羊用布魯菌病疫苗研究進(jìn)展

付湘云，馬小菁，易新萍，葉　鋒，谷文喜，鐘　旗＊（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊83005；.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000）

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羊用布魯菌病疫苗研究進(jìn)展

付湘云1，2，馬小菁2，易新萍2，葉鋒2，谷文喜2，鐘旗2＊
（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000）

摘 要：布魯菌病是重要的人獸共患病，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展和人類(lèi)健康威脅嚴(yán)重。疫苗免疫仍是目前預(yù)防和控制動(dòng)物布魯菌病的措施之一，用于羊布魯菌病防控有多種疫苗，如S19、RB51、Rev.1等，每種疫苗均各有利弊?，F(xiàn)今，眾多研究者也通過(guò)基因工程等技術(shù)積極研究DNA疫苗、基因缺失疫苗、亞單位疫苗等。論文就羊用布魯菌病疫苗的應(yīng)用及新型疫苗的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為羊布魯菌病的預(yù)防提供參考。

關(guān)鍵詞：羊；布魯菌??；疫苗；預(yù)防；家畜

布魯菌?。˙rucellosis）是由布魯菌（Brucella）引起的一種人畜共患的傳染性疾病。布魯菌屬細(xì)菌大多數(shù)種型對(duì)人畜有致病性，對(duì)人畜皆有致病作用的是羊種布魯菌（B.melitensis）、牛種布魯菌（B.abortus）、豬種布魯菌（B.suis）和犬種布魯菌（B.canis），對(duì)畜有致病而對(duì)人無(wú)致病作用的是綿羊附睪種布魯菌（B. ovis），對(duì)人畜皆無(wú)致病的是沙林鼠布魯菌（B.neotomae）［1-2］。其中羊種布魯菌對(duì)人有較強(qiáng)的致病力，由其引起的人間布魯菌病在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有流行，如地中海地區(qū)、伊朗、俄國(guó)、蒙古國(guó)和中國(guó)北部［3］。近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，布魯菌病疫情在人間和畜間均呈逐年上升的趨勢(shì)，流行病學(xué)調(diào)查表明，90%以上的致病菌為羊種布魯菌3型［4-6］。對(duì)該病的防控仍以疫苗接種為主。不同種類(lèi)的布魯菌表現(xiàn)的致病力也不相同，這除了與菌體本身的成分相關(guān)外，還與宿主的狀態(tài)有關(guān)系。本文對(duì)羊布魯菌病疫苗研究進(jìn)展做一概述，以期為該病有效防控提供參考。

1　光滑型羊用布魯菌弱毒活疫苗

由于活疫苗能激起機(jī)體有效的細(xì)胞免疫，產(chǎn)生良好保護(hù)效果，目前仍被廣泛使用。

1.1羊種Rev.1疫苗

Rev.1株是由Elberg等［7-8］1957年從B.melitensis強(qiáng)毒株6056血清Ⅰ型中分離的一株羊種布魯菌，具有鏈霉素抗性。Rev.1減毒活疫苗對(duì)牛、羊布魯菌均具有免疫保護(hù)力，皮下免疫綿羊和山羊，可抗B. melitensis和B.ovis菌感染，保護(hù)力為80%～90%。但該菌株作為疫苗有一定毒性，且在適當(dāng)?shù)臈l件下毒力可完全恢復(fù)，孕羊不宜使用。作為羊種布魯菌病疫苗株的代表，Rev.1在歐洲大部分國(guó)家和亞洲部分國(guó)家被廣泛用于綿羊、山羊布魯菌病的防控，且一直保持良好效果，我國(guó)并未引進(jìn)該疫苗。

1.2羊種M5疫苗

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所于1962年將B.melitensis強(qiáng)毒株M28傳代致弱為M5疫苗株。我國(guó)于1970年開(kāi)始大規(guī)模使用，廣泛用于羊的免疫，對(duì)當(dāng)時(shí)控制羊布魯菌病起到了良好作用。但M5疫苗菌株不穩(wěn)定，是我國(guó)目前使用的疫苗中毒力最強(qiáng)的，常出現(xiàn)從S型到R型的變異，菌落大小也不均勻。目前我國(guó)已基本停止了該疫苗的生產(chǎn)。

