豬脂肪發(fā)育相關(guān)miRNAs的功能研究進展

陳 晨，胡雄貴，朱 吉，任慧波，鄧 緣，彭英林

(湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131)

豬脂肪發(fā)育相關(guān)miRNAs的功能研究進展

陳 晨*，胡雄貴，朱 吉，任慧波，鄧 緣，彭英林*

(湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131)

脂肪組織與豬肉品質(zhì)密切相關(guān)，是影響豬胴體品質(zhì)的一大因素。了解豬脂肪組織的生長發(fā)育及代謝調(diào)控機制，對于畜牧生產(chǎn)及疾病治療具有重大意義。miRNAs(microRNAs)是一類內(nèi)源性的、非編碼的、長度為18～24 nt的小分子RNA，其主要通過調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄后水平起作用。大量研究表明，miRNAs參與調(diào)控脂肪細胞分化、脂肪形成、脂肪酸代謝、膽固醇合成等多個生命過程。然而目前已報道的豬miRNAs僅有326個，且miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究十分欠缺。本文對近年來豬脂肪相關(guān)miRNAs的挖掘和鑒定研究工作進行回顧，同時也關(guān)注了miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究。

豬；脂肪發(fā)育；miRNAs；調(diào)控機制

豬是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物，也是中國第一大肉品來源。脂肪組織與肉品質(zhì)密切相關(guān)，是影響豬肉品質(zhì)的一大因素，同時胴體瘦肉率也是評估胴體品質(zhì)的一個重要方面。因此，脂肪組織的發(fā)育和肉品質(zhì)一直受到科學家們的廣泛關(guān)注，對豬脂肪組織的生長發(fā)育及代謝調(diào)控研究具有重要的經(jīng)濟意義。miRNAs是一類內(nèi)源性的、進化高度保守的非編碼小分子RNA。許多研究已表明，miRNAs在調(diào)控體外和體內(nèi)脂肪形成過程中扮演著重要角色。迄今為止，最新miRBase數(shù)據(jù)庫中(Release 20)(http：//www.mirbase.org/)可查詢到的人和小鼠的成熟miRNAs分別達到2 578個和1 908個，而豬中僅有326個，且miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究十分欠缺，因此豬miRNAs的數(shù)量和功能亟待持續(xù)挖掘和深入探索。

本文綜述了近年來豬脂肪相關(guān)miRNAs的挖掘和鑒定工作，也特別關(guān)注了miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究進展。

1 脂肪形成概述

脂肪組織是體脂合成的主要器官，同時也是儲存脂肪細胞的主要場所。除提供能量外，它還具有維持體溫，緩沖外界機械沖擊，保護內(nèi)臟器官、分泌脂肪因子和調(diào)節(jié)生理機能等作用[1-2]。其中脂肪細胞的形成對脂肪組織的發(fā)育起著舉足輕重的作用。

目前普遍認為脂肪細胞來源于多潛能干細胞，其經(jīng)歷脂肪母細胞和前脂肪細胞，最終分化形成成熟的脂肪細胞。前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化過程由多種分化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，并伴隨一系列成脂基因和脂代謝合成酶基因的時序表達(圖1)。前脂肪細胞的分化首先要經(jīng)歷細胞生長的抑制階段，即細胞長滿達到接觸抑制，退出細胞周期并停止有絲分裂。此時脂肪細胞早期分化標記基因脂蛋白脂肪酶(LPL)和前脂肪細胞因子1(pref1)高表達。接著在分化誘導劑(Insulin、DEX和IBMX)的刺激作用下，細胞再次進入細胞周期并進行兩輪有絲分裂克隆擴增，然后多種分化轉(zhuǎn)錄因子開始表達，主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有CAAT/增強子結(jié)合蛋白δ、β、α(C/EBPδ、β、α)，脂肪細胞分化決定因子1/固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(ADD1/SREBP1c)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)。此后這些轉(zhuǎn)錄因子啟動脂肪形成相關(guān)基因的表達，如激素敏感性脂肪酶(HSL)、乙酰輔酶A脫羧酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)、脂肪酸結(jié)合蛋白(ap2/FABP4)、脂聯(lián)素(adiponectin)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)等。此階段細胞形態(tài)由纖維狀逐漸趨于橢圓形或圓形，胞內(nèi)出現(xiàn)小脂滴，隨后細胞進入脂滴累積的終端分化狀態(tài)[3-5]。

