CpG ODN免疫佐劑效應(yīng)研究進(jìn)展

摘 要：人工合成的含非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸（CpG ODN）能夠與樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Toll樣受體9（TLR－9）結(jié)合，通過產(chǎn)生Th1型免疫反應(yīng)和分泌促炎因子來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，在機(jī)體抵抗病原入侵和抗腫瘤等方面起到免疫增強(qiáng)劑的作用。近年來，CpG ODN作為一種新型免疫佐劑受到了人們越來越多的關(guān)注。論文主要介紹了CpG ODN的種類及其結(jié)構(gòu)和功能特征、作用機(jī)制、對畜禽的免疫增強(qiáng)作用、安全性等方面的研究進(jìn)展，為CpG ODN作為疫苗佐劑的進(jìn)一步研究和在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用提供參考。

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007－5038（2015）10－0105－05

收稿日期：2015－04－19

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130522088JH，20140307008NY）

作者簡介：董 鵬（1990－），男，吉林通化人，碩士，主要從事動物病毒學(xué)研究。＊通訊作者

CpG寡核苷酸（oligodeoxynucleotides containing CpG motifs，CpG ODN）是人工合成的含非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸，直鏈型，長度通常為十幾至二十幾個(gè)堿基不等。CpG ODN能夠模擬細(xì)菌DNA的免疫刺激活性，作為一種病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMP）與動物機(jī)體許多免疫細(xì)胞中的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR）TLR－9結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答，有效增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性和促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌 ［1］，從而非特異性的增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，在機(jī)體抵抗病原入侵和抗腫瘤等方面起到免疫增強(qiáng)劑的作用。因此，CpG ODN可作為疫苗佐劑來提高疫苗的免疫效果，并且其突破了傳統(tǒng)佐劑主要是倉儲、緩釋的作用機(jī)理，具有很大的開發(fā)和應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，CpG ODN作為一種新型疫苗佐劑，既可以單獨(dú)使用也可與氫氧化鋁佐劑聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同作用，具有用量低、作用強(qiáng)、副作用小，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。目前CpG ODN作為乙型肝炎疫苗佐劑已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段 ［2］。而CpG ODN作為獸用疫苗佐劑的應(yīng)用，仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

1 CpG ODN的發(fā)現(xiàn)

機(jī)體的免疫功能可分為固有免疫和適應(yīng)性免疫兩部分。其中固有免疫是機(jī)體抵抗病原入侵的第一道防線，它包括皮膚、黏膜的天然屏障作用，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的吞噬功能和補(bǔ)體系統(tǒng)的功能等。除了這些，機(jī)體還能夠通過識別病原在進(jìn)化上相對保守的分子結(jié)構(gòu)即PAMP，產(chǎn)生某些具有免疫增效作用的細(xì)胞因子來提高自身對抗病原的能力。這就提示我們可以利用固有免疫的這一機(jī)制在人工主動免疫時(shí)有針對性的增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。識別病原相關(guān)分子模式的PRR，包括Toll樣受體、Nod樣受體、RIG－I樣受體等，其中Toll樣受體是人們廣泛研究的一類模式識別受體。Toll樣受體受到刺激以后所產(chǎn)生的固有免疫應(yīng)答主要表現(xiàn)為產(chǎn)生促炎因子、趨化因子、Ⅰ類干擾素和抗菌肽等 ［3］。

從20世紀(jì)80年代開始，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、病毒和無脊椎動物的DNA中，廣泛存在著非甲基化的CpG二核苷酸片段，這樣結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式，其配體是TLR－9，可以激活固有免疫系統(tǒng)。隨著人工合成寡聚脫氧核苷酸研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)CpG ODN能夠模擬天然CpG DNA的免疫刺激活性，在被樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞內(nèi)化之后，會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的晚期內(nèi)吞溶酶體區(qū)室中與TLR－9結(jié)合 ［4］，有效增強(qiáng)相應(yīng)細(xì)胞的活性和促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答 ［1］，在機(jī)體抵抗病原入侵和抗腫瘤等方面發(fā)揮免疫增強(qiáng)劑的作用。CpG ODN在功能上具有非特異性免疫增效作用，而本身作為人工合成的寡核苷酸又比較容易獲得，從而使其具備了成為一種可應(yīng)用的高效疫苗佐劑的潛力而受到人們的廣泛關(guān)注，是目前新型疫苗佐劑研發(fā)的一個(gè)重要方向。

