塞來昔布和埃羅替尼對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的協(xié)同抑制作用

陳 曦，付曉霏，趙 逵

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州遵義563000；2.婁底市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南417000）

塞來昔布和埃羅替尼對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的協(xié)同抑制作用

陳 曦1，付曉霏2，趙 逵1

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州遵義563000；2.婁底市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南417000）

目的 探討表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）抑制劑及環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑埃羅替尼、塞來昔布及二者聯(lián)合用藥對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的抑制作用及其機(jī)制。方法 將HT-29細(xì)胞分為對(duì)照組（完全培養(yǎng)基）、塞來昔布組（220μmol/L）、埃羅替尼組（50μmol/L）及聯(lián)合用藥組（塞來昔布220μmol/L、埃羅替尼50μmol/L）四組，作相應(yīng)處理后均在適宜條件下培養(yǎng)；48 h后采用MTT法觀察細(xì)胞抑制率，Real-time PCR法及Western blotting法檢測(cè)EGFR、COX-2mRNA及蛋白表達(dá)情況，ELISA法檢測(cè)前列腺素E2（PGE2）含量。結(jié)果 48 h后塞來昔布組和埃羅替尼組對(duì)HT-29細(xì)胞抑制率分別為（56.6±4.3）%和（56.9±3.9）%，聯(lián)合用藥組抑制率為（86.1±7.1）%，與單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）；與對(duì)照組比較，埃羅替尼組、塞來昔布組均能降低HT-29細(xì)胞中COX-2及EGFR的mRNA及蛋白表達(dá)水平，也可降低HT-29細(xì)胞PGE2的分泌，且聯(lián)合用藥組效果較單一用藥組更顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 塞來昔布和埃羅替尼均能抑制結(jié)腸腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)，可同時(shí)阻斷EGFR、COX-2信號(hào)通路，二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，其機(jī)制可能是抑制EGFR、COX-2的表達(dá)及PGE2的分泌。

受體，表皮生長(zhǎng)因子； 前列腺素內(nèi)過氧化物合酶類； 抗腫瘤藥； 結(jié)腸腫瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞抑制劑

目前治療結(jié)腸癌的新熱點(diǎn)是尋求多靶點(diǎn)治療[1]。塞來昔布（celecoxib）是一種選擇性的環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑，屬非甾體抗炎昔布類藥物，1999年被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）首肯用于臨床治療骨關(guān)節(jié)炎和家族性息肉病，現(xiàn)已被用于結(jié)腸癌Ⅲ期的臨床預(yù)防試驗(yàn)[2]。埃羅替尼（erlotinib）是一種小分子表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑，屬喹唑啉類，近年對(duì)埃羅替尼抑制腫瘤的研究主要集中在肺癌、胰腺癌方面[3]。但塞來昔布及埃羅替尼聯(lián)合使用是否能協(xié)同抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖尚不清楚。本研究觀察了塞來昔布同埃羅替尼聯(lián)合使用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的影響，分析其可能機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（Hyclone公司）；胰蛋白酶與MTT、McCoy′S5A培養(yǎng)基（Sigma公司）；塞來昔布（北京貝科里生物科技有限公司）；埃羅替尼（上海英軒醫(yī)藥科技有限公司）；Trizol試劑及LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑（Takara公司）；山羊抗人COX-2多克隆抗體、小鼠抗人EGFR單克隆抗體、小鼠抗人βactin多克隆抗體（Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG及兔抗山羊IgG（中杉金橋公司）；ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的McCoy′S 5A培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)消化傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 將細(xì)胞分為對(duì)照組（加完全培養(yǎng)液）、塞來昔布組（220μmol/L）、埃羅替尼組（50μmol/L）及聯(lián)合用藥組（塞來昔布220μmol/L、埃羅替尼50μmol/L）四組，分別處理后于適宜條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將各組細(xì)胞常規(guī)消化后吹散成單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后加藥，每組重復(fù)6孔，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT溶液20μL，結(jié)束后棄上清液、加DMSO 150μL、震蕩10min，充分溶解其中的結(jié)晶顆粒，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm波長(zhǎng)處光密度（OD）值。抑制率=（1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)金正均法[4]，藥物之間有無相互作用需通過q值判斷，q＞1是協(xié)同效應(yīng)，q=1是相加效應(yīng)，q＜1是拮抗效應(yīng)。