圖1 脂肪細胞分化的過程示意圖Fig.1 Schematic of process of adipocyte differentiation

2 miRNA的生成和作用機制

miRNA是一類內(nèi)源性的、物種間保守的、具有時空組織特異性的、長度為18～24 nt的非編碼小分子RNA[6]。1993年，科學家們首次在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了具有調(diào)節(jié)其發(fā)育時序性的miRNA，即lin-4。lin-4與靶mRNAlin-14的3′UTR反向互補結(jié)合，從而抑制了lin-14基因的翻譯[7]。第2個miRNA let-7也于2000年被發(fā)現(xiàn)[8]，其與lin-4和daf-12基因的3′UTR互補配對結(jié)合，進而抑制靶mRNA的翻譯。

動物中miRNA的生成是一個多步驟的復雜進程，大致可分為3個階段(圖2)：①核內(nèi)miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄出一個長的初級轉(zhuǎn)錄本，即primary-miRNA(pri-miRNA)，長度從幾百至幾千個核苷酸不等，此初級轉(zhuǎn)錄本含有成熟的miRNA及多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)；②pri-miRNA被RNase Ⅲ Drosha和DGCR8形成的蛋白復合物識別并剪切形成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)、長度約為70 nt的前體miRNA，即precusor-miRNA(pre-miRNA)；③pre-miRNA被轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5 從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，細胞質(zhì)中的RNase Ⅲ Dicer酶及結(jié)合蛋白將pre-miRNA切割成長度約為22 nt的雙鏈miRNA，即miRNA：miRNA*。隨后，雙鏈迅速解螺旋，其中一條鏈降解，另一條鏈即為成熟的miRNA。成熟的miRNA結(jié)合RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)后再與靶基因結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[9]。

miRNA主要以兩種方式抑制靶基因的表達：靶mRNA的剪切降解和翻譯抑制。RISC中的AGO蛋白引導miRNA識別靶基因，當miRNA序列與靶mRNA序列完全配對時引起靶mRNA的剪切和降解，這種情況多見于植物中。而部分堿基互補配對(通常是miRNA的“種子序列”即第2～8 nt與靶mRNA的結(jié)合)則傾向于抑制靶mRNA的翻譯，此種作用多見于動物中[10]。以前的研究認為，成熟的miRNA只與靶mRNA的3′UTR結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，然而近來的研究表明miRNA還可與5′UTR及CDS區(qū)結(jié)合[11-12]，這表明miRNA可通過多種復雜的途徑來調(diào)控基因的表達從而影響生命過程。

圖2 miRNA的生物合成過程及其作用機制[9]Fig.2 A model for miRNA biogenesis process and its targeting mechanism[9]

3 豬脂肪相關(guān)miRNAs的挖掘和鑒定

miRNAs的挖掘方法主要包括生物信息學預測、cDNA克隆測序和高通量測序等技術(shù)。鑒定miRNAs最經(jīng)典的方法是被譽為“金標準”的RNA印跡(Northen blotting)，其次還有實時定量PCR(qPCR)、原位雜交和芯片等技術(shù)。

基于豬基因組測序任務的逐步完成，以及在人和小鼠上鑒定出了相對較多的miRNAs，計算機同源搜索起初成為挖掘豬miRNAs的首要方法[13-14]。R.Wernersson等[13]于2005年采用這種方法對豬基因組進行掃描，共篩選出51個成熟miRNAs，這也是第一篇關(guān)于豬miRNAs的報道，這項研究對后續(xù)miRNAs的挖掘具有重要指導意義。雖然生物信息學方法可以從全基因組中快速挖掘大量潛在的miRNAs，但預測分析結(jié)果仍需進一步試驗驗證。