2 CpG ODN的種類、結(jié)構(gòu)和功能特征

目前，根據(jù)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，CpG ODN可分為A、B、C、P四種類型。A型CpG也稱D型CpG，特點(diǎn)是在一個(gè)以CpG為核心的六核苷酸即CpG基序的兩側(cè)均有回文序列，且在3′和5′末端有poly G尾，其兩側(cè)poly G所屬核酸骨架進(jìn)行硫代修飾，中間的活性部分則不進(jìn)行硫代修飾。A型CpG的長度通常為20個(gè)～21個(gè)堿基，例如CpG2216的序列為5′－GGGGGACGATCGTCGGGGGG－3′。A 型CpG能夠刺激漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）成熟和分泌IFN－α，誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ并誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞，但不能活化B細(xì)胞 ［5］。

B型CpG也稱K型CpG，是在全硫代修飾的骨架中包含多個(gè)CpG基序，例如CpG2006的序列為5′－TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT－3′。硫代修飾的核酸相比于天然核酸提高了其抵抗核酸酶消化的能力，能夠大幅延長其在體內(nèi)的半衰期，有利于更好的發(fā)揮生物學(xué)作用，這也是人工合成的CpG ODN相比于天然CpG DNA的優(yōu)勢之一。B 型CpG不能誘導(dǎo)pDC產(chǎn)生IFN－α，但能觸發(fā)pDC產(chǎn)生共刺激信號分子和TNF－α，誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和IgM的產(chǎn)生，同時(shí)上調(diào)活化標(biāo)記、誘導(dǎo)B細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌IL－6 ［5］。

由于A型和B型CpG的結(jié)構(gòu)不同，使得它們在胞內(nèi)存在的形式不一樣，也就導(dǎo)致了不同的生物學(xué)活性。A型CpG由于poly G的存在會形成大分子聚合物，它與TLR－9所形成的復(fù)合物會在pDC的早期核內(nèi)體中存留較長時(shí)間。在早期核內(nèi)體中，A型CpG與MyD88／IRF－7復(fù)合物相互作用，觸發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng)，促使pDC產(chǎn)生IFN－α ［6］。B型CpG主要以單體形式存在，同樣情況下會迅速通過早期核內(nèi)體而進(jìn)入晚期核內(nèi)體，不能誘導(dǎo)pDC產(chǎn)生IFN－α。

C型CpG和B型CpG一樣，具有全硫代修飾骨架，同時(shí)又像A型CpG那樣在CpG基序兩側(cè)帶有回文序列，例如CpG2395的序列為5′－TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG－3′。此類CpG能夠刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IL－6和pDC分泌IFN－α ［7］。C型CpG存在于早期和晚期核內(nèi)體中，因此性能兼有A型和B型CpG的特點(diǎn)。

最近還發(fā)現(xiàn)了一種新類型的CpG，即P型CpG。P型CpG兩端包含較長的回文序列，使其能夠形成更高的有序結(jié)構(gòu)，例如，5′－TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG－3′。P型CpG能夠刺激pDC和B細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生相對于C 型CpG更高水平的IFN－α ［8］。

