紫地榆的乙酸乙酯部分和水部分抗粘性放線菌的體外研究

楊 淋，王 濤，藍(lán) 海*

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

紫地榆是牻牛兒苗科老鸛草屬植物Geranium strictipesR.Kunth的根，其主要的化學(xué)成分有沒(méi)食子酸、鞣花酸、原兒茶酸、五倍子酸甲酯、（+）-兒茶素、3，4-二羥基苯甲酸等〔1-3〕。張嫻文等〔4-6〕通過(guò)紫地榆的體外抗菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)紫地榆提取物具有良好的體外抗菌作用；藍(lán)海等〔7〕通過(guò)紫地榆水提物對(duì)再礦化及抗酸脫礦作用的體外研究發(fā)現(xiàn)其抑制脫礦和促進(jìn)再礦化方面效果明顯；刁水全等〔8〕通過(guò)恒pH法比較牛切牙經(jīng)紫地榆處理后抗酸脫礦作用發(fā)現(xiàn)100 g/L紫地榆對(duì)牙齒有保護(hù)作用，抗齲效果比氟化鈉（20 mg/L）好，但紫地榆對(duì)口腔主要的致齲菌粘性放線菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及粘附的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料

紫地榆購(gòu)于大理藥材市場(chǎng)，由大理學(xué)院藥化學(xué)院楊月娥高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為紫地榆Geranium strictipesR.Kunth 的根。粘性放線菌ATCC 27044（廣東微生物菌種保藏中心）；胰酶解酪蛋白- 植物蛋白胨- 酵母提取物（trypticase-phytone-yeast extractm edium，TPY）固體及液體培養(yǎng)基；0.5、0.1 mol/L氫氧化鈉；0.5 mol/L 磷酸鹽（PBS）緩沖液、蔗糖、無(wú)水乙醇、葡萄糖、蒽酮、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，以上試劑均為分析純。

2 方法

2.1 紫地榆粗提物的制備用95%乙醇常溫浸泡粉碎的原藥材24 h，抽濾后把濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成浸膏后加適量蒸餾水溶解，用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水萃取，所得的各部分冷凍干燥后得粉末備用。

2.2 菌液制備將粘性放線菌ATCC 27044凍干菌株復(fù)蘇48 h 后接種于TPY 液體培養(yǎng)基中厭氧條件下（37 ℃ 、80%N2，20%CO2）培養(yǎng)18 h。經(jīng)生化鑒定及涂片檢查為純培養(yǎng)后，將細(xì)菌接種在TPY 固體培養(yǎng)基上傳代，用無(wú)菌棉簽把TPY固體培養(yǎng)基上的二代菌落取出置于無(wú)菌生理鹽水內(nèi)，用0.5 麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)比濁管調(diào)菌懸液的濃度，配成630 nm波長(zhǎng)處菌液濃度光密度值（optical density，OD 值）約為0.1 的菌懸液備用。

2.3 最低抑菌濃度及最低殺菌濃度的測(cè)定測(cè)定紫地榆乙酸乙酯部分和水部分的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。將紫地榆乙酸乙酯部分和水部分按2倍稀釋法分別溶于含1%葡萄糖的TPY 液體培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為72.000 g/L、36.000 g/L、18.000 g/L、9.000 g/L、4.500 g/L、2.250 g/L、1.125 g/L、0.563 g/L。將菌懸液與含藥液的培養(yǎng)基按1:1（V/V）比例，加入96孔板后置37 ℃，80%N2，20%CO2下厭氧培養(yǎng)48 h。肉眼觀察是否有菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)的紫地榆萃取物濃度為其MIC。選擇大于MIC 濃度的各孔，分別取20 μL 涂布于TPY 固體培養(yǎng)基上，在相同條件下培養(yǎng)48 h，肉眼觀察菌落數(shù)少于5～6個(gè)的最低萃取物濃度為最低殺菌濃度（MBC）〔9〕，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌產(chǎn)酸作用的影響根據(jù)紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)上述粘性放線菌的MIC 測(cè)定結(jié)果，將含1%葡萄糖和紫地榆萃取物的TPY 液體培養(yǎng)基配成MIC以下濃度梯度的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)1個(gè)含0.05%洗必泰的陽(yáng)性對(duì)照組、1個(gè)不含藥物的陰性對(duì)照組，共6 組，每組設(shè)3 個(gè)平行管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。調(diào)定初始pH 值為7.4 并按菌懸液：TPY 液體培養(yǎng)基為1:10（V/V）的比例接種粘性放線菌后置于37 ℃，80%N2，20%CO2厭氧條件下培養(yǎng)48 h。用pH 計(jì)測(cè)定培養(yǎng)物上清液的pH 值并計(jì)算pH 的變化值△pH（初始pH值-終末pH值）。

