利用假單胞菌DS1001a降解聚3－羥基丁酸酯制備3－羥基丁酸

張春雨，李 凡，時東方，王雨萌，劉東波，夏紅梅，陳 珊

（1.東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024；2.長春師范大學中心實驗室，吉林長春130032）

利用假單胞菌DS1001a降解聚3－羥基丁酸酯制備3－羥基丁酸

張春雨1，李 凡1，時東方2，王雨萌2，劉東波1，夏紅梅1，陳 珊1

（1.東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024；2.長春師范大學中心實驗室，吉林長春130032）

利用單因素法和響應面中心試驗法對假單胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a降解聚3－羥基丁酸酯（PHB）制備3－羥基丁酸（3－HB）的條件進行了優(yōu)化.結果表明，該菌株降解PHB制備3－HB的最適培養(yǎng)基條件為：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O；最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度40℃，裝液量150mL，接種量1%，初始pH值6.28，培養(yǎng)時間18h.優(yōu)化后3－HB的質量濃度為1.555mg／mL，回收率為77.75%，是單因素優(yōu)化后的1.56倍.

3－羥基丁酸；聚3－羥基丁酸酯；生物降解；條件優(yōu)化

聚3－羥基烷酸酯（PHAs）是用生物發(fā)酵技術合成的脂肪族聚酯，其中最具代表性的是聚3－羥基丁酸酯（PHB），它具有與通用樹脂聚丙烯相類似的性質，能紡絲、壓膜和注塑成型等［1－2］.然而，PHB最突出的性能是具有完全生物降解性和生物相容性，這是許多化學合成高分子材料所不具備的.因此，PHB作為國際公認的生物降解材料，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等領域具有廣闊的應用前景［3－4］.

項目組前期的研究發(fā)現(xiàn)，某些菌株能夠將PHAs降解到單體，特別是PHB降解后可生成3－羥基丁酸（3－HB）［5－7］.3－羥基丁酸具有手征性，可用于色譜分析，以分離光學異構體；還可作為藥物中間體，合成手性藥物［8］.目前的藥物研究中越來越多地集中在生產(chǎn)手性藥物上面，因為對病人來說手性藥物更安全、更有效，使用劑量更小［9］.3－羥基丁酸除了可以作為合成昂貴化合物的起始原料外，其本身也具有重要的生理作用，已有的研究表明3－羥基丁酸和許多生理疾病的發(fā)生及治療有著非常密切的關系［10－12］，表現(xiàn)出巨大的潛在藥用價值.

目前，合成手性羥基脂肪酸（3－羥基丁酸）的主要生產(chǎn)方法有化學合成法及化學降解法.化學方法直接合成3－羥基丁酸需要高溫、高壓的反應條件以及昂貴的手性金屬催化劑等；降解PHB生產(chǎn)3－羥基丁酸，需要耗費大量的有機溶劑、較長的反應時間和高純度的PHB作為起始物［8］，并極易產(chǎn)生消旋化.另外，Lee等利用基因工程菌，以葡萄糖作為碳源，采用體內生物酶法降解聚羥基脂肪酸酯獲得了3－羥基丁酸［13］，但是所需成本較高.

本研究利用一株具有較強PHB降解活性的假單胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a，在體外降解聚羥基脂肪酸酯以獲得3－羥基丁酸；同時，對該菌株在液體培養(yǎng)基中降解PHB獲得3－羥基丁酸的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，得到了3－羥基丁酸的高產(chǎn)條件.通過降解條件的選擇與優(yōu)化，使PHB不是直接降解到二氧化碳和水，而是把降解產(chǎn)物控制在3－羥基丁酸，使其成為新的精細化工原料，以為高附加值處理消費后的PHAs一次性制品奠定理論基礎，并提供技術支撐.

1 實驗材料與方法

1.1菌種

假單胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a，一株經(jīng)過誘變的具有PHB高降解活性的菌株，東北師范大學生命科學學院微生物實驗室保存.