3 CpG ODN免疫佐劑效應(yīng)的作用機(jī)制

3．1 胞內(nèi)信號通路和對基因表達(dá)的影響

CpG ODN與TLR－9結(jié)合后所引發(fā)的信號級聯(lián)反應(yīng)能夠使調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)的基因活化。這一信號通路是通過刺激信號分子MyD88、IRAK和TRAF－6逐級實(shí)現(xiàn)的，在信號傳遞到TRAF－6之后，細(xì)胞會產(chǎn)生TAK1等各種蛋白激酶，并通過MAPK途徑活化轉(zhuǎn)錄因子NF－κB、AP－1和IRF－7，促進(jìn)促炎基因的表達(dá) ［9］。

研究表明，CpG ODN作用于機(jī)體的30min之內(nèi)便可以檢測到TNF、IL－1β和IL－1α的基因表達(dá)的變化，3h之后基因的活化達(dá)到第一個(gè)高峰，這期間有近1 000個(gè)基因表達(dá)上調(diào) ［10］。這些基因包括參與免疫反應(yīng)的功能型基因，如編碼IL－1α、IL－1β、TLR－9和TNF的基因；參與細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的基因，如編碼NFKB1A、MyD88、IRAK－M和A20的基因；參與細(xì)胞運(yùn)動的基因，如編碼BFL－1，NAP－1，NAK和EGFR的基因 ［11］?；虮磉_(dá)水平在3d之后下降一段時(shí)間，然后在第5天再次上升達(dá)到第二高峰?；蚧罨牡诙叻逯兄饕せ畹幕虬?xì)胞周期調(diào)控基因，如編碼PLK1、WEE1、CHK2 和TOPO2A的基因及DNA損傷修復(fù)基因，如編碼BRCA1、GADD4A、E2F4和RPA1的基因 ［11］。

3．2 對免疫細(xì)胞活性的影響

CpG ODN通過與TLR－9結(jié)合，直接激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。CpG ODN刺激pDC的特點(diǎn)是上調(diào)CD40、CD80、CD86和 MHC－Ⅱ類分子的表達(dá) ［12］，增加IL－1、IL－6、IL－12、IL－18和TNF－α的產(chǎn)量 ［9］，抵抗IL－4誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)pDC成熟，提高其處理和抗原遞呈的能力。與此同時(shí)，CpG ODN也能刺激pDC產(chǎn)生廣泛限制病毒和細(xì)菌生長的I型IFN ［13］。

CpG ODN刺激B細(xì)胞后會促使其產(chǎn)生IL－6、IL－12和結(jié)合于CXCR3的趨化因子IP－10、Mig和I －TAC，并分泌IgM ［14］。其中IL－6的表達(dá)也能夠促進(jìn)B細(xì)胞本身IgM的分泌。CpG ODN通過上調(diào)B細(xì)胞的Fc受體和共刺激分子包括MHC－Ⅱ類分子、CD40、CD80和CD86來激活B細(xì)胞 ［15］。隨后受到CpG刺激的B細(xì)胞增殖并分化為漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞。CpG ODN通過單獨(dú)激活TLR－9就足以促使記憶性B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而初始B細(xì)胞則需要BCR的共刺激作用 ［16］。值得注意的是，CpG ODN刺激CD5 ＋B細(xì)胞分泌大量IL－10，這抑制了樹突狀細(xì)胞分泌IL－12，從而抑制了Th1型免疫反應(yīng) ［17］，使受CpG ODN刺激后的機(jī)體不至于反應(yīng)得太強(qiáng)烈，這類似于一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

CpG ODN刺激單核細(xì)胞后，會提高其分泌IL－6、IL－12和TNF－α等細(xì)胞因子的水平，增加MHC－Ⅱ類分子、共刺激信號CD40、CD86的表達(dá)，提高單核細(xì)胞的抗原遞呈功能，并能延長細(xì)胞存活的時(shí)間 ［18］。CpG ODN激活巨噬細(xì)胞，能夠使其分泌IL－ 6、IL－12、IL－18、IL－1P、TNF－α等多種細(xì)胞因子，上調(diào)多種趨化因子和共刺激分子的表達(dá) ［19］。