1.2.3.2 COX-2、EGFRmRNA表達(dá)情況 按Trizol試劑使用說明書提取各組細(xì)胞總RNA，采用Real-time PCR法檢測(cè)COX-2、EGFRmRNA的表達(dá)。PCR引物均由北京賽百盛公司合成。EGFR引物序列：上游5′-ACCACGTACCAGATGGATGTGAAC-3′，下游5′-GAGCCGTGATCTGTCACCACATA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度101 bp；COX-2引物序列：上游5′-CTGGAACATGGAATTACCCAGTTTG-3′，下游5′-TGGAACATTCCTACCACCAGCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度81 bp。擴(kuò)增條件（參照說明書）：37℃15min，85℃5 s。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：95℃8min，95℃15 s，61.3℃1min，40個(gè)循環(huán)；55℃15 s，80個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 COX-2、EGFR蛋白表達(dá)情況 采用Western blotting法檢測(cè)。提取出各組細(xì)胞的總蛋白（采用RIPA裂解液），測(cè)定其濃度（BCA法），繼上樣（每孔40μg）后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（COX-2采用10%分離膠、EGFR采用6%分離膠）、轉(zhuǎn)膜及封閉；然后采用山羊抗人COX-2多克隆抗體（1∶200）或者小鼠抗人EGFR單克隆抗體（1∶200）、小鼠抗人β-actin多克隆抗體（1∶1 000）；4℃冰箱孵育過夜后洗膜3次，分別加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗[兔抗山羊IgG（1∶500）、山羊抗小鼠IgG（1∶2 000）]常溫下孵育1.5 h后洗膜，用濾紙吸干，應(yīng)用魯米諾（Luminol）顯色，X線膠片于暗室中曝光；最后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.4 ELISA法測(cè)定前列腺素E2（PGE2）含量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，用人PGE2 ELISA試劑盒按照說明書操作，檢測(cè)450 nm處各組細(xì)胞對(duì)應(yīng)OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PGE2的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各處理對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用比較 塞來昔布組和埃羅替尼組對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率為（56.6± 4.3）%和（56.9±3.9）%，聯(lián)合用藥組抑制率為（86.1±7.1）%；與單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合用藥組對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），見圖1。本實(shí)驗(yàn)q=1.055＞1，表明塞來昔布與埃羅替尼對(duì)HT-29細(xì)胞有協(xié)同抑制作用。

圖1 各處理組對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制比較

2.2 各組COX-2及EGFRmRNA表達(dá)情況比較 塞來昔布組與埃羅替尼組COX-2與EGFRmRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），聯(lián)合用藥組COX-2、EGFRmRNA表達(dá)水平均低于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組COX-2、EGFRm RNA表達(dá)情況比較

2.3 各組COX-2、EGFR蛋白表達(dá)情況比較 HT-29細(xì)胞中COX-2、EGFR均呈陽性表達(dá)；塞來昔布、埃羅替尼組及聯(lián)合用藥組COX-2與EGFR的表達(dá)水平低于對(duì)照組，且聯(lián)合用藥組低于埃羅替尼組及塞來昔布組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖3、4，與Real-time PCR結(jié)果基本一致。

圖3 各組COX-2、EGFR蛋白表達(dá)情況

圖4 各組COX-2、EGFR蛋白表達(dá)情況

2.4 PGE2的表達(dá)情況 塞來昔布、埃羅替尼均能抑制PGE2的合成，塞來昔布組抑制作用較強(qiáng)，聯(lián)合用藥組較單獨(dú)用藥組濃度降低更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組對(duì)HT-29細(xì)胞PGE2分泌的影響

3 討 論

腫瘤的進(jìn)展過程涉及多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控，而開發(fā)多靶點(diǎn)的定向治療已逐漸成為治療腫瘤的重要研究方向[5]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR及COX-2是結(jié)腸癌潛在的治療靶點(diǎn)分子，阻斷EGFR和COX-2雙靶點(diǎn)可起到協(xié)同抑制腫瘤的效應(yīng)[6]。

EGFR是一種跨膜受體，是原癌基因 c-ErbB-1（HER-1）的表達(dá)產(chǎn)物，具酪氨酸激酶活性，EGFR通路活性增高可促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的生長(zhǎng)侵襲[7]。結(jié)腸癌患者中EGFR表達(dá)的陽性率為65%～70%[8]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（TGF-α）或表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與EGFR結(jié)合后，已知自身磷酸化因激活酪氨酸激酶所致，DNA的復(fù)制增加及細(xì)胞生長(zhǎng)增殖均繼發(fā)于細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活[9]。COX-2是一種前列腺素合成過程中必需的限速酶，能促細(xì)胞增殖及腫瘤相關(guān)血管形成，在腫瘤進(jìn)展中十分重要。COX-2促結(jié)腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制為：（1）過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤新生血管生成及腫瘤細(xì)胞增殖；（2）使腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制；（3）通過抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及巨噬細(xì)胞的活化來抑制抗腫瘤免疫監(jiān)視機(jī)制[10]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR與COX-2之間存在交叉信號(hào)通路，惡性腫瘤組織中COX-2及EGFR 2條途徑可被同時(shí)激活[11]。Lippman等[12]研究表明，PEG2由COX-2催化合成，其能同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及激活EGFR，并啟動(dòng)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)途徑來傳遞信息，通過核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）途徑來促進(jìn)COX-2表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

