瘦素對IL-1β誘導(dǎo)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞MMP-13 mRNA表達的影響

顧海倫，劉亞莉，王維，丁立峰，劉莉

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 骨外科，遼寧 沈陽 110004； 2.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院衛(wèi)生檢驗教研室，遼寧 沈陽 110010； 3.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

·論 著·

瘦素對IL-1β誘導(dǎo)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞MMP-13 mRNA表達的影響

顧海倫1，劉亞莉2，王維1，丁立峰1，劉莉3

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 骨外科，遼寧 沈陽 110004； 2.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院衛(wèi)生檢驗教研室，遼寧 沈陽 110010； 3.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

目的：探討瘦素對IL-1β誘導(dǎo)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-13 (MMP-13)mRNA表達的影響及其機制。方法：體外培養(yǎng)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞，取第3代細胞采用免疫細胞化學(xué)方法及甲苯胺藍染色法鑒定 Ⅱ 型膠原及蛋白多糖表達；MTT法檢測不同質(zhì)量濃度瘦素環(huán)境下正常及IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞的增殖活力；實時定量PCR法檢測不同質(zhì)量濃度瘦素處理后IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞MMP-13 mRNA的表達，ELISA法檢測培養(yǎng)基上清腫瘤壞死因子α(TNFα)的水平；通過小RNA干擾(siRNA)抑制瘦素長型受體(OB-Rb)表達，觀察瘦素對MMP-13 mRNA表達的影響。結(jié)果：所有細胞均能分泌 Ⅱ 型膠原及蛋白多糖。MTT結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度瘦素對細胞增殖無明顯影響，瘦素質(zhì)量濃度大于等于10 ng·ml-1后可顯著促進細胞增殖；而10 ng·ml-1的 IL-1β可顯著抑制細胞增殖，同時給予100 ng·ml-1及1 μg·ml-1瘦素則可進一步抑制細胞增殖，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實時定量PCR結(jié)果顯示，IL-1β可增加軟骨細胞MMP-13 mRNA表達及TNFα分泌，而加入瘦素(100 ng·ml-1)后可進一步刺激MMP-13 mRNA的表達及TNFα的分泌，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染OB-Rb siRNA的軟骨細胞OB-Rb mRNA的表達顯著下降(P<0.05)，MMP-13 mRNA的表達則不受影響；IL-1β處理對轉(zhuǎn)染組OB-Rb的 mRNA表達無明顯影響，但可顯著誘導(dǎo)MMP-13 mRNA的表達增加(P<0.05)，進一步加入瘦素后，OB-Rb mRNA的表達有所增加，但表達量遠遠低于siRNA未處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MMP-13 mRNA的表達則未見增加。結(jié)論：一定濃度的瘦素可通過與OB-Rb結(jié)合促進IL-1β誘導(dǎo)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞MMP-13 mRNA表達，具有降解軟骨作用。

瘦素； 骨性關(guān)節(jié)炎； 軟骨細胞； 基質(zhì)金屬蛋白酶-13； 瘦素長型受體； 大鼠

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的進行性疼痛、僵硬、功能障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。目前研究發(fā)現(xiàn)，在OA患者的關(guān)節(jié)滑液中可檢測到瘦素(leptin)，且嚴重OA患者關(guān)節(jié)滑液中的瘦素水平更高[1-3]。許多學(xué)者[4-5]在對OA損害軟骨和正常軟骨的檢測中發(fā)現(xiàn)，其瘦素及其受體的mRNA和蛋白表達水平與軟骨損害程度相關(guān)，損害越重，表達越高。以上研究均表明，瘦素在OA的病理過程中發(fā)揮重要的作用，但關(guān)于瘦素對OA的確切作用機制目前還不十分清楚。因此，本研究擬通過體外培養(yǎng)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞，并加入白介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)模擬OA時軟骨細胞的環(huán)境，檢測不同質(zhì)量濃度瘦素對軟骨細胞活性、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)mRNA表達及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFα)分泌的影響；并通過小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)抑制瘦素長型受體(long form leptin receptor，OB-Rb)表達來探討瘦素對IL-1β誘導(dǎo)OA軟骨細胞的效應(yīng)及作用機制，為闡明OA的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離及培養(yǎng)

