新型基因組編輯技術研究進展

摘 要：基因組編輯技術是一種能精確靶向修飾生物基因組，實現(xiàn)對基因定點敲除和外源基因定點整合的技術。新出現(xiàn)的鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALEN）和規(guī)律性重復短回文序列簇與Cas9蛋白（CRISPRs／Cas9）系統(tǒng)3種新型的基因組編輯技術通過特異性結構識別靶位點，核酸酶發(fā)揮切割作用對靶位點進行定點編輯。3種新型基因編輯技術因具有高效準確、制作簡單、耗時短等特點而在生命科學研究中得到廣泛應用。論文對目前三種新型的基因組定點編輯技術的特點、結構原理、構建方法以及在傳統(tǒng)生物模型、功能基因篩選、人類遺傳病基因治療等方面中的應用做一綜述。

文獻標識碼：A

文章編號：1007－5038（2015）10－0100－06

收稿日期：2015－04－21

基金項目：國家自然科學基金項目（31172304）

作者簡介：韓 勇（1990－），男，山東濟寧人，碩士研究生，主要從事分子免疫學研究。＊通訊作者

近年來隨著人類基因組測序的完成和全基因組測序技術的不斷發(fā)展，復雜基因組中未知基因功能的探索對生物學的定點研究、臨床醫(yī)學及基因治療都有著不可替代的作用。長期以來，基于同源重組機制的基因敲除技術已在基因功能研究中被廣泛采用，但是該技術在實際工作中存在著效率太低、費時費力，而且有可能導致基因突變等問題，使基因功能的研究變得困難。隨著生物技術的發(fā)展，基因組編輯技術經(jīng)歷了三代技術的發(fā)展，即鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）、轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription activator－like effector nucleases，TALENs）和規(guī)律性重復短回文序列簇與Cas9蛋白（clustered regularly interspaced short palindromicrepeats，CRISPR／Cas9）。這三種技術都能夠根據(jù)人工設計在基因組的特定位置造成DNA雙鍵斷裂。細胞會通過DNA同源重組或者非同源末端連接機制修復雙鏈斷裂。在同源序列（外源引入或同源染色體）存在的情況下，同源重組修復（homologous recombination repair，HDR）可實現(xiàn)外源基因的插入或基因的靶向修復；在沒有同源序列的情況下，細胞趨向于利用非同源的末端連接（non homologous end joining，NHEJ）進行DNA的修復，它可能引入或刪除一個或多個堿基從而造成基因移碼突變，使相關基因被敲除。

1 鋅指核酸酶基因編輯技術

1．1 鋅指核酸酶的結構及作用原理

鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）由鋅指蛋白結構域和能識別特異性DNA鏈的切割結構域連接形成并發(fā)揮切割DNA的作用。ZFN由3～4鋅指蛋白組成，可以結合9個～12個核苷酸，每個鋅指蛋白可以識別3bp DNA，當兩個鋅指蛋白模塊結合時可以最有效的結合特異性位點，且每個鋅指模塊可以識別6bp DNA。Ⅱ型限制性內切酶FokⅠ催化DNA雙鏈斷裂，當切割結構域發(fā)生二聚化體時才會斷裂DNA。所以兩個相鄰的ZFN對必須保持合適的距離，才能發(fā)生二聚體化。ZFN可以結合并切割一段DNA序列，并產生DNA雙鏈斷裂。ZFN誘導的雙鏈斷裂可以通過NHEJ和HDR兩種修復方式，NHEJ會在靶位點隨機的引入基因或刪除基因，HDR通過外源性模板在靶位點進行修復 ［1］。此外，F(xiàn)okⅠ突變體需要異源二聚化得到發(fā)展，這可以極大提高對特異性序列的識別并減少對靶點外的位點的切割。DNA分子可以和鋅指蛋白結合，產生鄰近序列效應并與相鄰的結構域相互作用，這既增加了結合物的特異性，也為結合物的設計帶來了挑戰(zhàn)。

1．2 ZFN的構建

當前存在3種不同ZFNs構建方法，即模塊組裝法（modular assembly），寡池工程法（oligomerized pool engineering，OPEN）和由Sangamo Biosciences公司開發(fā)的方法。模塊組裝法通過標準的DNA重組技術將預選的ZF組裝成多鋅指的ZF組合模塊。OPEN法是通過ZF庫獲得識別3bp DNA位點的ZF池。Sangamo Biosciences公司開創(chuàng)的方法則可將鋅指結構組裝成更長的ZF組合模塊。