此后，多位專家學者開始采用cDNA克隆測序方法對豬miRNAs進行挖掘，并采用“夾板連接法”對miRNAs進行鑒定[15-16]。I.S.Cho等[16]在180日齡巴克夏豬的背最長肌和35日齡杜長大三元雜交豬的背部脂肪組織中共克隆出89個miRNAs，其中miR-16、miR-21、miR-199a和miR-199a*在脂肪組織中顯著高表達，而miR-130b、miR-339、miR-450b*、miR-542*和miR-574*則表現(xiàn)出脂肪特異性。這是豬中首次將脂肪組織作為單列研究對象進行miRNAs的挖掘鑒定工作，其研究結(jié)果為深入探索這些miRNAs的生物學功能奠定了良好基礎。cDNA克隆測序方法雖然可靠性高，但耗時長、效率低，很難鑒定低豐度或組織細胞特異表達的miRNAs，這也限制了此方法的大規(guī)模應用和推廣。

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，高通量測序方法的出現(xiàn)極大促進了miRNAs的挖掘鑒定工作，同時豬脂肪相關(guān)miRNAs的研究也進入了飛速發(fā)展時期。

早在2009年，A.M.Reddy等[17]采用454測序方法對10月齡雜交豬的心、肝與胰腺組織的miRNAs進行測序，測序結(jié)果采用Northern blotting法進行試驗驗證。結(jié)果共鑒定出120個保守的miRNAs，其中miR-194在肝中顯著高表達，miR-122則表現(xiàn)出肝特異性。2011年，S.S.Xie等[18]利用芯片技術(shù)對Solexa測序鑒定出的miRNAs在脂肪型通城豬和瘦肉型大白豬的肝中進行差異表達的檢測，并結(jié)合RT-PCR和Northern blotting法對miRNAs在多個組織中進行驗證。結(jié)果共篩選出miR-143和let-7等58個表達差異的miRNAs。研究也證實，miR-143和let-7在人、小鼠和豬的脂肪細胞分化、脂肪形成及脂肪酸代謝過程中扮演著重要角色[19-22]。肝也是脂肪代謝的重要器官，在脂肪的合成和釋放、脂肪酸分解、膽固醇與磷脂的合成、脂蛋白的合成及運輸?shù)壬磉^程中發(fā)揮著重要作用。因此，梅山豬和大白豬肝差異miRNAs的鑒定在一定程度上為揭示脂肪形成的分子機制提供參考。同年，C.Chen等[23]以Illumina高通量平臺為研究手段，以杜洛克與二花臉F2代在脂肪沉積和生長上存在顯著差異的全同胞雌性個體為研究對象，分別對兩個體的肝、背最長肌和腹部脂肪共6個樣品進行miRNAs的挖掘。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了348個成熟miRNAs(164個潛在的新的miRNAs)，其中86個新的miRNAs是腹脂特異存在的，表明這些miRNAs可能調(diào)控豬的脂肪沉積過程，為脂肪發(fā)育規(guī)律的深入研究提供新的理論素材。

2011年，G.Li等[24]以7日齡榮昌仔豬和240日齡榮昌大豬的背部脂肪組織為試驗材料，采用Solexa方法對兩個樣品的miRNAs庫進行高通量測序分析。共鑒定出227個成熟miRNAs，其中miR-122、miR-103/107和miR-224等93個miRNAs在大豬背脂中顯著上調(diào)表達，miR-205、miR-493和miR-136等33個miRNAs顯著下調(diào)表達，揭示這些miRNAs可能在豬脂肪發(fā)育和沉積過程中發(fā)揮各種生理調(diào)控作用。已有研究顯示，miR-122增加肝脂肪酸氧化、抑制膽固醇合成[25]；飼喂高膽固醇日糧的哥廷根迷你豬具有較高的體重、總膽固醇水平和高密度脂蛋白含量[26]，這些表征與miR-122的低水平表達有關(guān)，暗示了miR-122與豬肥胖之間的相關(guān)性；miR-103加速豬前脂肪細胞的分化、促進脂滴積累[27]；miR-224阻礙小鼠3T3-L1細胞早期成脂分化[28]。這些研究發(fā)現(xiàn)從側(cè)面支持了測序結(jié)果的準確性，而測序結(jié)果也為這些研究成果提供依據(jù)。然而大部分差異表達miRNAs介導調(diào)控脂肪發(fā)育的生理功能仍不清楚，具體的分子機制有待深入研究。