CpG ODN可間接促進(jìn)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的功能。pDC受到CpG ODN刺激后，IFN－α的分泌量增加，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性。CpG ODN對NK細(xì)胞的活化還依賴于巨噬細(xì)胞的協(xié)同作用，即CpG ODN刺激巨噬細(xì)胞分泌的IL－12等細(xì)胞因子能夠促使NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ。而IFN－γ能夠促進(jìn)Th1型細(xì)胞的成熟，從而使CpG ODN表現(xiàn)出間接活化T細(xì)胞的功能。

4 CpG ODN對不同畜禽的免疫增強(qiáng)作用

動物在物種進(jìn)化過程中，其TLR－9的基因也逐步在種間變異，不同種類的動物體內(nèi)表達(dá)的TLR－9在結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，比如人和小鼠TLR－9的結(jié)構(gòu)就有24%的不同 ［20］。所以不同動物體內(nèi)的TLR－9所識別的CpG ODN也不盡相同。因此，CpG ODN的免疫刺激活性具有種屬特異性，具體表現(xiàn)為不同的CpG基序可能針對不同種屬的動物具有免疫刺激活性，例如，GTCGTT對人淋巴細(xì)胞具有良好的刺激活性，是人敏感基序；GACGTT對鼠淋巴細(xì)胞具有良好的刺激活性，是鼠敏感基序 ［21］。在研究CpG ODN免疫佐劑效應(yīng)的時(shí)候需要根據(jù)不同的靶動物設(shè)計(jì)符合特殊要求的堿基序列。

到目前為止，國內(nèi)外的研究人員已經(jīng)根據(jù)不同動物的最佳基序設(shè)計(jì)合成，并通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)篩選出了上千條對各種畜禽包括水產(chǎn)動物具有免疫刺激活性的CpG ODN序列。例如對豬有較強(qiáng)刺激活性的5′－TCCATGACGTTCCTGACGTT－3′、5′－ATCGATATCGAT－3′、5′－GACGTTGACGTT－3′、5′－GACGTTGACGTT－3′；對牛有較強(qiáng)刺激活性的5′－TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT－3′、5′－TCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTT－3′、5′－TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT－3′；對雞有較強(qiáng)刺激活性的5′－TCGTCGTTTTGTCGTTTT－GTCGTT－3′；對犬有較強(qiáng)刺激活性的5′－GGTGCATCGATGCAGGGGGG－3′；對蝦蟹有刺激活性的5′－TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG－3′等等 ［22－24］。這些CpG ODN均能提高相應(yīng)動物機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，提高疫苗的免疫效果。一些研究還表明，CpG ODN作為疫苗佐劑使用時(shí)，既可以單獨(dú)發(fā)揮免疫增效作用，也可與傳統(tǒng)的氫氧化鋁佐劑一起發(fā)揮協(xié)同作用，說明CpG ODN具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

在體外篩選有刺激作用的CpG ODN時(shí)，同一動物的外周血單個(gè)核細(xì)胞和脾細(xì)胞有時(shí)會表現(xiàn)出差異較大的反應(yīng)性，即除了種屬特異性，CpG ODN對同一動物不同亞群細(xì)胞也會體現(xiàn)出不同的刺激能力。另外，CpG ODN往往是由若干個(gè)CpG基序組合在一起才具有更強(qiáng)的刺激活性，影響刺激活性的因素還包括核酸骨架的硫代修飾和堿基的回文結(jié)構(gòu)等，在篩選新的CpG ODN時(shí)應(yīng)注意其刺激活性的復(fù)雜性。