塞來昔布是一種COX-2選擇性抑制劑，可干擾腫瘤細(xì)胞合成PGE2，顯著遏制了結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展[2]。埃羅替尼是一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其促進(jìn)細(xì)胞凋亡及阻止細(xì)胞增殖均通過選擇性阻斷EGFR酪氨酸激酶，實(shí)現(xiàn)降低EGFR自身的磷酸化作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，埃羅替尼及塞來昔布均可抗增殖及促凋亡，二者具有疊加效應(yīng)。Buchanan等[13]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合塞來昔布和埃羅替尼治療可預(yù)防ApcMin/+小鼠形成息肉，對(duì)裸鼠皮下移植瘤的抑制作用優(yōu)于單獨(dú)用藥。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組和埃羅替尼組、塞來昔布組比較，HT-29細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，聯(lián)合用藥組、塞來昔布組、埃羅替尼組的COX-2、EGFRmRNA及蛋白表達(dá)較比對(duì)照組降低，聯(lián)合用藥組COX-2、EGFRmRNA及蛋白的表達(dá)均比單一用藥組降低，提示二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制作用。

PGE2具有廣泛生理活性，其與多種腫瘤的發(fā)病有關(guān)。PGE2可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）與磷脂酰基醇-3激酶（PI3K）信號(hào)途徑活化腫瘤抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（bcl-2）基因的表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能通過β-catenin途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。活化蛋白1介導(dǎo)的COX-2轉(zhuǎn)錄是因 EGFR信號(hào)激活導(dǎo)致MAPK活性增加，可促進(jìn)PGE2合成。Siena等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PGE2可以激活EGFR，MAPK的活化及細(xì)胞增殖可完全通過使用EGFR抑制劑來阻斷。Rosas等[16]認(rèn)為，COX-2的活性受塞來昔布抑制，從而使PGE2的數(shù)量減少，也抑制了EGFR信號(hào)通路激活。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組、單一用藥組的PGE2蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組降低，但聯(lián)合用藥組的PGE2蛋白表達(dá)又較埃羅替尼組及塞來昔布組下降，說明二者聯(lián)合具有協(xié)同作用，同時(shí)增強(qiáng)了對(duì)COX-2及EGFR 2條途徑的抑制。聯(lián)合用藥比單一用藥具更顯著的腫瘤抑制作用，且作用劑量在機(jī)體能耐受的不良反應(yīng)劑量之內(nèi)。

綜上所述，塞來昔布及埃羅替尼聯(lián)合應(yīng)用能顯著降低人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中EGFR、COX-2mRNA及蛋白的表達(dá)，也可降低PGE2的表達(dá)水平，且具有顯著疊加作用，可抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。二者聯(lián)合應(yīng)用同時(shí)阻斷COX-2與EGFR 2條信號(hào)途徑可能是治療結(jié)腸癌的潛在有效途徑之一。

參考文獻(xiàn)

[1]Rolfo C，Bronte G，Sortino G，et al.The role of targeted therapy for gastrointestinal tumors[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2014，8（8）：875-885.

[2]BenelliR，VenèR，MinghelliS，etal.Celecoxib inducesproliferation and Amphiregulin production in colon subepithelialmyofibroblasts，activating erk1-2 signaling in synergy with EGFR[J].Cancer Lett，2013，328（1）：73-82.

[3]Mendoza L.Targeted therapies in the treatmentofadvanced non-smallcell lung cancer：update[J].Klin Onkol，2009，22（4）：131-138.

[4]金正均.合并用藥中的相加[J].中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1980，1（2）：70-76.

[5]Ghosh N，ChakiR，Mandal V，etal.COX-2 as a target for cancer chemotherapy[J].PharmacolRep，2010，62（2）：233-244.

[6]Jalili A，Pinc A，Pieczkowski F，etal.Combination of an EGFR blocker and a COX-2 inhibitor for the treatmentofadvanced cutaneoussquamous cellcarcinoma[J].JDtsch DermatolGes，2008，6（12）：1066-1069.

[7]Krasinskas AM.EGFR signaling in colorectal carcinoma[J].Patholog Res Int，2011：932.

[8]Stintzing S，Heinemann V，Moosmann N.The treatmentof colorectal carcinoma with monoclonal antibodies：the importance of KRASmutation analysisand EGFR status[J].Dtsch Arztebl Int，2009，106（12）：202-206.