1.3豬種布魯菌疫苗S2

豬種S2疫苗株由中國(guó)獸藥監(jiān)察所1953年由進(jìn)口豬的流產(chǎn)胎兒中分離出來(lái)，在人工培養(yǎng)基上移植7年后變成弱毒株。20世紀(jì)70年代開(kāi)始將豬種布魯菌S2疫苗正式用于羊的免疫，20世紀(jì)80年代中期該疫苗被土耳其、法國(guó)、德國(guó)、西班牙等國(guó)家引進(jìn)并用于試驗(yàn)研究。作為弱毒活疫苗，S2具有使用范圍廣和使用方便的特點(diǎn)，毒力比S19弱，可供豬、牛、牦牛、山羊和綿羊等多種動(dòng)物皮下注射、肌肉注射、口服多種途徑接種。S2突出的優(yōu)點(diǎn)還在于通過(guò)口服方式免疫懷孕母畜不會(huì)引起流產(chǎn)，使用方便，對(duì)綿羊的保護(hù)率為80%；對(duì)山羊的保護(hù)率80.3%［9］。因此，該疫苗在我國(guó)有廣泛應(yīng)用，但該疫苗注射法不能用于孕畜及小尾

寒羊的免疫。

1.4牛種布魯菌疫苗S19

有研究從牛奶中分離到B.aborus菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室傳代自然減毒，成為一株毒力穩(wěn)定的弱毒疫苗S19。1940年后該疫苗逐漸在美國(guó)各地推廣使用。S19苗有產(chǎn)生免疫力保持時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)牛和綿羊免疫效果較好，免疫保護(hù)率達(dá)65%～75%。我國(guó)在20世紀(jì)60年代引進(jìn)過(guò)一株布魯菌疫苗，簡(jiǎn)稱A19。研究表明，A19與S19菌株序列上存在差異，即S19疫苗株缺失赤蘚醇代謝基因（Ery）的702堿基，而A19菌株則無(wú)此缺失［10］。S19疫苗仍為世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的布魯菌病參考疫苗，但本疫苗不能接種于孕羊。

以上4種光滑性弱毒活疫苗雖然具有較好的免疫效果，但也存在問(wèn)題。①接種疫苗后，個(gè)別家畜可出現(xiàn)流產(chǎn)、排菌現(xiàn)象。②某些疫苗不能用于孕畜，如S19、Rev.1。③接種疫苗后產(chǎn)生的血清學(xué)反應(yīng)與感染相似，造成診斷困難。因此，研制預(yù)防布魯菌病的有效疫苗，建立完善的區(qū)分布魯菌免疫與自然感染動(dòng)物的方法是普及免疫接種的研究方向。

2　粗糙型羊用布魯菌疫苗

2.1RB51疫苗株

RB51疫苗株最初由光滑型牛布魯菌2308株經(jīng)體外反復(fù)傳代，并經(jīng)利福平和青霉素的篩選獲得的穩(wěn)定的R型菌株。由于其免疫后動(dòng)物血清中不產(chǎn)生O-鏈抗體，因此可用血清學(xué)方法來(lái)鑒別診斷免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物。相對(duì)于45/20，RB51疫苗株相當(dāng)穩(wěn)定，對(duì)山羊有良好的免疫保護(hù)效果并不干擾診斷結(jié)果，目前在很多國(guó)家應(yīng)用［11］。由于知識(shí)產(chǎn)權(quán)受限和技術(shù)封鎖等方面原因，我國(guó)尚未引進(jìn)RB51疫苗株。

2.216M-△wboA疫苗株

wboA基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶是合成O-側(cè)鏈多糖的必需基因之一。利用wboA基因突變獲得源于羊種布魯菌強(qiáng)毒株16M的疫苗株，即粗糙型16M-△wboA疫苗株。該突變菌株具有卡那霉素抗性，插入了Tn5元件，不表達(dá)O-側(cè)鏈。因此，該疫苗免疫動(dòng)物后，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)檢測(cè)不到針對(duì)O-側(cè)鏈的抗體，從而可避免干擾血清學(xué)診斷。另外，該菌株不會(huì)引起懷孕母畜流產(chǎn)，但其疫苗保護(hù)效果有待進(jìn)一步的研究。

2.3羊種布魯菌H38滅活疫苗

1964年Renoux等將馬耳他布魯菌53H38號(hào)強(qiáng)毒菌株的培養(yǎng)液，經(jīng)福爾馬林滅活后與mayoline（一種輕質(zhì)石蠟油）及rlace A（一種經(jīng)特別處理過(guò)的甘露醇單油酸脂）混合攪拌制成的乳化佐劑苗。該佐劑H38疫苗屬于S型羊種布魯菌，在山羊和綿羊應(yīng)用中效果比S19疫苗好，且與ReV.1苗相近。該疫苗對(duì)動(dòng)物安全，不影響接種動(dòng)物以后的生長(zhǎng)和繁殖，但有局部副作用，可能引起注射部位化膿，同時(shí)血清學(xué)反應(yīng)也呈陽(yáng)性，干擾診斷。另外，在疫苗制備的滅活過(guò)程中抗原表位易丟失，用量大，無(wú)內(nèi)源性蛋白產(chǎn)生所以不能誘導(dǎo)CTL，這些缺點(diǎn)都限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。H38疫苗主要在法國(guó)應(yīng)用，其他國(guó)家鮮有應(yīng)用。