1．3 ZFN技術的應用

基因編碼的ZFN的表達與對內源性基因位點的斷裂得到廣泛的應用。包括人、斑馬魚、倉鼠、小鼠、豬、青蛙、昆蟲、蛔蟲和瘧原蟲。2010年Osakabe K等 ［2］將帶有熱休克蛋白啟動子的ZFN基因，穩(wěn)定導入擬南芥中，并成功敲除AB14基因。2011年Li H等 ［3］利用ZFN結合未突變的功能基因共轉染，治愈血友病B型家鼠，試驗充分展現(xiàn)了ZFN的巨大潛力。更為重要的是他們將治療引入體內，為基因疾病的治療提供了一個可行的方案。近幾年，ZFN技術在農業(yè)中得到廣泛應用，通過ZFN進行突變育種可以改變植物構造、花期和成熟期，并獲得了3 000多種新型品種 ［4］。ZFN可用于內源性基因的改變，2014年Chen L等 ［5］證明通過特定基因中序列突變實現(xiàn)的反向遺傳法可用于高通量基因組分析。

2 TALEN技術

2．1 TALEN的結構及作用原理

轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription activator－like effector nuclease，TALEN）系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)來自于對黃桿菌屬的研究，黃桿菌屬分泌的效應蛋白（TALE）可以效仿真核轉錄因子與DNA結合并催化靶向DNA表達。TALE蛋白由DNA結合結構域，核定位信號和靶基因轉錄催化結構域組成。

DNA結合結構域由多個單體組成，每個單體可以與一個靶位點的核苷酸結合。每個單體是34個氨基酸殘基串聯(lián)重復組成，第12和13位氨基酸高度特異（RVD），決定了對特異性核苷酸的識別，如Asn和Ile（NI）識別A，Asn和Gly（NG）識別T，2個Asn（NN）識別G，His和Asp（HD）識別C，第1個氨基酸殘基用于穩(wěn)定空間構象，第2位氨基酸識別核苷酸，通過NH或NK識別G可以減少脫靶效率。不同的RVD結合DNA的效率不同。人工構建的TALEN系統(tǒng)由核定位信號，TALE蛋白，半重復片段，N－末端結構域和FokⅠ催化結構域組成。TALENs系統(tǒng)識別兩條反向的DNA位點，兩位點由12bp～25bp DNA片段隔開，并在雙氨基酸殘基（NN、HD、NI、NG）的識別作用下與靶序列結合，F(xiàn)okⅠ配對二聚體化，使DNA雙鏈斷裂 ［6］。DNA結合結構域不能與所有識別的位點結合，只有在打靶序列5′端存在T堿基才會結合。雙鏈斷裂（double－strand breaks，DSB）誘發(fā)DNA損傷修復機制，細胞主要通過兩種途徑來修復，即NHEJ和HDR。當沒有外源的同源序列加入時，細胞就會啟動NHEJ修復機制，將斷開的DNA末端重新結合在一起，但是這種修復機制是一種存在缺陷的修復過程，往往會引入新的突變，因此也就達到了進行基因敲除的目的。如果此時加入外源的同源堿基序列就可以啟動第二種修復機制HDR，利用同源修復機制，可以幫助我們實現(xiàn)基因敲進和基因修復。即使外源的同源序列存在缺陷，同樣可以達到基因敲除的效果。

2．2 TALEN表達載體的構建

TALEN表達載體的構建技術為全序列人工合成法，包括Golden Gate法，REAL法，單元組裝法。Golden Gate法是通過IIS型限制性核酸內切酶介導的克隆方法，該方法是目前在TALEN載體構建中應用最廣泛的方式之一。REAL（restriction enzyme and ligation）法是一種基于反復酶切－連接－轉化 －篩選的組裝法，由Sander等 ［7］的實驗室發(fā)明。單元組裝法是Huang P等 ［8］發(fā)明的另一種基于酶切－連接的TALE結構域組裝法。