2.5 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌粘附作用的影響采用2 倍稀釋法將含5%蔗糖和含紫地榆萃取物的TPY 液體培養(yǎng)基配成MIC 以下4 個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)1 個(gè)不含藥液的陰性對(duì)照組和1 個(gè)含0.05%洗必泰的陽(yáng)性對(duì)照組，每組3 個(gè)平行管。將菌懸液與藥液按體積比1:10（V/V）接種，各試管混勻，置管與地平面呈30°傾斜，置于37 ℃，80% N2，20% CO2下厭氧培養(yǎng)48 h。將試管中液體輕輕移去，用磷酸鹽緩沖液洗脫粘附到試管壁的細(xì)菌，3 mL/次，共3次，然后3 000 r/min 離心20 min，收集細(xì)菌置于2 mL 蒸餾水中，混勻。各試管均吸取200 μL 于96 孔板，用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處OD 值，重復(fù)測(cè)3 次，結(jié)果取平均值，并計(jì)算粘附抑制率。

粘附抑制率=（陰性對(duì)照組OD630nm- 實(shí)驗(yàn)組OD630nm）/陰性對(duì)照組OD630nm×100%

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)（±s）進(jìn)行分析，各組總體均數(shù)之間比較采用單因素方差分析（ANOV，analysis of variance）；兩兩比較用Dunnett T3檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌生長(zhǎng)的影響紫地榆乙酸乙酯部分對(duì)粘性放線菌的MIC和MBC分別為4.500 g/L，9.000 g/L。紫地榆水部分對(duì)粘性放線菌的MIC和MBC分別為9.000 g/L，18.000 g/L。

3.2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌產(chǎn)酸作用的影響各濃度組△pH 值不隨紫地榆乙酸乙酯部分濃度的增加而逐漸減小。不同濃度紫地榆乙酸乙酯部分對(duì)粘性放線菌產(chǎn)酸作用的影響結(jié)果經(jīng)單因素方差分析，各濃度組△pH值總體均數(shù)不全相等（F=795.801，P＜0.01），用Dunnett T3 進(jìn)行兩兩比較。

隨紫地榆水部分濃度的增加，4.500 g/L、2.250 g/L、1.1253 g/L3個(gè)實(shí)驗(yàn)組△pH值的變化不明顯，任意兩組間比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05）。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組△pH值總體均數(shù)不全相等（F=2362.321，P＜0.01），用Dunnett T3進(jìn)行兩兩比較。見(jiàn)表1及圖1。

表1 不同濃度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌產(chǎn)酸作用的影響（±s）

表1 不同濃度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌產(chǎn)酸作用的影響（±s）

注：a表示與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；b 表示與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；c 表示任意兩實(shí)驗(yàn)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

乙酸乙酯部分濃度/（g/L）2.250 1.125 0.563 0.281陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組△pH 值0.780 3±0.023 3a,b,c 0.878 6±0.033 8a,b,c 0.857 5±0.021 7a,b,c 1.098 9±0.058 9a,b,c 2.820 0±0.043 6 0.727 8±0.058 9水部分濃度/(g/L)4.500 2.250 1.125 0.563陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組△pH 值0.620 3±0.036 5a,b 0.654 7±0.041 5a,b 0.641 9±0.038 0a,b 2.258 5±0.233 4b,c 2.703 1±0.175 6 0.725 5±0.058 3

圖1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物對(duì)粘性放線菌產(chǎn)酸作用的影響

3.3 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌粘附作用的影響粘性放線菌的粘附抑制率隨著紫地榆乙酸乙酯部分濃度的增大而增大。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組OD值總體均數(shù)不全相等（F=398.592，P＜0.01），用Dunnett T3 進(jìn)行兩兩比較。粘性放線菌的粘附抑制率隨著紫地榆水部分濃度的增大而增大。經(jīng)單因素方差分析，各濃度組OD 值總體均數(shù)不全相等（F=171.199，P＜0.01），用Dunnett T3進(jìn)行兩兩比較。見(jiàn)表2及圖2。