雄性Wistar大鼠(SPF級)5只，體質(zhì)量180～200 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。乙醚麻醉后，全部頸椎脫臼處死，體積分數(shù)75%乙醇浸泡，無菌環(huán)境中取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，削取軟骨片，剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm，PBS清洗，800 r·min-1離心5 min后加入0.25%的胰酶，37℃消化1 h，800 r·min-1離心5 min，棄上清，加入含 5% FBS的0.04%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴消化過夜；200 目篩網(wǎng)過濾，800 轉(zhuǎn)離心5 min，棄上清，PBS清洗，加入含 10%FBS的 DMEM-F12培養(yǎng)基，制成單細胞懸液，按(1～2)×105ml-1密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h更換培養(yǎng)液。所有檢測均在細胞第3代進行。

1.2 軟骨細胞表型鑒定

細胞爬片達50%～60%，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min后分別進行細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達的檢測。

1.2.1Ⅱ型膠原表達 3% H2O2孵育10 min，山羊血清室溫孵育15 min，一抗(1∶100稀釋)4℃過夜，生物素標記二抗室溫孵育15 min，辣根酶標記鏈酶卵白素工作液室溫孵育15 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。梯度酒精脫水，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.2蛋白多糖 1%甲苯胺藍染色30 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.3 MTT法檢測瘦素對軟骨細胞增殖活力的影響

軟骨細胞接種于96孔板，每孔100 μl(104個細胞)。細胞分組：調(diào)零組、對照組、瘦素處理組(瘦素質(zhì)量濃度10 pg·ml-1、100 pg·ml-1、1 ng·ml-1、10 ng·ml-1、100 ng·ml-1、1 μg·ml-1)、IL-1β組(10 ng·ml-1)、IL-1β+瘦素處理組(瘦素質(zhì)量濃度10 pg·ml-1、100 pg·ml-1、1 ng·ml-1、10 ng·ml-1、100 ng·ml-1、1 μg·ml-1)，每組設(shè)3個復(fù)孔。37℃、體積分數(shù)5% CO2條件下孵育24 h，各孔吸棄培養(yǎng)基，加入180 μl含0.5%FBS DMEM-F12培養(yǎng)基，再加入20 μl MTT溶液 (5 mg·ml-1)繼續(xù)孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。

1.4 細胞處理

軟骨細胞接種于6孔板中至80%～90%融合后，換用0.5% FBS的培養(yǎng)基，10 ng·ml-1IL-1β預(yù)先孵育1 h后進行瘦素處理，分為對照組、IL-1β組和IL-1β+瘦素處理組(瘦素質(zhì)量濃度100 pg·ml-1、100 ng·ml-1)，每組設(shè)3個復(fù)孔，24 h后收集細胞及培養(yǎng)基上清，-80℃保存待測。

1.5 OB-Rb siRNA處理軟骨細胞

OB-Rb siRNA及對照siRNA均購于美國Santa Cruz公司，轉(zhuǎn)染操作按照說明書進行，1.0 μg OB-Rb siRNA或者對照siRNA轉(zhuǎn)染1×106個細胞。轉(zhuǎn)染后，細胞再繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后加入10 ng·ml-1IL-1β孵育1 h，之后加入100 ng·ml-1瘦素，24 h后收集細胞。

1.6 MMP-13與OB-Rb mRNA表達檢測

采用real-time PCR測定mRNA表達：TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴增。β-actin作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。引物序列：β-actin(101 bp) F 5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′，R 5′-CTCAGTGAGGAT

CTTCATGAGGTAGT-3′; MMP-13(146 bp)F 5′-CCCCT

TCCCTATGGTGAT-3′，R 5′-AAGCCAAAGAAAGACTGC-3′；OB-Rb(173 bp)F 5′-GCACCATTTCCGCTTCAATA-3′，R 5′-CTCTTGCTCCTCACCTGGAC-3′。

1.7 培養(yǎng)基上清TNFα水平

采用ELISA法檢測，按照說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間兩兩比較采用單因素方差分析LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠軟骨細胞的分離與培養(yǎng)

大鼠原代軟骨細胞培養(yǎng)24 h后開始貼壁，培養(yǎng)1周左右細胞增殖加速，2周左右細胞可長成單層。傳代后細胞增殖速度明顯加快，細胞形態(tài)呈三角形、多角形、梭形。