2．3 TALEN技術的應用

自2014年以來，TALEN已成功地在犬、小鼠、海鞘、人和大麥生物中進行了基因組定點編輯。Tokuda S等 ［9］利用TALEN技術成功敲除犬腎細胞中的ZO－1基因，并證明了該基因的敲除使細胞接觸之間的肌球蛋白組織發(fā)生改變，而且緊密連接蛋白的位點遭到破壞，從而揭示了ZO－1基因在犬腎細胞之間的連接所擔任的角色。Chen K等 ［10］通過TALEN技術成功敲除了大麥中的grf基因，達到了很高的效率，而且該敲除基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代。以此證明了TALEN可用于檢測基因功能，改變大麥表型并可用于其他作物物種。Liu Y等 ［11］開發(fā)了一種新的策略，通過被雙熒光標記TALEN敲除了純合子小鼠中的Ttc36基因，并且用單側腎切技術檢驗表型，最后證明了新開發(fā)的TALEN策略與單側腎切技術結合可以更好地用于腎臟發(fā)育和腎臟疾病方面的研究。Park C Y等 ［12］用TALEN技術使人類多能干細胞中F8基因顛倒，用來構建血友病細胞系模型，表明只有正常連接的F8基因才能正常轉錄mRNA，證明了TALEN可用來建立與染色體重排有關的疾病細胞模型，也可以用于改變染色體顛倒帶來的缺陷，為血友病的治療和其他基因疾病的治療提供了理論依據(jù)。Liu J等 ［13］通過優(yōu)化TALEN的復合結構，極大地提高了轉染效率，并成功敲除了女性干細胞中HPRT1基因，使敲除效率達到了15%。Treen N等 ［14］通過電轉染將TALEN載體轉入海鞘特異性組織中并達到了很高的轉染效率，并成功敲除了Hox12和Fgf3基因，并通過此方法揭示了海鞘中Fgf3基因功能。

3 CRISPR／Cas系統(tǒng)介導的基因編輯技術

3．1 CRISPR／Cas系統(tǒng)的結構及作用原理

規(guī)律性重復短回文序列簇（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR／Cas）系統(tǒng)是細菌和古生菌中以RNA為基礎的免疫系統(tǒng) ［15］，CRISPPR／Cas系統(tǒng)中含有一個編碼Cas9核酸酶基因和兩個編碼導向RNA的基因，即反式激活crRNA（tracrRNA）和前導crRNA（precrRNA）。precr RNA位點包括一系列的重復序列（30bp～40bp）和間隔序列。crRNA和tracrRNA （trans－activating crRNA）配對與Cas9蛋白形成核酸復合物（RNP），并識別攜帶PAM標記的DNA序列，通過Cas9蛋白中的RuvC和HNH切割結構域發(fā)揮打靶作用。以化膿鏈球菌中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)應用最為廣泛，Cas9蛋白作為該系統(tǒng)的主要特征，它參與Pre－RNA加工為成熟的crRNA，以及對外源DNA的靶向切割 ［16］。Cas9蛋白包含N端RuvC和中間的HNH兩個活性位點。Pre－RNA作為導向序列被直接重復序列隔開，經(jīng)過加工成熟與tracrRNA結合，也可以被一個導向RNA（gRNA）替換。Cas9蛋白結合靶向DNA的特異性由gRNA－DNA對和PAM決定，PAM作為靶序列上核苷酸標志，不同的CRISPR／Cas系統(tǒng)識別的PAM的不同。

對于CRISPR／Cas的作用機理以Ⅱ型CRISPR／Cas系統(tǒng)為例，可以分為三個階段。第一階段，當外源DNA入侵時，核酸中的一小段DNA序列被整合到宿主菌的基因組，整合的位置位于CRISPR的5′端的兩個重復序列之間（repeats），從而在5′端的富含AT的重復序列之間形成間隔序列。第二階段，CRISPR基因座轉錄成Pre－crRNA，Pre－crRNA在Cas9蛋白作用下加工成熟為crRNA，由一個間隔序列和部分重復序列組成。第三階段，外源DNA入侵時CRISPR的表達很快被誘導上調，發(fā)揮定點編輯作用，即crRNA與tracrRNA形成導向的雙鏈RNA（sgRNA），對入侵的外源核酸進行靶向的定位并介導Cas9核酸酶對外源核酸進行切割降解。

3．2 CRISPRs系統(tǒng)的構建

CRISPR系統(tǒng)體外構建的一般步驟：①定向雙鏈RNA（guide RNA，sgRNA）的設計。crRNA與tracrRNA形成的雙鏈RNA（guide RNA，sgRNA）介導雙鏈DNA剪切，sgRNA中導向序列決定了Cas9核酸酶的特異性。CRISPRs系統(tǒng)中，靶序列必須在5′－NGG PAM的前面，序列堿基與靶序列配對并調節(jié)Cas9在PAM上游約3bp處切割。需要指出的是，PAM序列必須在靶DNA位點之后，而不是在sgRNA中引導序列的一部分。②sgRNA的構建與遞呈。根據(jù)靶序列sgRNA可以通過含有表達原件的PCR擴增子或sgRNA表達質粒的形式遞呈?；赑CR擴增子的sgRNA遞呈在擴增時模板鏈必須帶一個U6啟動子。將擴增子與Cas9表達質粒pSpoCas9共轉染細胞可以高效地獲得所需sgRNA，并且可以很快地對細胞進行功能檢測。通過sgRNA表達質粒遞呈sgRNA也是一種簡單、高效的方法，該方法只需要一些互補引物對sgRNA表達質粒進行單一的克隆。③修復模板設計。傳統(tǒng)上靶DNA的修飾需要以含有同源雙臂的質粒作為修復模板，每個位點上的同源臂的長度超過500bp。這種方法主要用于產生大的修飾基因。最新的ssODNs已經(jīng)取代打靶修復質粒，可以用于短的修飾基因，作為特定靶位點修復模版，并獲得很高的HDR效率。④篩選單克隆細胞系。轉染后通過流式細胞儀或連續(xù)稀釋分離單個細胞便可得到，隨后在細胞克隆期建立一個新的細胞系。⑤功能檢測。對設計好的sgRNA進行活性檢測以獲得突變效率較高的sgRNA以用于后期的實驗。目前主要采用的方法有限制性內切酶法、非配對內切酶法和SSA活性檢測等方法。