1.2聚3－羥基丁酸酯（PHB）

PHB粉末，由天津國韻生物材料有限公司提供.

1.3 3－羥基丁酸（3－HB）

購于Sigma公司，用于標準曲線的測定.

1.4基本培養(yǎng)基

PHB，0.15%；Na2HPO4·12H2O，1.194%；KH2PO4，0.554%；NH4Cl，0.1%；MgSO4·7H2O，0.05%；CaCl2·2H2O，0.000 5%.1×105Pa高溫蒸汽滅菌20min［5］.

1.5發(fā)酵液中單體含量的測定

將發(fā)酵液在4℃條件下12 000r／min離心20min；取上清，用1mol／L濃鹽酸調pH＝2.0；超濾離心管（截留相對分子質量3 000）4℃，12 000r／min離心20min，取膜下液進行高效液相分析.

高效液相條件：Shim－pack Vp－ODSC18柱（150mm×4.6mm），流動相為V（乙腈）∶V（水）＝15∶85，紫外檢測波長為210nm，進樣量20μL，流速1mL／min，柱溫10℃.

1.6菌株DS1001a降解PHB制備3－HB單體的單因素條件優(yōu)化

對菌株降解PHB獲得3－HB單體的發(fā)酵條件進行優(yōu)化.設定培養(yǎng)基中PHB含量分別為0.15%，0.20%，0.25%，0.30%，0.35%；NH4Cl含量分別為0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%；Na2HPO4·12H2O／KH2PO4含量比分別為0.73／0.28%，0.87／0.33%，1.02／0.38%，1.16／0.44%，1.31／0.49%；MgSO4含量分別為0，0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%.菌株培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度分別為28℃，30℃，35℃，37℃，45℃；初始pH值分別為5，6，7，8，9；接種量分別為1%，2%，3%，4%，5%，6%；500mL三角瓶中裝液量分別為50，100，150，200，250mL.發(fā)酵18h后測定發(fā)酵液中單體的濃度.

1.7利用響應面方法優(yōu)化設計

根據(jù)單因素條件優(yōu)化結果，利用響應面分析法的中心組合試驗（CCD），以培養(yǎng)溫度、初始pH值、裝液量3個因素為自變量，分別為X1，X2，X3，以3－HB單體濃度為響應值Y，進行試驗設計.

利用軟件Design Expert Version 7.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，得到響應值Y與自變量X1，X2，X3的關系，回歸方程為

式中：a0是常數(shù)項；a1，a2，a3是一次項系數(shù)；a12，a13，a23是交互項系數(shù)；a11，a22，a33是二次項系數(shù).

對回歸方程進行顯著性檢驗和方差分析，并對已回歸的方程求一階偏導，令其等于0，得到3－HB濃度最大時對應的最適條件，在該條件下進行驗證實驗.

2 結果與討論

2.1菌株DS1001a降解PHB發(fā)酵液中單體含量的測定

將3－HB標準品稀釋成不同濃度，使用高效液相檢測，在2min左右出現(xiàn)對稱峰（見圖1），繪制單體含量－峰面積圖（見圖2），該直線方程為y＝355 741x－16 922，r＝0.999 7.根據(jù)標準曲線方程可由高效液相色譜的單體峰面積計算得出樣品中3－HB的濃度.

2.2菌株DS1001a降解PHB制備3－HB單體的單因素分析

在基礎培養(yǎng)基的基礎上進行發(fā)酵，每隔6h取一次樣，測定發(fā)酵液中3－HB的質量濃度，繪制菌株產(chǎn)3－HB的時間曲線（見圖3）.由圖3可見，培養(yǎng)12～18h3－HB單體含量較高，因此，為方便取樣將培養(yǎng)時間定為18h.

