IgA腎病腎小管間質(zhì)中淋巴細(xì)胞亞群分布及其臨床意義探討

弓玉祥，丁麗紅，楊旻宇，劉必成，倪海鋒

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腎臟病研究所，江蘇 南京 210009)

·論 著·

IgA腎病腎小管間質(zhì)中淋巴細(xì)胞亞群分布及其臨床意義探討

弓玉祥，丁麗紅，楊旻宇，劉必成，倪海鋒

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腎臟病研究所，江蘇 南京 210009)

目的：探討IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)腎小管間質(zhì)中淋巴細(xì)胞亞群分布與臨床腎功能的關(guān)系及其意義。方法：對48例IgAN患者穿刺腎組織石蠟切片行Masson三色染色，按牛津分類將48例IgAN患者分為T0、T1和T2組，用CD4、CD8和CD20一抗行免疫組化染色，分別標(biāo)記T淋巴細(xì)胞亞型(CD4、CD8)和B淋巴細(xì)胞(CD20)。采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析免疫組化結(jié)果，結(jié)合相關(guān)病理參數(shù)(腎小球硬化、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化程度)及臨床指標(biāo)，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：CD4+、CD8+、CD20+的細(xì)胞數(shù)量在不同纖維化組別間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD4+、CD8+、CD20+的細(xì)胞數(shù)量與不同臨床、病理指標(biāo)呈正相關(guān)。結(jié)論：間質(zhì)中浸潤淋巴細(xì)胞的不同數(shù)量和類型影響IgAN臨床特征及腎臟纖維化的進(jìn)展。

IgA腎??； 腎小管間質(zhì)； 淋巴細(xì)胞； 腎功能

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是世界范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球疾病，15%～40%的患者呈進(jìn)行性發(fā)展，在發(fā)病10～20年后進(jìn)展為終末期腎病(end stage of renal disease，ESRD)。IgAN與其他類型的腎臟疾病一樣，腎小管間質(zhì)炎癥及纖維化是疾病發(fā)展至ESRD的共同途徑，是決定腎臟疾病預(yù)后的主要因素。然而，腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化的機(jī)制尚不明確，所以有必要揭示腎組織炎癥細(xì)胞浸潤狀況以及與纖維化程度、臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系。為此，我們研究了IgAN不同程度的間質(zhì)炎癥反應(yīng)，觀察了腎小管間質(zhì)中淋巴細(xì)胞在腎臟纖維化不同階段的亞群分布及數(shù)量，并初步探討了其相關(guān)關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院2010年1月至2012年10月的48例腎活檢患者，入選病例的標(biāo)準(zhǔn)[1]為：(1) 確診為原發(fā)性IgAN患者；(2) 年齡、性別不限；(3) 有完整的臨床觀察指標(biāo)與病理觀察指標(biāo)；(4)腎活檢之前未接受激素和免疫抑制劑治療；(5) 無其它腎小球疾病或腎小管間質(zhì)疾病，無其它繼發(fā)性腎損害，如糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼、過敏性紫癜、乙型肝炎、肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等全身性疾??；(6)腎穿刺標(biāo)本所得腎小球數(shù)大于5個。其中男22例，女26例；年齡20～44歲，平均32歲。血肌酐濃度(179.56±72.60) μmol·L-1，尿N-乙酰-β-D-葡萄糖(NAG) (24.98±19.71)U·L-1，24 h尿蛋白(2.0±1.75)g·L-1。牛津分類病理特征: 小管萎縮和纖維化T0 32例，T1 9例，T2 7例。

1.2 主要試劑及耗材

CD4、CD8、CD20一抗購自北京中山生物技術(shù)公司，免疫組化試劑盒KIT 9921購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1常規(guī)染色方法 所有腎活檢組織均行石蠟包埋，普通染色切片厚度2 μm，行Masson染色。

1.3.2免疫組化方法 免疫組化切片厚度3 μm，免疫組化步驟按說明書進(jìn)行，以PBS 代替一抗作陰性對照。采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)，對采集的圖像進(jìn)行分析。采用雙盲法對間質(zhì)中浸潤的炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)：每張切片隨機(jī)選擇20 個不含腎小球的高倍視野，計(jì)數(shù)腎間質(zhì)中浸潤的淋巴細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以在高倍顯微鏡下炎癥細(xì)胞數(shù)×400 表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同纖維化組間臨床特征比較