3．3 與其他基因組編輯技術的比較

近幾年出現(xiàn)了許多基因組編輯技術，包括鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN及RNA指導的CRISPR／Cas核酸酶系統(tǒng)。前兩種技術應用限制核酸內切酶催化結構域的策略來模塊化DNA結合蛋白，并進一步誘導在特定基因組位點上目的DNA雙螺旋的斷裂（DSB）。與其他知名的核酸酶技術，例如：與ZFN、TALEN一樣，Cas9能夠刺激哺乳動物基因組中靶DNA在特定位點發(fā)生雙鏈斷裂及通過NHEJ 和HDR刺激基因組編輯。與ZFN和TALEN技術相比較，Cas9具有幾個潛在的優(yōu)勢：易于定制、更高的打靶效率和促進基因組多重編輯的能力。由于傳統(tǒng)的ZFN通常很難設計，我們將主要比較Cas9和TALEN。①易于定制。通過簡單地購買一對寡核苷酸編碼的20nt的一道序列，Cas9可以重新打靶新的DNA序列。與之相比，TALEN重新打靶新的DNA序列需要重新構建兩個新的TALEN基因。雖然有很多的TALEN構建方案，但實際上構建一對新的TALEN需要更多的操作時間；②劈裂模式。化膿鏈球菌（S．pyogenes）Cas9在靶基因序列第17和18個堿基之間（PAM3bp5′）低效率的切割，使Cas9中RuvC或HNH其中的一個核酸酶結構域突變，可以使酶轉化為DNA切割酶。與之相比，TALEN非特異性的切開一對TALEN之間12bp～24bp處的單體連接位點；③編輯效率。在多種不同類型的細胞核有機體中Cas9和TALEN均展現(xiàn)出促進基因組編輯效率的作用。然而這要歸功于容易打靶，但Cas9可用于同時打靶多個基因組位點。

3．4 Cas9系統(tǒng)的局限性

Cas9可通過sgRNA上20nt的引導序列打靶特定的基因組位點。Cas9打靶位點選擇的唯一要求是PAM序列3′端20bp的靶序列的存在。每個Cas9直接同源，都含有唯一的PAM序列。例如，Cas9需要一段5′－NGG PAM序列，這種PAM的要求在人類基因組中并沒有很嚴格的限制打靶的范圍，這種打靶位點平均每8bp～12bp就會發(fā)現(xiàn)。除了打靶的范圍，其他可能的限制是潛在的脫靶突變。3．5 CRISPR／Cas9系統(tǒng)在基因組編輯中的應用