2.2 軟骨細胞鑒定

Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，所有細胞胞漿均呈棕黃色，蘇木素復(fù)染后細胞核呈藍色，證明所培養(yǎng)細胞均能分泌Ⅱ型膠原,見圖1。甲苯胺藍染色后可見細胞呈藍紫色，見圖2。

圖1 Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色(×100)Fig 1 Type Ⅱ collagen staining by immunocytochemistry (×100)

圖2 蛋白多糖甲苯胺藍染色(×100)

Fig 2 Proteoglycans staining by Toluidine blue (×100)

2.3 MTT結(jié)果

相對低質(zhì)量濃度瘦素對細胞增殖無明顯影響，當瘦素質(zhì)量濃度大于10 ng·ml-1后可顯著促進細胞增殖；10 ng·ml-1的 IL-1β可顯著抑制細胞增殖，同時給予瘦素質(zhì)量濃度在100 ng·ml-1及1 μg·ml-1則可進一步抑制細胞增殖。見圖3。

與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01;與IL-1β比較，cP<0.05，dP<0.01。IL-1β質(zhì)量濃度為10 ng·ml-1

圖3 瘦素及IL-1β對大鼠第3代軟骨細胞增殖活力的影響

Fig 3 Effect of leptin and IL-1β on the viability of rat chondrocytes in generation 3

2.4 瘦素對IL-1β誘導(dǎo)大鼠OA軟骨細胞MMP-13 mRNA表達及分泌TNFα的影響

加入IL-1β后，軟骨細胞MMP-13 mRNA表達及TNFα分泌顯著增加，而加入瘦素(100 ng·ml-1)后可進一步刺激MMP-13 mRNA的表達及TNFα的分泌。見圖4。

2.5 瘦素對OB-Rb siRNA處理的軟骨細胞OB-Rb及MMP-13 mRNA表達的影響

轉(zhuǎn)染OB-Rb siRNA的軟骨細胞OB-Rb mRNA的表達顯著下降，抑制率達50%，與對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IL-1β處理對其OB-Rb的 mRNA表達無明顯影響，而進一步加入瘦素后，OB-Rb mRNA的表達雖有所增加，但表達量遠遠低于siRNA未處理組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染OB-Rb siRNA的軟骨細胞MMP-13 mRNA的表達不受影響，而加入IL-1β后可顯著增加MMP-13 mRNA的表達，進一步加入瘦素后MMP-13 mRNA的表達則不再增加。見圖5。

3 討 論

OA是中老年人常見的一種慢性疾病，是造成肌肉關(guān)節(jié)疼痛及失能的最常見原因，但其發(fā)病機制還不完全清楚。瘦素是一種主要由白色脂肪組織分泌的細胞因子，在調(diào)節(jié)能量代謝方面發(fā)揮重要作用。近年越來越多的研究顯示，瘦素在OA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究顯示，瘦素及其受體在軟骨細胞中表達[4，6]，并且瘦素可影響許多OA相關(guān)因子的表達和分泌等[4，7-8]。因此，探討瘦素在OA的發(fā)生發(fā)展中的作用機制對于闡明OA發(fā)病機制及防治OA具有重要意義。

與對照組比較，aP<0.01;與IL-1β比較，bP<0.05，cP<0.01

圖4 瘦素對IL-1β誘導(dǎo)大鼠OA軟骨細胞MMP-13 mRNA(A)表達及TNFα(B)分泌的影響

Fig 4 Effect of leptin on the expression of MMP-13 mRNA(A) and TNFα levels (B) in IL-1β-induced rat OA chondrocytes

本研究首先檢測了不同質(zhì)量濃度瘦素對軟骨細胞增殖活性的影響。關(guān)于瘦素對細胞活力的作用研究有不同的結(jié)果。有研究顯示，瘦素可促進軟骨細胞增殖[9]，但也有報道發(fā)現(xiàn)，瘦素對軟骨細胞的增殖具有抑制作用[4]。本研究結(jié)果顯示，對于正常大鼠軟骨細

與IL-1β比較，aP<0.01；與對照組比較，bP<0.01;與IL-1β+100ng·ml-1比較，cP<0.01，eP<0.05;與siRNA比較，dP<0.01