最近，本課題組以150日齡瘦肉型大白豬和脂肪型梅山豬的背部脂肪組織為試驗材料，采用Solexa深度測序方法在兩樣品中共鑒定出215個成熟miRNAs[29]，其中9個miRNAs在兩樣品中存在極顯著差異，即miR-215、miR-224、miR-135和miR-146b在大白豬中高表達；miR-1a、miR-133a、miR-122、miR-204和miR-183在梅山豬中高表達。本小組后續(xù)的研究也證實miR-224[28]和miR-135[30]抑制前脂肪細胞分化和脂肪形成，而miR-183則具有相反的生理功能[31]。此研究結(jié)果不僅驗證了Solexa測序結(jié)果的準確性和可靠性，同時也為揭示miRNAs調(diào)控脂肪形成的表觀分子機制、剖析中外豬種肉質(zhì)性狀差異的遺傳機理提供了分子依據(jù)。

肌內(nèi)脂肪是影響豬肉品質(zhì)的主要性狀之一，對肌肉的嫩度、風味和多汁性具有重要的影響[32-33]。但肌內(nèi)脂肪在發(fā)育和代謝上都與其他脂肪組織存在很大差異[34-35]，其形成和調(diào)控機制仍不清晰?；诖耍琘.Guo等[36]分離得到豬的肌內(nèi)血管干細胞(IVSC)和皮下血管干細胞(SVSC)，采用Solexa測序比較了二者在成脂分化過程中miRNAs組(microRNAome)差異，并采用qPCR方法對其中一些miRNAs進行試驗驗證和組織表達譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了224個已知豬miRNAs和280個潛在miRNAs，其中54個miRNAs在IVSC和SVSC分化過程中具有相似的表達模式，10個miRNAs具有相反的表達模式。此研究結(jié)果為解析肌內(nèi)和皮下脂肪形成及差異分子機制提供新的理論依據(jù)。

4 miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究進展

2003年，人們在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)調(diào)控脂肪代謝的miRNA[37]，即miR-14。在隨后十年的研究過程中，學者們發(fā)現(xiàn)人和小鼠中越來越多的miRNAs在脂質(zhì)代謝過程中起著重要的調(diào)控作用，包括脂肪細胞分化、血脂代謝及胰島素抵抗和分泌等過程。而豬脂肪相關(guān)miRNAs的功能研究僅有零星報道(表1)。

表1 豬脂肪形成和脂質(zhì)代謝相關(guān)miRNAs

Table 1 miRNAs associated with adipogenesis and lipid metabolism in pigs

miRNAs功能Function靶基因Target參考文獻ReferencemiR?122膽固醇水平相關(guān)CAT1[26]miR?196a↑脂肪形成-[40]miR?103↑脂肪形成RAI14[27，44]miR?27a↓脂肪形成-[20]miR?143↑脂肪形成-[20]miR?145↓脂肪形成IRS1[52]miR?181↑脂肪形成TNFα[53]miR?33b↓脂肪形成EBF1[54]miR?199a?5p↓脂肪形成Cav1[58]miR?130b↓脂肪形成PPARγ[62，63]miR?374a/b-C/EBPβ[62，64]

↑.表示促進脂肪形成；↓.表示抑制脂肪形成

↑.Represents promotion of adipogenesis；↓.Represents inhibition of adipogenesis

4.1 miR-122

2005年，J.Krützfeldt等學者[38]利用反義寡核苷酸技術(shù)抑制miR-122后發(fā)現(xiàn)小鼠血漿膽固醇水平降低。另一項研究表明[25]，抑制小鼠miR-122導致血漿膽固醇水平降低、肝脂肪酸氧化增強、肝脂肪酸和膽固醇的合成速率降低。2010 年的研究發(fā)現(xiàn)，miR-122通過影響小鼠肝細胞SREBP1c、DGAT2、FAS和ACC1等基因的表達進而調(diào)控脂肪酸和甘油三酯的合成[39]。同年，S.Cirera實驗室[26]發(fā)現(xiàn)，飼喂高膽固醇日糧的哥廷根迷你豬的體重、總膽固醇及高密度脂蛋白水平顯著高于飼喂標準日糧組，而甘油三酯水平和miR-122表達量卻顯著低于飼喂標準日糧組。作者認為豬體重和膽固醇水平的增加與miR-122表達水平的降低有關(guān)，這與在小鼠中的研究報道一致。這些研究結(jié)果表明 miR-122 可能是治療膽固醇和脂肪酸代謝疾病的靶標。