3　基因工程疫苗

20世紀(jì)70年代以來(lái)，迅速發(fā)展的重組DNA技術(shù)為疫苗的研究提供了新的手段。鑒于現(xiàn)有布魯菌病疫苗都不同程度的存在安全性差的問(wèn)題，而基因工程疫苗克服了傳統(tǒng)疫苗的易返祖、影響接種動(dòng)物等缺陷，其安全問(wèn)題比較容易控制和處理，因此基因工程疫苗如DNA疫苗、亞單位疫苗、基因缺失疫苗等成為研究熱點(diǎn)。

3.1亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗（subunit vaccine）又稱生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，是將保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，并以基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)或多肽制成疫苗。亞單位疫苗的有效性取決于目標(biāo)抗原，篩選最佳抗原是重組蛋白疫苗研究的基礎(chǔ)。研究表明，布魯菌外膜蛋白Omp16、Omp19、Omp28、Omp31可以誘導(dǎo)Th1型的細(xì)胞免疫反應(yīng)，且能夠?qū)π∈筇峁┡cS19和RB51疫苗相當(dāng)?shù)墓ザ颈Ｗo(hù)。另外，Omp31與氫氧化鋁或弗氏不完全佐劑聯(lián)合使用，也能對(duì)羊種布魯菌的攻毒提供較高的攻毒保護(hù)。如保護(hù)性抗原CobB、AsnC、胞質(zhì)蛋白SurA和DnaK、周質(zhì)蛋白Cu-Zn、核糖體蛋白L7/L12均能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)，且能夠?qū)π∈筇峁┡cS19疫苗相當(dāng)?shù)墓ザ颈Ｗo(hù)。

與傳統(tǒng)疫苗相比，亞單位疫苗抗原成分單一，可用血清學(xué)方法有效的鑒別，其抗原為蛋白質(zhì)，與其他新型疫苗相比不會(huì)發(fā)生可能出現(xiàn)的基因重組問(wèn)題，比較安全。但是亞單位疫苗在體內(nèi)不能復(fù)制，免疫原性不及常規(guī)疫苗，免疫效果在很大程度上還依賴于免疫佐劑和接種途徑，而且該類(lèi)疫苗在生產(chǎn)上工藝復(fù)雜，成本高，故直至目前仍未能普遍推廣。

3.2DNA疫苗

DNA疫苗指直接把含有目的抗原基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或注射到動(dòng)物細(xì)胞中，使之在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)出天然的抗原物質(zhì)，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）及Th1型免疫應(yīng)答。在布魯菌感染的小鼠模型中，許多抗原基因已經(jīng)被作為DNA疫苗進(jìn)行研制，如L7/L12核糖體蛋白、細(xì)胞周質(zhì)蛋白p39、Cu-Zn超氧化物歧化酶、熱休克蛋白GroEL、外膜蛋白

Omp31、Omp25等基因［12-15］。小鼠試驗(yàn)表明，這些蛋白都可以激活T細(xì)胞反應(yīng)，包括活化巨噬細(xì)胞和CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞，激活機(jī)體的免疫應(yīng)答系統(tǒng)而起到保護(hù)作用，有效的抵抗布魯菌的感染。研究報(bào)道，小鼠模型研究獲得有效的布魯菌DNA疫苗接種于較大動(dòng)物并非全部獲得與小鼠同樣的結(jié)果，提示相關(guān)DNA疫苗的研制尚需進(jìn)一步改進(jìn)。DNA疫苗的生物安全性問(wèn)題，如誘導(dǎo)免疫耐受和自身免疫疾病的產(chǎn)生、基因的穩(wěn)定性、抗性基因的轉(zhuǎn)移等仍需考慮和進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，因此這類(lèi)疫苗仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段。