[9]Shepard HM，Brdlik CM，Schreiber H.Signal integration：a framework for understanding the efficacy of therapeutics targeting the human EGFR family[J].JClin Invest，2008，118（11）：3574-3581.

[10]Smakman N，KranenburgO，Vogten JM，etal.Cyclooxygenase-2 isa targetof KRASD12，which facilitates the out growth ofmurine C26 colorectal livermetastases[J].Clin Cancer Res，2005，11（1）：41-48.

[11]Hsia TC，Tu CY，Chen YJ，et al.Lapatinib-mediated cyclooxygenase-2 expression viaepidermalgrowth factor receptor/HuR interaction enhances theaggressivenessof triple-negativebreast cancer cells[J].Mol Pharmacol，2013，83（4）：857-869.

[12]Lippman SM，Gibson N，Subbaramaiah K，etal.Combined targetingof the epidermalgrowth factor receptor and cyclooxygenase-2 pathways[J].Clin CancerRes，2005，11（17）：6097-6099.

[13]Buchanan FG1，Holla V，KatkuriS，etal.Targeting cyclooxygenase-2 and the epidermal growth factor receptor for the prevention and treatment of intestinalcancer[J].Cancer Res，2007，67（19）：9380-9388.

[14]Wang D，DuBois RN.An inflammatory mediator，prostaglandin E2，in colorectalcancer[J].Cancer J，2013，19（6）：502-510.

[15]Siena S，Sartore-Bianchi A，Di Nicolantonio F.Biomarkers predicting clinical outcome of epidermal growth factor receptor-targeted therapy in metastaticcolorectal cancer[J].JNatl Cancer Inst，2009，101（19）：1308-1324.

[16]Rosas C，Sinning M，F(xiàn)erreira A，et al.Celecoxib decreases growth and angiogenesisand promotesapoptosis in a tumor cell line resistant to chemotherapy[J].BiolRes，2014，47（1）：27.

Synergistic inhibitory effect of celecoxib and erlotinib on the proliferation of colorectal cancer cells

Chen Xi1，F(xiàn)u Xiaofei2，Zhao Kui1
（1.DepartmentofDigestion，the Affiliated Hospitalof ZunyiMedicalUniversity，Zunyi，Guizhou 563000，China；2.DepartmentofDigestion，LoudiCentralHospital，Hunan 417000，China）

Objective To investigate the synergistic inhibitory effectof EGFR and COX-2 inhibitors named celecoxib and erlotinib or its combinationson the proliferation of colorectal cancer cell lines HT-29 and its possiblemechanism.M ethods The HT-29 cellswere divided into four groups such as the controlgroup（completemedium），the celecoxib group（220μmol/L），the erlotinib group（50μmol/L）and the combination group（220μmol/L celecoxib，50μmol/L erlotinib）according to different medications，all of which were cultivated under appropriate environments.It adopted MTT assay to observe the cell inhibitory rate，Real-time PCR and Western blotting assays to detect the expressionsof EGFR，COX-2mRNA and proteinand ELISA assay to measure the contentof PGE2 after48 hours.Results The inhibition rateson HT-29 cells in the celecoxib group and the erlotinib group after48 hourswere（56.6±4.3）%and（56.9±3.9）%respectivelywhile the combination group being（86.1±7.1）%，the proliferation ofHT-29 cellwas inhibited in the combination groupmore apparently than in the celecoxib group and erlotinib group，which had statistically significantdifference（P<0.05 or0.01）；comparedwith the controlgroup，both the celecoxib group and theerlotinib group were reduced COX-2 in the HT-29，mRNA of EGFR and expression level of protein，aswell as PGE2 secretion of HT-29 cells.The combination group wasmore significant than the single group in effect，all ofwhich had statistical significance in dif ference（P<0.01）.Conclusions Celecoxib and erlotinibmay depress thegrowth ofcolorectalcancercell lines，block the communication paths of EGFR and COX-2 simultaneously，both ofwhich have a synergistic inhibitory effect，whose possiblemechanism may be inhibitexpression of EGFR，COX-2 and secretion ofPGE2.

Receptor，epidermal growth factor； Prostaglandin-endoperoxide synthases； Antineoplastic agents；Colonic neoplasms； Cellproliferation； Cytostatic agents

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.002

A

1009-5519（2015）09-1283-04

2015-01-26）

貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)基金資助（TZJF-2011-32）。

陳曦（1988-），女，江蘇連云港人，在讀碩士研究生，主要從事大腸癌的研究；E-mail：389173850@qq.com。

趙逵（E-mail：zhaok0852@126.com）。