4.2 miR-196a

2010年，寧小敏[40]首先對3日齡和180日齡長白豬的脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺和胰腺組織中的miR-196a進行時空表達譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-196a在7個組織中均有表達，3日齡仔豬中miR-196a在脂肪組織中的表達量最低(相對表達量約為0.57)，而180日齡大豬中miR-196a在脂肪組織中的表達量最高(相對表達量約為16.26)，暗示miR-196a可能調(diào)控豬的脂肪組織發(fā)育進程。因此，作者進一步分析了pcDNA3.0-miR-196a超表達載體對豬原代前脂肪細胞的增殖和分化的影響。結(jié)果顯示，miR-196a對豬前脂肪細胞的增殖沒有明顯影響，而脂肪細胞分化關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBPα和LPL的表達水平和脂滴積累較對照組明顯增加。2012年，J.M.Romao等[41]的研究指出，miR-196a在牛腎周脂肪組織中的表達量遠遠高于背部皮下脂肪組織，這說明miR-196a可能對維持脂肪庫的特異性起重要作用。然而miR-196a作用的具體分子機制并不明了，仍需進行深入研究。

4.3 miR-103

2011年，G.Li等[27]從杜洛克和斯格豬的雜交公豬后代中各選擇10頭3日齡仔豬和180日齡大豬為研究對象，發(fā)現(xiàn)，miR-103在兩時期豬的背部皮下脂肪組織、小腦和大腦等13個組織中廣泛表達。隨著背部皮下前脂肪細胞的分化，miR-103的表達量逐漸升高；反義抑制了miR-103抑制成脂基因(C/EBPα、PPARα、PPARγ和FABP4)的表達，阻礙了前脂肪細胞分化和甘油三酯積累。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，RAI14基因與miR-103的表達趨勢相反，即在前脂肪細胞分化過程中，RAI14基因的表達水平逐漸降低，蛋白印跡試驗證明RAI14為miR-103的靶基因。前期研究已證實，視黃酸誘導RAI14基因的表達、抑制豬前脂肪細胞的分化[42-43]，筆者推測miR-103可能通過靶向RAI14基因拮抗視黃酸對豬前體脂肪細胞分化的抑制作用，進而促進脂肪形成。

李美航等[44]將pre-miR-103腺病毒超表達載體感染豬原代前脂肪細胞后發(fā)現(xiàn)，成脂標記基因PPARγ和ap2的mRNA和蛋白質(zhì)表達量與對照組相比顯著升高，且觀察到明顯的脂滴生成。這說明miR-103可促進豬前脂肪細胞的發(fā)育，但遺憾的是作者并沒有對miR-103的作用靶標和調(diào)控通路進行分析和驗證。

4.4 miR-27a和miR-143

T.Wang等[20]應用miRNA“獲得”和“缺失”技術(shù)即轉(zhuǎn)染miRNA mimics和inhibitor研究miR-27a和miR-143對豬成熟脂肪細胞脂質(zhì)代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-27a促進甘油和游離脂肪酸的生成，抑制甘油三酯和脂滴的形成；而miR-143則抑制甘油和游離脂肪酸的生成，促進甘油三酯和脂滴的形成。研究表明，人和鼠中miR-27和miR-143調(diào)控脂肪代謝的研究結(jié)果與豬中一致。miR-27a/b靶向成脂關(guān)鍵基因PPARγ和線粒體膜電位相關(guān)基因prohibitin(PHB)，抑制人脂肪源多潛能干細胞和小鼠前脂肪細胞向成脂方向的分化和脂滴形成[45-48]；在山羊乳腺上皮細胞中也發(fā)現(xiàn)，miR-27a降低不飽和/飽和脂肪酸比例、下調(diào)脂肪合成相關(guān)基因(PPARγ、SCD和DGAT1)的表達、抑制甘油三酯積累[49]；miR-143靶向結(jié)合pleiotrophin(PTN)基因的編碼區(qū)從而促進小鼠3T3-L1前脂肪細胞的分化和脂肪聚積[50]；大鼠脂肪源基質(zhì)細胞的生長抑制階段或終末分化階段異位表達miR-143促進脂肪形成，miR-143的這種調(diào)控作用是通過直接靶向MAPK2K5，抑制MAP2K5-ERK5信號通路實現(xiàn)的[21]。