根據(jù)牛津分類腎小管纖維化的程度，將IgAN患者分為3組，即T0組(腎小管間質(zhì)纖維化的程度<25%)、T1組(25%≤腎小管纖維化的程度≤50%)和T2組(腎小管纖維化的程度>50%)。3組患者年齡和性別間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)展，血肌酐、尿NAG、24 h蛋白尿量有明顯升高(表1)。

表1 不同纖維化組IgAN患者的臨床特征

Tab 1 Clinical characteristics in different groups of IgAN patients

與T0組相比，aP<0.05; 與T1組相比，bP<0.05

2.2 腎臟間質(zhì)病變及淋巴細(xì)胞浸潤情況

用CD4、CD8和CD20一抗行免疫組化染色結(jié)果顯示，腎小管間質(zhì)損傷程度不等：有的纖維化輕微、僅少量淋巴細(xì)胞浸潤；有的纖維化明顯伴多量淋巴細(xì)胞散在或密集浸潤。CD4、CD8和CD20陽性細(xì)胞主要浸潤于腎小管間質(zhì)中(圖1)。T1和T2組IgAN患者腎間質(zhì)中CD4+、CD8+和CD20+細(xì)胞數(shù)均明顯高于T0組(P<0.05)，T2組中CD4+、CD8+和CD20+細(xì)胞數(shù)量明顯高于T1組(P<0.05，表2)。

A.Masson染色顯示不同程度的小管間質(zhì)纖維化； B.CD4+T 細(xì)胞； C.CD8+T細(xì)胞； D.CD20+B細(xì)胞

圖1 不同淋巴細(xì)胞亞型在IgAN患者腎間質(zhì)中的浸潤情況

Fig 1 Lymphocytes and their subsets infiltration in renal tubulointerstitiumof IgA nephropathy

表2 淋巴細(xì)胞亞群在IgAN患者腎臟不同纖維化組的浸潤數(shù)量情況

Tab 2 The number of lymphocytes and their subsets infiltration in renal tubulointerstitium of IgAN

與T0組相比，aP<0.05; 與T1組相比，bP<0.05

2.3 腎臟間質(zhì)中不同淋巴細(xì)胞的浸潤數(shù)量與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

2.3.1腎小管間質(zhì)中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系 CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與腎活檢時血肌酐(r=0.879，P<0.05)、間質(zhì)纖維化(r=0.895，P<0.05)、24 h尿蛋白(r=0.736，P<0.05)及尿NAG(r=0.359，P<0.05)呈正相關(guān)(圖2)。

圖2 腎小管間質(zhì)中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

Fig 2 The relationship between the number of CD4+T cells in renal tubulointerstitium and clinical characteristics

2.3.2腎小管間質(zhì)中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系 CD8+T細(xì)胞的數(shù)量與腎活檢時血肌酐(r=0.874，P<0.05)、間質(zhì)纖維化(r=0.884，P<0.05)、24 h尿蛋白(r=0.836，P<0.05)和尿NAG(r=0.530，P<0.05)呈正相關(guān)(圖3)。

圖3 腎小管間質(zhì)中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

Fig 3 The relationship between the number of CD8+T cells in renal tubulointerstitium and clinical characteristics

2.3.3腎小管間質(zhì)中CD20+B細(xì)胞的數(shù)量與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系 CD20+B細(xì)胞的數(shù)量與腎活檢時血肌酐(r=0.903，P<0.05)、間質(zhì)纖維化(r=0.867，P<0.05)、24 h尿蛋白(r=0.935，P<0.05)、尿NAG(r=0.868，P<0.05)呈正相關(guān)(圖4)。

圖4 腎小管間質(zhì)中CD20+B細(xì)胞的數(shù)量與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

Fig 4 The relationship between the number of CD8+T cells in renal tubulointerstitium and clinical characteristics