通過CRISPR／Cas9的特異性切割，可以對DNA分子進行定點編輯。自2014年以來，CRISPR／Cas9系統(tǒng)的開發(fā)和應用已成為分子生物學的熱點。CRISPR／Cas9技術已在細菌、果蠅、哺乳動物、斑馬魚和人多能干細胞（human pluripotent stem cell，hPSC）基因的功能性研究中得到應用。Zhang C等 ［17］用CRISPR／Cas9對瘧原蟲基因進行了修飾，并介紹了一種對P．yoelii基因進行高效、準確敲除的方法。Gokcezade G等 ［18］證明了在果蠅中通過雙順反的Cas9／sgRNA表達載體介導的CRISPR基因編輯是一種高效通用的方法，并通過單一質粒注射可以很大程度節(jié)省時間。Ho T T等 ［19］通過敲除人體不同細胞中的非編碼RNA，如mir－1，mir－29a，IncRNA－21A，UCA1和AK023948。證明了通過CRISPR／Cas9可以成功敲除人類細胞系中非編碼的基因。Sasaki H等 ［20］通過顯微注射或電穿孔注射CRISPR／Cas9表達載體，成功敲除海鞘內源性基因。Endo M等 ［21］為了驗證CRISPR／Cas9是否可以敲除大米的旁系同源基因，通過同型sgRNA靶向誘變大米中的CDKA2、CDKB1和CDKB2。結果證實同型sgRNA可以靶向誘變單倍體，二倍體和三倍體中的CDKA2、CDKB1和CDKB2基因。Wei W等 ［22］通過向蠶胚胎中顯微注射特異性的sgRNA和Cas9－mRNA介導Bm－ck，BmKMO，BmTH和Bmtam的突變，并通過帶有Bmok基因飛蛾與野生型和兩種帶有Bmok基因相互雜交，檢測其后代突變率達到了93．6%，證明了CRISPR／Cas9在家蠶中介導的基因編輯是可以遺傳的。Fan Z等 ［23］通過合成5個sgRNA（其中3個靶向識別不同的編碼序列，一個識別KCNQ1，另一個識別PPP1R12C），證明了CRISPR／Cas9系統(tǒng)在介導倉鼠體細胞特定位點的突變中達到高效而準確的效果，并通過子核和胞質注射法對STAT2基因上的第4外顯子進行了編輯。Straub C等 ［24］利用CRISPR／Cas9成功敲除了Grin1基因，該基因編碼NMDA受體，基本單位GLuN1，在鼠神經(jīng)細胞中很少存在。并證明了CRISPR／Cas9可以介導體內神經(jīng)元的斷裂，為研究神經(jīng)傳導過程中的特異蛋白功能提供了有利的方法。

隨著CRISPR／Cas9技術日漸成熟，為基因疾病的治療提供了更方便、高效的工具。Lin S R等 ［25］為證明CRISPR／Cas9系統(tǒng)是否能斷裂乙型肝炎病毒（HBV）基因組，他們設計8個可識別A基因型HBV的gRNA，伴隨gRNA的CRISPR／Cas9系統(tǒng)可以減少HBV的核心復制和蛋白質的合成，其中一個gRNA可以打靶不同基因型的HBV病毒，最后通過感染的HBV小鼠模型，更加證明了系統(tǒng)可以清除體內HBV，結果可以降低血清中抗原水平。

自第1只基因敲除小鼠模型的產生，科研工作者致力于模型生物的構建，但傳統(tǒng)的構建方法費時費力，程序繁瑣，新一代的CRISPR／Cas9技術為構建模式生物提供了新的平臺。Edvardsen R B等 ［26］在大西洋鮭魚中通過CRISPR／Cas9系統(tǒng)靶向修飾tyr和slc45a2基因，第一次成功地在冷水海洋物種中運用CRISPR／Cas9成功靶向誘變，并成功獲得突變的等位基因，證明了F0代可用于大西洋鮭魚的功能性研究。Irion U等 ［27］在斑馬魚中成功利用CRISPR／Cas9獲得功能缺失的等位基因。通過CRISPR／Cas9高效而且準確的靶向識別修飾alb基因上的終止密碼子，突變率達到50%并可以通過生殖細胞遺傳給下一代，為遺傳研究提供了生物模型。該研究也證明了通過CRISPR／Cas9系統(tǒng)可以為脊索動物的內源性基因的研究提供合適的模式生物。Ni W等 ［28］利用CRISPR／Cas9系統(tǒng)成功敲除山羊的成纖維細胞基因，并通過核移植獲得了一代基因突變山羊。Xing H L等 ［29］人開發(fā)出一種基于PCAMNIA或PGreen載體的CRISPR／Cas9雙運載體和sgRNA模式載體作為一種植物多基因編輯工具。這種載體可以瞬時穩(wěn)定地使CRISPR／Cas9系統(tǒng)表達并在植物中進行高效率的靶向突變。

4 展望

隨著人類基因組測序的完成和全基因組測序技術的不斷發(fā)展，復雜基因組中未知基因功能的探索已成為后基因時代的熱點。與傳統(tǒng)的基因打靶技術相比，新一代的人工核酸酶ZFN、TALEN和細菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR可以應用于更多的物種，且定向修飾更加精確，效率更高，所需時間更短，得到的突變可以通過種系遺傳。但是新一代的基因編輯技術還處于初級階段，還存在細胞毒性、構建復雜、價格昂貴和脫靶效應等問題?？偠灾?，新一輪基因組編輯技術雖然處于研究的初期階段，但其在基因編輯方面已表現(xiàn)出巨大的潛力和廣闊的應用前景，在未來的發(fā)展中，基因編輯技術必將成為生命科學和生物醫(yī)學等領域研究與應用的重要工具。