4.5 miR-145

前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-145在240日齡榮昌大豬背脂中的表達量顯著高于7日齡榮昌仔豬[24]；隨著小鼠前脂肪細胞[51]、豬肌內(nèi)血管干細胞(IVSC)和皮下血管干細胞(SVSC)[36]的成脂分化，miR-145的表達量顯著上調(diào)，表明miR-145可能調(diào)控脂肪細胞發(fā)育和脂肪形成。隨后Y.Guo等[52]首先利用“天花板”法培養(yǎng)豬的去分化前脂肪細胞(DFAT)，再將轉(zhuǎn)染ssc-miR-145慢病毒載體的DFAT細胞進行誘導分化，觀察miR-145對DFAT細胞成脂分化程度的影響。結(jié)果表明，隨著DFAT細胞的分化，miR-145的表達量逐漸升高。脂肪細胞分化過程中上調(diào)表達的miRNA可促進脂肪形成。此研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-145抑制成脂關(guān)鍵基因(C/EBPα和PPARγ2)的表達和脂滴積累，蛋白印跡和熒光素酶試驗證明胰島素信號通路關(guān)鍵基因IRS1是miR-145的直接靶標，miR-145可能通過靶向IRS1基因阻斷胰島素信號通路對成脂的促進作用。

4.6 miR-181

前期研究顯示，miR-181在小鼠前脂肪細胞分化過程中的表達量顯著升高[51]；在高脂日糧飼喂的牛背部皮下和腎周脂肪組織中，miR-181的表達量顯著下調(diào)，暗示miR-181可能調(diào)控脂肪形成[41]。隨后H.Li等[53]對miR-181調(diào)控豬脂肪細胞發(fā)育的功能進行研究。結(jié)果顯示，超表達miR-181上調(diào)豬前脂肪細胞中脂肪合成相關(guān)基因(PDE3B、LPL、PPARγ、GLUT1、GLUT4、adiponectin和FAS)的表達、加速脂滴積累、增加甘油三酯含量；且TNF-α是miR-181的靶基因，過表達TNF-α能夠拮抗miR-181的促成脂作用。因此，筆者認為miR-181通過靶向TNF-α基因，調(diào)控下游脂肪相關(guān)基因的表達，進而參與調(diào)控脂肪形成。

4.7 miR-33b

最新的研究結(jié)果顯示[54]，miR-33b靶向成脂激活因子EBF1，抑制脂肪標記基因(C/EBPα、PPARγ、ap2、CD36、adiponectin、SCD1和FAS)的表達，推遲豬前脂肪細胞的成脂分化，抑制甘油三酯的生成和脂滴積累[54]。此外，研究者以5月齡瘦肉型長×(杜長大)和脂肪型梅山×(杜長大)雜交母豬為研究對象，對背膘厚、血液甘油三酯含量和皮下脂肪組織中的miR-33b、成脂基因的表達水平進行測定。結(jié)果表明，miR-33b在瘦肉型雜交豬中高表達，其他測定基因則在脂肪型雜交豬中高表達，這也間接支持了miR-33b抑制脂肪形成這一研究結(jié)果。然而，在豬前脂肪細胞分化過程中和瘦肉型、脂肪型雜交豬皮下脂肪組織中，miR-33b宿主基因SREBF1的表達幾乎沒有差異，這與miR-33b的表達趨勢不一致，也與人中的研究結(jié)果截然不同[55]，這可能與研究的物種和組織的不同有關(guān)。研究也已證實，miR-33a/b協(xié)同宿主基因SREBP共同調(diào)控膽固醇輸出及轉(zhuǎn)運、脂肪酸代謝和胰島素信號通路[56-57]。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，豬C/EBPα和PPARγ基因的啟動子區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子EBF1的結(jié)合位點，然而轉(zhuǎn)錄因子EBF1是否結(jié)合并調(diào)控C/EBPα和PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄以及miR-33b是否調(diào)控豬膽固醇代謝仍值得深入研究。