3 討 論

腎小管間質(zhì)病變在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用越來越受到人們的重視，大量研究證明小管間質(zhì)受累程度是腎臟轉(zhuǎn)歸的重要影響因素。慢性間質(zhì)小管病變，如小管萎縮、間質(zhì)纖維化等特征性病理變化，已被公認(rèn)為預(yù)后不良的指標(biāo)，對疾病預(yù)后有重要意義[2-3]。國際IgAN協(xié)作組和腎臟病理學(xué)會提出的具有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的IgAN牛津病理分類，表明腎小管間質(zhì)纖維化有獨(dú)立的預(yù)后意義。炎癥反應(yīng)是腎小管間質(zhì)纖維(TIF)的始動環(huán)節(jié)之一并貫穿其始終。研究表明，嚴(yán)重的小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和患者的預(yù)后相關(guān)[4-5]。炎癥細(xì)胞中T細(xì)胞是不均一的細(xì)胞群體，根據(jù)細(xì)胞表面CD4與CD8分子表達(dá)情況的不同，分為CD4+與CD8+T 細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞識別由抗原遞呈細(xì)胞遞呈的MHC Ⅱ類分子復(fù)合物，輔佐B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，促進(jìn)B細(xì)胞親和力成熟和轉(zhuǎn)化，決定抗原特異性的免疫應(yīng)答[6]。CD8+T 細(xì)胞通常識別MHC Ⅰ類分子，與直接的細(xì)胞毒作用有關(guān)[7]。免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞參與細(xì)胞免疫，而B細(xì)胞參與體液免疫。B細(xì)胞具有抗原遞呈作用，協(xié)作T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞免疫。此外，B淋巴細(xì)胞具有潛在分泌炎癥因子的能力。炎癥因子的釋放也是導(dǎo)致慢性炎癥持續(xù)存在的原因之一。T細(xì)胞亞群在腎臟纖維化的進(jìn)展中意義未明，對于B細(xì)胞在腎臟中作用的研究相對比較少。

已有部分研究對腎間質(zhì)中浸潤的不同淋巴細(xì)胞進(jìn)行了觀察，Alexopoulos等[5，8]報道，CD4+細(xì)胞可能通過識別腎小管上皮細(xì)胞上的MHC Ⅱ類抗原釋放細(xì)胞因子IFN-γ、IL-3、TNF-β導(dǎo)致間質(zhì)纖維化，從而影響IgAN的進(jìn)展。近年來，Steinmetz等[9-11]發(fā)現(xiàn),在免疫介導(dǎo)的腎臟疾病中，如移植排斥反應(yīng)和性腎小球腎炎有B細(xì)胞存在。腎內(nèi)B細(xì)胞與腎功能惡化相關(guān)[9，12]，B細(xì)胞可能在不同的腎臟疾病中意義不同[13]。本研究結(jié)果顯示，IgAN患者的腎組織間質(zhì)中有不同炎癥細(xì)胞浸潤，如 T細(xì)胞及B細(xì)胞，且T細(xì)胞及亞型(CD4+和CD8+)和B細(xì)胞(CD20+)的數(shù)量與腎功能惡化密切相關(guān)。

綜上所述，IgAN患者腎小管間質(zhì)中可見不同的淋巴細(xì)胞亞群浸潤，并隨著間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，CD4+、CD8+、 CD20+等淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，CD4+、CD8+、CD20+的淋巴細(xì)胞數(shù)與間質(zhì)纖維化、腎功能、24 h尿蛋白和尿NAG含量呈正相關(guān),浸潤淋巴細(xì)胞的不同數(shù)量和類型影響了IgAN臨床特征和腎臟纖維化的進(jìn)展。

[1] CATTRAN D C,COPPO R,COOK H T,et al.The Oxford classification of IgA nephropathy:rationale,clinicopathological correlations,and classification[J].Kidney Int，2009,76：534-545．

[2] SMITH S W,SCHRIMPF C,PAREKH D J，et al.Kidney pericytes:a novel therapeutic target in interstitial fibrosis[J].Histol Histopathol，2012，27(12):1503-1514．

[3] FARRIS A B,COLVIN R B.Renal interstitial fibrosis:mechanisms and evaluation[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2012，21(3):289-300.