圖2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物對(duì)粘性放線菌粘附作用的影響

4 討論

粘性放線菌是口腔中常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌，不僅能發(fā)酵多種碳水化合物產(chǎn)酸，而且對(duì)膠原也有很強(qiáng)的親和力，在齲損根面菌斑中的代謝活性明顯高于無(wú)齲根面菌斑，它與根面齲的發(fā)生有密切聯(lián)系〔10〕。細(xì)菌對(duì)牙面的粘附、產(chǎn)酸和耐酸是粘性放線菌致病的主要表現(xiàn)，其中細(xì)菌的粘附性是最重要的毒力因子〔11〕。本實(shí)驗(yàn)中乙酸乙酯部分低于MIC的4個(gè)濃度梯度實(shí)驗(yàn)組（2.250 g/L、1.125 g/L、0.563 g/L、0.281 g/L）的△pH值與空白對(duì)照組的△pH值比較，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的△pH 值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明紫地榆乙酸乙酯部分能明顯抑制粘性放線菌產(chǎn)酸；4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的OD 值與空白對(duì)照組的OD值比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且其抑制作用隨著紫地榆乙酸乙酯部分濃度的增加而明顯增強(qiáng)，說(shuō)明紫地榆乙酸乙酯部分能明顯抑制粘性放線菌粘附；水部分低于MIC 的4 個(gè)濃度梯度實(shí)驗(yàn)組（4.500 g/L、2.250 g/L、1.125 g/L、0.563 g/L）的△pH值與空白對(duì)照組的△pH值比較，前3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的△pH值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明一定濃度的紫地榆水部分能抑制粘性放線菌產(chǎn)酸；4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的OD 值與空白對(duì)照組的OD 值比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且其抑制作用隨著紫地榆水部分濃度的增加而明顯增強(qiáng)，說(shuō)明紫地榆水部分能明顯抑制粘性放線菌粘附。

表2 不同濃度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌粘附作用的影響（±s）

表2 不同濃度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分對(duì)粘性放線菌粘附作用的影響（±s）

注：a 表示與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；b 表示與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；c 表示任意兩實(shí)驗(yàn)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

乙酸乙酯部分濃度/（g/L）2.250 1.125 0.563 0.281陰性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組OD 值0.138 0±0.018 3a,b 0.143 5±0.034 6a,b 0.184 2±0.028 5a,b,c 0.280 5±0.033 6a,b,c 0.397 5±0.041 6 0.054 9±0.011 5粘附抑制率/%65.29 63.90 53.65 29.44—86.85水部分濃度/(g/L)4.500 2.250 1.125 0.563空白對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組OD 值0.204 8±0.042 2a,b 0.233 0±0.048 8a,b 0.278 0±0.059 8a,b 0.334 0±0.044 8a,b,c 0.507 5±0.093 9 0.054 9±0.011 5粘附抑制率/%59.65 54.09 45.21 34.17—86.85

醋酸洗必泰又稱醋酸氯已定（chlorhexidine acetate，CA），是一種廣譜抗生素，能減少牙周病和齲病的發(fā)生。劉建寧等〔12〕研究證實(shí)洗必泰漱口液可以有效地控制菌斑，減輕牙齦炎的程度；薛丹等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)洗必泰與殼聚糖合用可以發(fā)揮協(xié)同抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫地榆水部分濃度≥1.125 g/L時(shí)，其抑制粘性放線菌產(chǎn)酸的能力比0.05%的洗必泰強(qiáng)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；紫地榆乙酸乙酯部分抑制粘性放線菌產(chǎn)酸的能力比0.05%的洗必泰弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；紫地榆乙酸乙酯部分和水部分抑制粘性放線菌粘附的能力均比0.05%的洗必泰弱。因洗必泰是一種有效的抗菌劑，廣譜抗菌作用強(qiáng)，在短時(shí)間內(nèi)能將細(xì)菌殺死，但其抗菌斑活性常因雙胍活性基團(tuán)位點(diǎn)被唾液或齦溝液中某些蛋白成分封閉而減低〔13〕，且長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生牙齒變色、味覺(jué)障礙等副作用，因此本研究為尋找副作用較輕的天然防齲藥物打下基礎(chǔ)。

綜上所述，一定濃度的紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物可抑制粘性放線菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸和粘附作用，有望用于齲病的預(yù)防。

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