2.2.1 培養(yǎng)基成分對制備3－HB單體的影響

對菌株產(chǎn)3－HB的單因素條件進行優(yōu)化，圖4為培養(yǎng)基成分的優(yōu)化結果，確定的最適培養(yǎng)基組成為：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O.

圖4 （A，C）的結果顯示，培養(yǎng)基中的碳源、磷源的含量對產(chǎn)物中3－HB的質量濃度有較明顯的影響.由圖4（B）可知，氮源在培養(yǎng)基中所需的含量較小，且對產(chǎn)物中3－HB質量濃度影響不大，推斷培養(yǎng)基中氮源的匱乏可能對菌株降解PHB生成3－HB的行為有一定的促進作用.另外由圖4（D）可知Mg2＋對產(chǎn)物中3－HB質量濃度的影響不成線性規(guī)律，在0.07%時濃度較高.培養(yǎng)基中還加入微量的Ca2＋，結果證明Ca2＋對3－HB的質量濃度并無明顯影響.

2.2.2 培養(yǎng)條件對制備3－HB單體的影響

圖5為菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化結果，確定的最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度35℃，初始pH＝6，接種量為1%，裝液量200mL.其中，圖5（A）顯示了該菌株在一定溫度范圍內都表現(xiàn)了較好的PHB降解活性；圖5（B）和（D）顯示了pH值、裝液量對產(chǎn)物中3－HB的質量濃度都有較明顯的影響；圖5（C）顯示了接種量對產(chǎn)物中3－HB質量濃度的影響較不規(guī)律，較低和較高的接種量對菌株降解PHB獲得3－HB都有較積極的影響.

2.3利用響應面方法優(yōu)化制備3－HB單體的條件

根據(jù)單因素條件優(yōu)化實驗的結果，利用響應面分析法的中心組合試驗（CCD），以培養(yǎng)溫度、初始pH值、裝液量3個因素為自變量，分別設為X1，X2，X3.以產(chǎn)物中3－HB質量濃度為響應值Y，進行3因素5水平的試驗設計，每個自變量的5個水平如表1所示，以（－1.68，－1，0，1，1.68）進行編碼.中心組合試驗方案及結果見表2.

表2中，1—8是析因試驗；9—14是星點設計；15—20是中心點重復試驗，用來估算誤差.采用Design－Expert軟件對上表中的響應值及各因素進行回歸擬合，得到方程：

其中：Y為響應值，即產(chǎn)物中3－HB的濃度；X1，X2，X3分別代表培養(yǎng)溫度、pH值和裝液量.由F－test值判定回歸方程中各變量對響應值的影響是否顯著，概率P越小，則相應變量的顯著性越高.方差分析結果見表3.

方差分析的結果表明，該回歸方程中各變量對響應值的影響極顯著（P＝0.007 7），回歸方程的擬合成功.相關系數(shù)R2＝82.69%，說明響應值的變化有82.69%來源于所選變量，進而說明該方程能夠真實地表達各因素與響應值之間的關系.

回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗結果見表4.由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，其中一次項X2＜0.01極顯著，二次項X22＜0.01極顯著.表明單因素中pH值對產(chǎn)物3－HB濃度的影響是極顯著的.

由響應面回歸分析和回歸方程擬合可以繪出響應面圖和等高線圖（見圖6—8）.

各因素對實驗結果的影響可以通過響應面的三維空間圖直觀地表現(xiàn)出來，圖中的曲面越陡峭，說明該因素對實驗結果的影響越大.變量之間的關系可通過等高線圖表現(xiàn)出來，等高線呈圓形，說明兩因素之間影響不顯著；呈橢圓形，說明兩因素之間交互作用較大.

另外，從圖中可以得到擬合曲面的最大值，從而確定各因素的最佳點，對回歸方程求一階偏導，并令其等于0，可以得到曲面的最大點，即預測的最優(yōu)條件：溫度40℃，pH＝6.28，裝液量為150mL，預測產(chǎn)物中3－HB單體的質量濃度為1.225mg／mL.