[4] MYLLYMAKI J M,HONKANEN T T,SYRJANEN J T,et al.Severity of tubulointerstitial inflammation and prognosis in immunoglobulin A nephropathy.Kidney Int,2007,71：343-348．

[5] ALEXOPOULOS E，SERON D，HARTLEY R B，et a1.The role of interstitial infiltrates in IgA nephropathy：a study with monoclonal antibodies.Nephrol Dial Transplant，1989，4：187-195．

[6] HAMEL K,DOODES P,CAO Y,et al.Suppression of proteoglycan-induced arthritis by anti-CD20 B cell depletion therapy is mediated by reduction in autoantibodies and CD4+T cell reactivity．J Immunol,2008,180(7):4994-5003.

[7] KURTULUS S,HILDEMAN D.Assessment of CD4(+) and CD8 (+) T cell responses using MHC class I and II tetramers.Methods Mol Biol,2013,979：71-79．

[8] STEPHEN R H，KITCHING A,PETER G T.Thl and Th2 T helper cell subsets affect patterns of injury and outcomes in glomerulonephritis[J].Kidney Int，1999，55：1198-1216．

[9] STEINMETZ O M,VELDEN J,KNEISSLER U,et al.Analysis and classification of B-cell infiltrates in lupus and ANCA-associated nephritis.Kidney Int,2008,4(74):448-457.

[10] COHEN C D,CALVARESI N,ARMELLONI S,et al.CD20-positive infiltrates in human membranous glomerulonephritis.J Nephrol,2005，18:328-333．

[11] MENGEL M,GWINNER W,SCHWARZ A,et al.Infiltrates in protocol biopsies from renal allografts.Am J Transplant,2007,7:356-365．

[12] HIPPEN B E,DeMATTOS A,COOK W J,et al.Association of CD20+infiltrates with poorer clinical outcomes in acute cellular rejection of renal allografts.Am J Transplant,2005，5:2248-2252．

[13] 王惠，許旌，張洪.2型糖尿病患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的變化及其臨床意義[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2010，38(2):137-140．

The distribution and clinical significance of lymphocytes and their subsets in renal tubulointerstitium in IgA nephropathy

GONG Yu-xiang，DING Li-hong，YANG Min-yu，LIU Bi-cheng,NI Hai-feng

(InstituteofNephrology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity,Nanjing210009，China)

Objective：To investigate the distribution and clinical significance of lymphocytes and their subsets in renal tubulointerstitium of IgA nephropathy (IgA nephropathy，IgAN).Methods：We stained paraffin sections of 48 cases of IgAN patients for Masson. According to Oxford classification，48 cases of IgAN patients were divided into 3 groups: T0，T1 and T2. CD4，CD8 and CD20 primary antibodies were immunohistochemically stained，and marked as T lymphocyte subsets(CD4+，CD8+)，B lymphocytes(CD20+)，respectively. Immunohistochemistry results were analyzed by Image-Pro Plus image system，combined with the related pathological parameters(glomerulosclerosis，tubular atrophy，interstitial fibrosis) and clinical index. We also used SPSS 13 statistical software for statistical analysis.Results：There was a significant difference between the quantity of CD4+，CD8+，CD20+cells between different fibrosis groups，P<0.05. The number of cells of CD4+，CD8+and CD20+was positively correlated with different clinical and pathological indexes.Conclusion：The number and type of infiltrating lymphocytes in renal tubular interstitium influence IgAN clinical features and the progress of renal fibrosis．

IgA nephropathy; renal interstitial; lymphocyte; renal function

2015-03-27

2015-08-17

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81400700)

弓玉祥(1966-)，男，江蘇張家港人，主管技師。E-mail:nj_gyx@163.com

倪海鋒 E-mail:nihaifeng1979@163.com

弓玉祥，丁麗紅，楊旻宇，等.IgA腎病腎小管間質(zhì)中淋巴細(xì)胞亞群分布及其臨床意義探討[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(6)：876-880.

R692.6

A

1671-6264(2015)06-0876-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．004