3.3新型標(biāo)記疫苗

由于人工免疫和自然感染動(dòng)物所表現(xiàn)的臨床癥狀相似，很難鑒別是人工免疫還是自然感染動(dòng)物，給動(dòng)物的檢疫、運(yùn)輸、宰殺帶來(lái)困難。而分子標(biāo)記疫苗能解決這樣的問(wèn)題。在減毒活疫苗株的基礎(chǔ)上，對(duì)菌株進(jìn)行改造，缺失布魯菌的重要診斷抗原基因使疫苗株的毒力進(jìn)一步降低，然后根據(jù)兩者序列的差異，建立鑒別PCR的方法，以區(qū)分人工免疫和自然感染。

3.3.1Rev.1標(biāo)記疫苗 1998年，Tibor等用基因置換技術(shù)構(gòu)建了布魯菌工程苗，以抗卡那霉素基因置換羊種布魯菌疫苗基因Rev.1的p39胞質(zhì)結(jié)合蛋白，獲得Rev.1-△p39疫苗。布魯菌p39是一種很好的T細(xì)胞抗原，能誘發(fā)強(qiáng)烈的遲發(fā)性超敏反應(yīng)，并產(chǎn)生大量的INF-γ，純化的重組p39對(duì)于動(dòng)物布魯菌病的血清學(xué)診斷是一個(gè)優(yōu)良的抗原。Rev.1-△p39疫苗接種動(dòng)物后，動(dòng)物將不能對(duì)P39產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進(jìn)而判定動(dòng)物是否為自然菌株感染。

Grillo M J等［16-18］在Rev.1疫苗株的基礎(chǔ)上分別構(gòu)建了刪除bp26基因的CGV26菌株和刪除bp26與Omp31基因的CGV2631菌株。研究表明，CGV26與Rev.1的免疫保護(hù)力相當(dāng)，并且顯著高于CGV2631，該菌株免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體中不含有bp26蛋白的抗體，從而可以與自然感染相區(qū)分。

由于我國(guó)尚未引進(jìn)Rev.1疫苗株，因此國(guó)內(nèi)鮮有關(guān)于Rev.1相關(guān)標(biāo)記疫苗的報(bào)道。目前M5在國(guó)內(nèi)基本停產(chǎn)，Rev.1作為一株羊布魯菌疫苗株應(yīng)該可以作為一個(gè)很好的基礎(chǔ)菌株，通過(guò)缺失重要的抗原分子以期獲得毒力降低、能與自然感染想?yún)^(qū)別的良好新型標(biāo)記疫苗。

3.3.2M5-90標(biāo)記疫苗 由于M5疫苗株有可能引起孕畜流產(chǎn)、對(duì)接觸氣霧人員有較大不良反應(yīng)、連續(xù)通過(guò)豚鼠傳代后毒力有回升現(xiàn)象等缺點(diǎn)，哈爾濱獸醫(yī)研究所將M5在雞成纖維細(xì)胞中傳代90次培育而成M5-90。但培育出來(lái)的M5-90仍存在以下缺點(diǎn)：免疫懷孕動(dòng)物仍可能導(dǎo)致流產(chǎn)、用常規(guī)血清學(xué)方法檢測(cè)不能區(qū)分自然感染和疫苗感染，因而限制了該疫苗廣泛推廣應(yīng)用。有研究者［19］以M5-90疫苗株為親本株成功構(gòu)建了bp26基因缺失的M5-90疫苗株，該基因缺失菌株免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體中不含有bp26蛋白的抗體，從而可以與自然感染相區(qū)分。2010年，李臻等［20］通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建布魯菌M5-90疫苗株virB2基因缺失株，該缺失株在10代以內(nèi)未發(fā)生回復(fù)突變。這些標(biāo)記疫苗目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研制階段。

3.3.316M標(biāo)記疫苗 布魯菌PurE基因是嘌呤合成的必需基因，以羊種布魯菌16M為基礎(chǔ)，構(gòu)建了缺失PurE羊種布魯菌基因缺失突變活疫苗16M-△PurE，該菌株由于缺失PurE基因，造成16M布魯菌從頭合成次黃嘌呤障礙，使該疫苗在體內(nèi)體外都減毒，目前，16M-△PurE候選標(biāo)記疫苗在進(jìn)行保護(hù)性效力評(píng)估。

以上新型布魯菌標(biāo)記活疫苗作為當(dāng)今布魯菌病新型疫苗研究的重要領(lǐng)域，有其他疫苗無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，主要包括：①保留了原有減毒活的免疫保護(hù)效果；②能完全模擬天然細(xì)菌免疫，在宿主體內(nèi)持續(xù)存活，刺激機(jī)體產(chǎn)生全面而持久的免疫力（包括細(xì)胞免疫CM I和體液免疫HT）；③基因同源重組技術(shù)的應(yīng)用，解決了傳統(tǒng)減毒活疫苗存在的殘余毒力強(qiáng)的問(wèn)題，提高疫苗使用安全性；④解決了布魯菌病疫苗免疫與自然感染的血清學(xué)鑒別診斷問(wèn)題。但這些疫苗仍在試驗(yàn)階段，其臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步評(píng)估和完善。

