468．

[14] DUXBURY M S,ITO H,BENOIT E，et al.Retrovirally mediated RNA interference targeting the M2 subunit of ribonucleotide reductase:a novel therapeutic strategy in pancreatic cancer[J].Surgery，2004，136(2):261-269．

Effect of siRNA inhibiting expression of RRM2 on Ishikawa cell proliferation

XUN Qing-ying1，WANG Ling-ling2，ZHOU Huai-jun2

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，NanjingDrumTowerHospital，NanjingUniversityMedicalSchool，Nanjing210008，China)

Objective: To observe the influence of siRNA on Ishikawa cell proliferation and invasion using small interfering RNA(siRNA) to knockdown RRM2 expression in endometrial cancer cell line Ishikawa.Methods:siRNA targeting RRM2 gene was designed and prepared to form ds-siRNA，then ds-siRNA was transfected into Ishikawa cells with Lipofectamine2000TM. The result of transfection was evaluated by fluorescence microscope. The transfection efficiency，apoptotic rate and cell cycle were measured by flow cytometry. The proliferation ability of Ishikawa cells was detected by MTT colorimetry. The expression of RRM2 on mRNA and protein level was analyzed by q-PCR and Western blotting respectively. The ability of cells invasion was detected with transwell chamber model.Results:The siRNA targeting human RRM2 gene effectively inhibited the proliferation and invasion of Ishikawa cells，induced cell apoptosis，increased cell counts in phase G1and decreased in S and G2phase，and decreased the expression of RRM2 on both mRNA and protein level. But these effects did not appear in scrambled siRNA (Ishikawa/Negative-siRNA) control group.Conclusion:RRM2 expression is reduced by siRNA targeting human RRM2 gene，which results the inhibition of Ishikawa cells proliferation and invasion，thus apoptosis and growth retardation are inducedinvitro．

siRNA; RRM2 gene; endometrial cancer; Ishikawa cell

2015-09-10

2015-10-10

江蘇省自然科學基金項目(BK20151096);江蘇省人事廳六大人才高峰項目(WSW-021);南京市衛(wèi)生局重點項目(ZKX09023);南京市衛(wèi)生局青年人才培養(yǎng)工程項目(QRX11019)

尋慶英(1966-)，女，山東金鄉(xiāng)人，講師，在讀博士研究生。E-mail:xqyzhou@126.com

周懷君 E-mail:zhouhj2007@126.com

尋慶英，王玲玲，周懷君.siRNA抑制RRM2表達對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖影響的研究[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2015，34(6)：890-896.

R730.54; R737.33

A

1671-6264(2015)06-0890-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．007