圖5 瘦素對OB-Rb siRNA處理的軟骨細胞OB-Rb(A)及MMP-13 mRNA(B)表達的影響

Fig 5 Effect of leptin on the expression of OB-Rb mRNA(A) and MMP-13 mRNA(B) in OB-Rb siRNA treated rat OA chondrocytes

胞，相對低質(zhì)量濃度的瘦素無明顯促增殖作用，當劑量達10 ng·ml-1時可顯著增加細胞活力，說明相對高質(zhì)量濃度的瘦素可促進正常軟骨細胞的增殖。為模擬OA時軟骨細胞的體內(nèi)環(huán)境，我們向培養(yǎng)基中加入IL-1β。IL-1β為多肽類物質(zhì)，在OA的病理過程中發(fā)揮主要作用[10]。目前IL-1β作為體外研究中OA的誘導(dǎo)劑已被廣泛地使用[11-12]。本研究采用10 ng·ml-1IL-1β，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)量濃度的IL-1β可顯著抑制細胞增殖。另外，當IL-1β與低質(zhì)量濃度瘦素共孵育時對細胞的抑制作用與未加瘦素時沒有差異，但與高質(zhì)量濃度瘦素共孵育時，則可進一步地抑制細胞增殖，提示正常與OA時的軟骨細胞對瘦素的反應(yīng)存在差別。諸多研究結(jié)果存在差異的原因可能是細胞的來源不同以及對細胞的處理方法不同。根據(jù)本研究MTT的結(jié)果，我們在之后的實驗中選擇了對OA軟骨細胞增殖無作用的瘦素質(zhì)量濃度(100pg·ml-1)和有作用的瘦素質(zhì)量濃度(100ng·ml-1)作為代表來處理細胞，探討瘦素對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠OA軟骨細胞的作用機制。

軟骨細胞是軟骨中唯一的細胞成分，它合成和分泌的Ⅱ型膠原及蛋白多糖構(gòu)成細胞外基質(zhì)，在維持軟骨功能方面具有重要作用。MMP-13是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員，主要降解Ⅱ型膠原[13]，在OA軟骨破壞過程中的作用尤為重要。TNFα是一種多功能的炎癥細胞因子，對關(guān)節(jié)軟骨具有一定的破壞作用。有研究顯示，膝關(guān)節(jié)術(shù)后關(guān)節(jié)液中的TNFα水平與康復(fù)治療效果呈負相關(guān)[14]。瘦素可增加軟骨細胞MMP-1，MMP-3、 MMP-9 及 MMP-13的分泌，采用RNA干擾下調(diào)瘦素的表達可抑制人OA關(guān)節(jié)軟骨MMP-13的表達[15-17]。但也有報道顯示，瘦素可增加軟骨細胞增殖及蛋白多糖和膠原的合成[18]，提示瘦素可能也具有合成效應(yīng)，或者瘦素的分解效應(yīng)啟動了代償性的合成反應(yīng)，尤其在OA的早期[19]。本研究中加入IL-1β后軟骨細胞MMP-13 mRNA表達及TNFα分泌顯著增加，而加入瘦素100 pg·ml-1時，MMP-13 mRNA的表達及TNFα分泌不受影響，但瘦素質(zhì)量濃度在100 ng·ml-1則可進一步刺激MMP-13 mRNA的表達及TNFα的分泌，表明OA時MMP-13在軟骨細胞中高表達，而低濃度瘦素對OA軟骨細胞無作用，原因可能是OA時軟骨細胞所處的環(huán)境中瘦素質(zhì)量濃度已經(jīng)很高，再加入低質(zhì)量濃度的瘦素對其影響甚小。相反，高質(zhì)量濃度的瘦素可以誘導(dǎo)OA軟骨細胞MMP-13的表達，提示100 ng·ml-1的瘦素對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞具有促進基質(zhì)降解作用。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素發(fā)揮細胞作用主要是通過與長型或短型瘦素受體結(jié)合[4，20]，激活STAT、MAPK、NF-κB[15，21]等一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而進行的。在本研究中我們通過RNA干擾方法抑制OB-Rb mRNA的表達，再檢測瘦素對IL-1β誘導(dǎo)MMP-13表達的影響，探討在OA軟骨細胞中瘦素是否可通過與OB-Rb結(jié)合發(fā)揮對MMP-13的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，OB-Rb被抑制后，IL-1β仍可誘導(dǎo)MMP-13 mRNA表達的增加，但再加入瘦素后MMP-13 mRNA 表達并未進一步的增加，說明在軟骨細胞中MMP-13的增加至少部分通過瘦素與OB-Rb結(jié)合，進而激活瘦素相關(guān)信號通路來實現(xiàn)的，但其中涉及的具體信號通路以及是否瘦素還可與其他瘦素受體結(jié)合發(fā)揮作用還須進一步研究。