4.8 miR-199a-5p

X.E.Shi等[58]發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p在豬皮下脂肪組織中的表達量遠遠高于心、肝、脾、肺、腎和肌肉，且其在豬前體脂肪細胞分化過程中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，這與小鼠3T3-L1前脂肪細胞分化過程中miR-199a-5p的表達模式是一致的[59]。另外，miR-199-5p在7日齡榮昌仔豬背部脂肪組織中的表達量顯著高于240日齡榮昌大豬[24]。這些都表明，miR-199a-5p可能在豬皮下脂肪組織中發(fā)揮功能。進一步的研究顯示，miR-199a-5p促進豬前體脂肪細胞的增殖，抑制成脂標記基因(PPARγ、ap2、perilipinA、LPL和FAS)的表達和脂滴的積累。miR-199a-5p的這種生理功能可能是通過靶向Cav1介導調(diào)控PI3K/Akt通路和脂滴的轉(zhuǎn)運、貯存來實現(xiàn)的[58]。此外，在人骨髓源間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化過程中，miR-199a的表達量顯著下調(diào)，在干細胞中過表達miR-199a可以抑制成脂標記基因FABP4的表達[60]，這與miR-199a-5p在豬中的研究結(jié)果相符。

4.9 miR-130b和miR-374b

早在2010年，E.K.Lee等[61]對miR-130在人和小鼠前脂肪細胞中的功能進行了系統(tǒng)研究。試驗證明，miR-130a/b靶向成脂關(guān)鍵基因PPARγ，抑制leptin、adiponectin、LPL和FABP4等脂肪標記基因的表達，從而阻礙脂肪細胞分化和甘油三酯積累。直到2013年，科研人員首次在豬中對miR-130調(diào)控脂肪的形成進行功能研究。S.Pan等[62]利用低蛋白日糧飼喂妊娠期和哺乳期梅山母豬來研究miRNAs對后代仔豬脂質(zhì)代謝的影響。結(jié)果表明，低蛋白日糧組斷奶仔豬的體重和背膘厚顯著低于標準蛋白日糧組，背脂中miR-130b和miR-374b的表達量顯著高于標準蛋白日糧組，且miR-130b和miR-374b分別靶向抑制PPARγ和C/EBPβ基因的表達。隨后該學者又將miR-130b包裝進入微泡，并用此微泡處理豬前脂肪細胞(即受體細胞)，同時進行成脂誘導分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體細胞能夠超表達miR-130b；miR-130b通過靶向PPARγ下調(diào)脂肪形成基因(FAS、perilipin、FTO和GR)的表達、促進脂解基因(HSL)的表達，從而抑制豬脂肪細胞中甘油三酯形成[63]，這為治療糖尿病的臨床應用提供了新的方法和思路。

2013年，S.Pan課題組的研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松(DEX)促進豬前脂肪細胞PPARγ的表達和脂肪形成，且地塞米松處理的細胞中miR-374a和miR-374b的表達上調(diào)，而C/EBPβ基因的表達下調(diào)，進一步分析證實C/EBPβ為miR-374a/b的靶基因[64]，這與其另一項研究報道[62]相符。然而在其他物種中，miR-374調(diào)控脂肪形成的研究并未見報道，僅見miR-374表達差異的研究，如miR-374a/b在高脂日糧飼喂的牛背部皮下和腎周脂肪組織中的表達量顯著上調(diào)[41]、miR-374b在人成熟脂肪細胞中的表達量顯著降低[61]。因此，miR-374a/b對前脂肪細胞的成脂分化和脂肪形成的調(diào)控作用仍值得繼續(xù)深入探討。