4　展望

布魯菌病是一種全球性的人畜共患病疾病，帶菌的動(dòng)物是其他動(dòng)物和人類(lèi)布魯菌病的主要傳染源，疫苗免疫是預(yù)防和控制布魯菌病的有效途徑。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，我國(guó)近幾年畜間布魯菌流行種型主要以羊種布魯菌3型為主，而羊是羊種布魯菌3型的適宜宿主?？紤]到我國(guó)現(xiàn)階段羊的患病率高、養(yǎng)殖基數(shù)大等現(xiàn)狀，我國(guó)主要采取以疫苗接種為主和檢疫-撲殺為輔的布魯菌病防控策略?，F(xiàn)階段羊用疫苗主要有豬布魯菌疫苗株S2和羊布魯菌疫苗株M5（國(guó)內(nèi)目前沒(méi)有廠家生產(chǎn)）。雖然這兩種疫苗為有效地控制布魯菌病提供了重要保障，但同時(shí)也存在一定的缺陷，即疫苗缺乏鑒別診斷標(biāo)記，無(wú)法甄別接種動(dòng)物與自然患病動(dòng)物，造成布魯菌無(wú)法在畜群中根除，影響了布魯菌病的診斷、檢疫。因此，研發(fā)安全性高、保護(hù)性免疫活性好的新型標(biāo)記疫苗仍是當(dāng)今布魯菌病疫苗研究的熱點(diǎn)。

隨著現(xiàn)代細(xì)菌生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們己將羊種布魯菌的基因進(jìn)行了全部測(cè)序，對(duì)各種蛋白基因的結(jié)構(gòu)與功能、毒力基因與細(xì)菌感染和免疫的關(guān)系都

做了更深入的研究。與傳統(tǒng)疫苗相比，亞單位疫苗的抗原成分單一，可以用血清學(xué)方法鑒別，由于其抗原為蛋白質(zhì)，因此不會(huì)出現(xiàn)潛在的安全性問(wèn)題。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建基因缺失或基因獲得性多價(jià)疫苗成為布魯菌病新型疫苗研究的重點(diǎn)。但布魯菌病疫苗應(yīng)用的實(shí)踐證明，弱毒活疫苗是控制動(dòng)物布魯菌病的最有效方法。因此，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)現(xiàn)有活疫苗進(jìn)行遺傳改造，篩選保護(hù)力高的具有診斷標(biāo)記的弱毒疫苗的研究應(yīng)用前景十分可觀，該類(lèi)標(biāo)記弱毒活疫苗提升原有疫苗的功能，彌補(bǔ)了疫苗無(wú)法鑒別診斷的缺陷，縮短了疫苗上市生產(chǎn)應(yīng)用周期，將會(huì)對(duì)我國(guó)布魯菌病提供有效的預(yù)防。

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Advance in Brucellosis Vaccines in Sheep and Goats

FU Xiang-yun1，2，MA Xiao-jing2，YI Xin-ping2，YE Feng2，GU Wen-xi，ZHONG Qi2
（1.College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumuqi，Xinjiang，830052，China；2.Institute of Veterinary Research，Xinjiang Academy of Animal Science，Urumuqi，Xinjiang，830000，China）

Abstract：Brucellosis is a serious zoonosis with a worldwide impact，contributing to significant health and economic problems.It is caused by bacteria of the genus Brucella.Brucellosis remains of particular concern due to the transmission of this severe disease to humans，which it can occur through the consumption of unpasteurized dairy products.Vaccination is one of the most effective measures to control brucellosis.Up to now，there are several vaccines such as S19，Rev.1and RB51used in domestic and abroad，also serologic and molecular biology methods can not distinguish natural infection from vaccination.These drawbacks interfere epidemiological investigation and epidemic focus research.For the reason，the paper reviewed the application of research status of brucellosis vaccines used in sheep and goats.

Key words：sheep and goat；Brucellosis；vaccine；prevention；livestock

通訊作者

作者簡(jiǎn)介：付湘云（1989-），女，新疆昌吉人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究。＊

基金項(xiàng)目：自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（201311102）

收稿日期：2014-09-23

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.614

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0091-04