2.4響應面驗證實驗

為驗證模型的準確性和效能，在響應面法預測的最優(yōu)發(fā)酵條件下進行驗證實驗，3次重復.結果顯示，產(chǎn)物中3－HB的質量濃度可達到1.555mg／mL，與模型預測值1.225mg／mL吻合良好，從而證明了該模型的準確性.如表5所示，通過響應面試驗優(yōu)化后發(fā)酵產(chǎn)物中3－HB的濃度是單因素優(yōu)化后的1.56倍，為優(yōu)化前的3.81倍.該結果進一步證明了用響應面法尋求最佳發(fā)酵條件是可行的.

計算3－HB的收率：用發(fā)酵后得到3－HB的量比上培養(yǎng)基中加入的PHB的量，即1.555mg／mL× 100mL÷0.2g等于77.75%.

3 結論

利用響應面分析法能夠直觀地表現(xiàn)各個變量之間的關系，以及變量和響應值的關系，是一種較好的多條件優(yōu)化的方法.本文采用單因素條件優(yōu)化和響應面分析法，對假單胞菌DS1001a降解PHB獲得3－HB的條件進行了優(yōu)化.單因素條件優(yōu)化的結果確定該菌株降解PHB獲得3－HB的最適培養(yǎng)基條件為：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O；最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度35℃，裝液量200mL，接種量1%，初始pH值6.0，培養(yǎng)時間18h.對培養(yǎng)溫度、初始pH值和裝液量3個變量進行響應面優(yōu)化后，進一步確定的培養(yǎng)條件為溫度40℃，pH值6.28，裝液量為150mL.通過優(yōu)化得到了較高濃度的3－HB，是優(yōu)化前的3.81倍，其中響應面試驗優(yōu)化是單因素條件優(yōu)化后的1.56倍，獲得的3－HB的回收率達到77.75%.在已報道的生產(chǎn)3－HB的野生菌株中，該菌株可以利用PHB作為唯一碳源降解PHB為3－HB，并具有較高的產(chǎn)量，可以嘗試將該菌株應用于PHB材料的回收利用、再生產(chǎn)等.從生物循環(huán)的角度著手，將降解PHB的過程與生產(chǎn)3－羥基丁酸的過程結合起來，進一步實現(xiàn)生物資源的再利用，具有較高的商業(yè)價值和環(huán)保意義.

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Production of 3－h(huán)ydroxybutyrate by Psedomonas sp.DS1001biodegraded polyhydroxybutyrate

ZHANG Chun－yu1，LI Fan1，SHI Dong－fang2，WANG Yu－meng2，LIU Dong－bo1，XIA Hong－mei1，CHEN Shan1
（1.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；2.The Cental Laboratory，Changchun Normal University，Changchun 130032，China）

Used a strain of Psedomonas sp.DS1001ato produce 3－HB by biodegrading PHB，single factor conditions and response surface designs were optimized.The experiments determined the optimal media conditions：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O.The optimal culture conditions：culture temperature 40℃，liquid volume 150mL，inoculum 1%，initial pH＝6.28，incubation time 18h.The optimized 3－HB concentration was 1.555mg／mL，the recovery was 77.75%，the optimization was 1.56times than before.Determine the yielding conditions by using the strain obtained 3－HB from biodegradation process.

3－h(huán)ydroxybutyrate；polyhydroxybutyrate；biodegradation；optimization

Q 939.9 ［學科代碼］ 180·6150 ［

］ A

（責任編輯：方林）

1000－1832（2015）01－0111－08

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.021

2014－04－22

國家自然科學基金資助項目（31270164）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20130102062JC）.

張春雨（1988—），女，碩士研究生；通訊作者：陳珊（1955—），女，博士，教授，博士研究生導師，主要從事環(huán)境與資源微生物學研究.