5 豬脂肪相關(guān)miRNAs功能研究的不足與問題

由以上可以看出，近幾年科學家們發(fā)現(xiàn)越來越多的miRNAs調(diào)控豬的脂肪形成及代謝，但是其功能研究仍存在許多不足之處：①大多脂肪相關(guān)miRNAs的功能研究在人或小鼠中已經(jīng)報道，在豬中只是簡單的重復；②只是研究miRNAs對脂肪細胞分化和脂肪形成的作用，并沒有對其具體的調(diào)控機制進行深入分析，即只停留在“表象”，沒有深入到“本質(zhì)”；③即使對miRNAs的調(diào)控機制和作用靶基因進行論證，但試驗設計并不嚴謹。人們知道同一miRNA可靶向作用多個靶標，只通過蛋白印跡和雙熒光素酶試驗并不能說明miRNA就是通過此基因來介導調(diào)控脂肪形成。如果再增加補償試驗(在超表達miRNA的基礎上過表達靶基因)將會更有說服力。因此，與小鼠中相比，豬中脂肪相關(guān)miRNAs的功能研究并不徹底，仍值得繼續(xù)深入研究。

另外，利用傳統(tǒng)方法分離得到的豬脂肪基質(zhì)微管中除含有前脂肪細胞外，還存在大量的血紅細胞、平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞。此種方法獲得的豬前脂肪細胞的純度不高，需要經(jīng)過其他方法去除這些雜細胞，程序繁雜，且不利于精細研究前脂肪細胞的分化機制。本課題組在實際操作過程中也發(fā)現(xiàn)分離的豬前脂肪細胞貼壁較少，增殖速度慢，易自分化形成脂滴，且消化傳代后細胞易變形。這些都局限了豬前脂肪細胞分化和脂肪形成的研究，堪稱豬脂肪相關(guān)miRNAs功能研究的“瓶頸”。而依靠“天花板”法建立的高純度、高分化率、低成本的豬前脂肪細胞系或許可作為一種商品化的細胞系，為進一步揭示脂肪細胞分化和脂肪形成機制奠定基礎。

6 展 望

豬的脂肪蓄積能力極強，比嚙齒類動物更適合于哺乳動物脂肪組織發(fā)育的研究[13，65-66]，并且豬在親緣關(guān)系上比小鼠更接近人類，在生理學、解剖學和病理學等方面與人類極其相似[67-68]。因此，豬逐漸成為生物和醫(yī)學研究的重要模式生物。隨著研究的不斷深入，今后的研究重心勢必將從豬miRNAs的挖掘鑒定轉(zhuǎn)向其功能探索，進一步分析闡釋miRNAs發(fā)揮作用的調(diào)控網(wǎng)絡和信號通路。相信不久以后，miRNAs將在調(diào)控豬生長發(fā)育和改良肉質(zhì)性狀等方面具有突破性進展，同時也為肥胖和糖尿病等相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供新的思路。

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(編輯 郭云雁)

Progress on the Research of miRNAs Associated with Fat Development in Pigs

CHEN Chen*，HU Xiong-gui，ZHU Ji，REN Hui-bo，DENG Yuan，PENG Ying-lin*

(HunanInstituteofAnimalandVeterinaryScience，Changsha410131，China)

Adipose tissue，an important factor that affects the porcine carcass quality，is closely related with the pork quality.Understanding the regulation mechanisms of adipose tissue development and fat metabolism are important to the animal husbandry production and disease treatment.miRNAs(microRNAs) are a class of endogenous，non-coding，small RNA molecules，which are typically 18-24 nucleotides(nt) in length.miRNAs play an important role in the regulation of gene expression at the post-transcriptional level.A large number of evidences demonstrated that miRNAs have influence on diverse biological processes，such as preadipocyte differentiation，adipogenesis，fatty acid metabolism and cholesterol biosynthesis.However，only 326 porcine miRNAs has been currently reported and rare studies could be read about the porcine miRNAs that regulate the fat development.Herein，it is reviewed that the studies on the discovery and identification of fat-associated miRNAs in pigs in this paper，and the progress on the research of porcine miRNAs that regulate fat development are also summarized.

pig；fat development；miRNAs；regulation mechanism

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.001

2014-06-09

國家自然科學基金(31401097)；湖南省科技計劃項目(2014NK3036)

陳 晨(1986-)，男，河南開封人，助理研究員，博士，主要從事豬分子遺傳育種的研究，Tel：0731-84611058

*通信作者：陳 晨，助理研究員，E-mail：2004chch@163.com；彭英林，研究員，E-mail：ylpeng_1965@163.com

S828；S813.3

A

0366-6964(2015)12-2117-10