5 CpG ODN作為疫苗佐劑使用的安全性

由于CpG ODN能夠減少受刺激淋巴細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)多克隆的B細(xì)胞活化，提高自身免疫性抗體和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。而在CpG ODN的刺激下，機(jī)體反復(fù)的產(chǎn)生TNF－α，其結(jié)果是有可能造成動物發(fā)生中毒性休克。另外，CpG ODN引起機(jī)體的免疫應(yīng)答趨向于Th1型反應(yīng)，因此也更有可能促使器官特異性自身免疫性疾病的發(fā)生。但上述不良反應(yīng)只是理論上的可能，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)由于疫苗中CpG ODN的劑量較低，不足以誘發(fā)或加重系統(tǒng)性自身免疫。在小鼠體內(nèi)進(jìn)行多次注射免疫刺激劑量的CpG ODN后，盡管分泌抗DNA的IgG抗體的B細(xì)胞的數(shù)量上升了2倍～3倍，血清中抗DNA的IgG抗體的滴度提高了60%，但這些變化并沒有使小鼠發(fā)病 ［25］。

現(xiàn)有的臨床試驗(yàn)也沒有發(fā)現(xiàn)注射CpG ODN后，動物機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀和病理變化。在CpG佐劑疫苗和傳統(tǒng)佐劑疫苗的對比試驗(yàn)中，二者安全性方面的數(shù)據(jù)基本一致?？偟膩碚f，CpG ODN在動物體內(nèi)發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)的同時(shí)，其安全性還是很強(qiáng)的。不過有時(shí)候還是會在注射部位出現(xiàn)疼痛、腫脹、硬化、瘙癢、紅斑和出現(xiàn)系統(tǒng)性癥狀，如流感樣癥狀等 ［26］。所以，在試驗(yàn)和臨床應(yīng)用中依然要注意安全性問題，主要是避免使用劑量過大。

6 展望

CpG ODN是一種非常理想的新型疫苗佐劑，在人用乙型肝炎疫苗中已經(jīng)通過了Ⅲ期臨床研究，還在其他很多人用疫苗中也已經(jīng)進(jìn)入到Ⅱ期、Ⅲ期臨床研究階段 ［2］，但在獸用疫苗中的應(yīng)用還比較滯后。由于CpG ODN本身作用的種屬特異性，使得研究者必須針對不同的動物找到能夠在該種動物體內(nèi)穩(wěn)定發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)的CpG ODN。盡管目前研究人員已經(jīng)設(shè)計(jì)篩選出許多對多種動物有效的CpG ODN，但是還不能確定這些CpG ODN是否就是對該種動物是最有效的。除了豬、牛、羊、雞、犬、貓等常見畜禽，毛皮動物水貂、狐貍的特異性CpG ODN序列目前還未見報(bào)道，而CpG ODN實(shí)際上正適合作為這些體型小、價(jià)值高的經(jīng)濟(jì)動物的疫苗佐劑。所以，設(shè)計(jì)和篩選新的CpG ODN還有一定的研究空間。

此外，為了更好的掌握CpG ODN的免疫刺激功能，更有效的發(fā)揮其作為免疫佐劑的能力，還需要進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制。清楚的了解CpG ODN影響基因表達(dá)的信號通路有利于人們設(shè)計(jì)更有效的CpG ODN或發(fā)現(xiàn)其他影響這一途徑的方法。探究最佳免疫劑量和持續(xù)時(shí)間也是優(yōu)化CpG ODN使用的一個(gè)重要內(nèi)容。由于對不同畜禽具有免疫刺激活性的CpG ODN序列的報(bào)道已經(jīng)足夠多，目前科研人員已經(jīng)將更多的目光集中在如何提升CpG ODN的應(yīng)用效果上，比如應(yīng)用納米顆粒技術(shù)和脂質(zhì)體包埋技術(shù)來使CpG ODN的刺激活性發(fā)揮得更好?？傊?，CpG ODN的免疫增強(qiáng)作用已經(jīng)受到人們的一致認(rèn)可，但要將這種免疫佐劑應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐，CpG ODN作為一種新型佐劑在獸醫(yī)領(lǐng)域的研究還不夠成熟。隨著各項(xiàng)研究的深入進(jìn)行，CpG ODN未來將很有可能成為廣泛使用的一種疫苗佐劑，在動物傳染病防控方面發(fā)揮重要作用。