綜上所述，MMP-13在OA的發(fā)生發(fā)展中的作用非常重要，而瘦素對軟骨細胞的的效應(yīng)及對MMP-13的影響是多方面的，軟骨細胞的來源、種屬、瘦素的質(zhì)量濃度以及OA的嚴重程度均可產(chǎn)生不同的作用。因此，深入探討瘦素對MMP-13的影響及機制對闡明OA的發(fā)病機制及防治OA具有重要的意義。

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Effect of leptin on the expression of MMP-13 mRNA in IL-1β-induced rat osteoarthritis articular chondrocytes

GU Hai-lun1，LIU Ya-li2，WANG Wei1，DING Li-feng1，LIU Li3

(1.DepartmentofOrthopaedics，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110004,China;2.DepartmentofHealthInspection，LiaoningMedicineVocationalCollege，Shenyang110010，China;3.DepartmentofNutritionandFoodHygiene，SchoolofPublicHealth，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122，China)

Objective: To determine the effect and mechanism of leptin on the expression of matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) mRNA in IL-1β-induced rat osteoarthritis articular chondrocytes.Methods:Rat articular chondrocytes in generation 3 were identified by immunocytochemistry and toluidine blue staining. Chondrocytes were incubated with leptin in the absence/presence of IL-1β. Cell viability was evaluated using the MTT assay. The expression of MMP-13 mRNA in chondrocytes and TNFα levels in culture supernatants were measured by real-time RT-PCR and ELISA，respectively. In addition，long-form leptin receptor (OB-Rb) siRNA was used to block OB-Rb expression and the effect of leptin on MMP-13 expression was detected.Results:All cultured chondrocytes expressed type 2 collagen and proteoglycan. MTT assay showed that leptin at low concentration had no effect on cell viability，but leptin at high concentration (≥10 ng·ml-1) could significantly promote cell proliferation. Viability of cells exposed to IL-1β (10 ng·ml-1) was significantly impaired，and it was further inhibited in the presence of leptin at 100 ng·ml-1and 1 μg·ml-1(P<0.05). The expression of MMP-13 mRNA and levels of TNF-α were significantly upregulated in the presence of IL-1β，and leptin (100 ng·ml-1) cotreatment could further stimulate MMP-13 mRNA expression and TNF-α level (P<0.05). The expression of OB-Rb mRNA was significantly inhibited，but MMP-13 expression was not affected in those chondrocytes transfected by OB-Rb siRNA. IL-1β treatment could significantly increase MMP-13 expression，but not OB-Rb mRNA in the OB-Rb knock-down cells (P<0.05). The expression of OB-Rb mRNA in IL-1β-treated OB-Rb siRNA cells was dramatically lower than that of untransfected cells (P<0.05) after further addition of leptin，while MMP-13 expression was not affected.Conclusion:Leptin could stimulate MMP-13 expression via OB-Rb in IL-1β-induced rat osteoarthritis articular chondrocytes，which demonstrated that leptin might play an important role in cartilage degradation．

leptin; osteoarthritis; chondrocyte; matrix metalloproteinase 13; long-form leptin receptor; rats

2015-03-20

2015-08-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(81372971)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(201202267)

顧海倫(1972-)，男，遼寧沈陽人，副教授，醫(yī)學(xué)博士。E-mail:guhailun_@163.com

顧海倫，劉亞莉，王維，等. 瘦素對IL-1β誘導(dǎo)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞MMP-13 mRNA表達的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(6)：870-875.

R-332; R684.3

A

1671-6264(2015)06-0870-06

10.3969/j.issn.1671-6264. 2015. 06．003