紫外-氯化鋰復(fù)合誘變哈茨木霉產(chǎn)生多菌靈抗藥性菌株的研究

于春生，張雨竹，張風(fēng)嬌，宋志儒，楊 月，孫冬梅＊，李 敏

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，南昌 330013）

木霉（Trichodermaspp.）是一類重要的生防菌［1］，至少對18個屬29種植物病原真菌有拮抗作用，一些木霉菌株已被開發(fā)出木霉制劑，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。哈茨木霉（T.harzianum）是木霉屬中常見種，可定殖于植物根部，降低根際有害菌群及有毒化合物的活性，并能夠溶解土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物對養(yǎng)分的吸收，提高氮的利用率，從而促進(jìn)植物生長，提高作物產(chǎn)量［2-3］。哈茨木霉對植物病原真菌具有重寄生作用、抗生作用、競爭作用，并能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性［4］，被認(rèn)作是最具潛力的生物防治因子之一［5］。就目前國內(nèi)農(nóng)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r來看，生物農(nóng)藥還無法完全代替化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)殺菌劑還占據(jù)很大的市場［6］。多菌靈是一種苯并咪唑類廣譜性化學(xué)殺菌劑，對多種由真菌（如半知菌、子囊菌）引起的作物病害有防治效果，是目前廣泛應(yīng)用的化學(xué)農(nóng)藥之一。作為生防微生物，哈茨木霉野生型菌株在噴施和殘留多菌靈的環(huán)境中存活不理想，因此無法發(fā)揮其生防作用。本研究采用紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變法［7］，誘導(dǎo)哈茨木霉產(chǎn)生對多菌靈的抗性，使之既不受多菌靈影響，又能發(fā)揮生防作用，達(dá)到防治植物病害的同時有效減少多菌靈的使用，減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的危害［8］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

拮抗菌哈茨木霉（T.harzianum）菌株hc，病原菌立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）、茄鐮孢菌（Fusariumsolani）、核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）和茄鏈格孢菌（Alternariasolani），均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院提供。

1.1.2 供試藥劑

25%多菌靈可濕性粉劑，山東鄉(xiāng)村生物科技有限公司。

1.1.3 試驗儀器

DL-CJ-2N醫(yī)用型潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；電子天平；BA310Motic數(shù)碼顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基制作

PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1 000mL、瓊脂粉15g，pH 自然；藥物培養(yǎng)基：PSA 培養(yǎng)基中加入一定濃度的25%多菌靈可濕性粉劑；誘變培養(yǎng)基：在含多菌靈的藥物培養(yǎng)基中加入定量氯化鋰。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉的耐藥性測定

采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法［9］，稱取多菌靈，加無菌水配成濃度為24、36、60、72、84μg／mL的母液，待PSA培養(yǎng)基（每三角瓶59mL）冷卻至50 ℃左右時分別加入1 mL上述濃度的母液，使培養(yǎng)基中多菌靈的最終濃度達(dá)到0.4、0.6、1.0、1.2、1.4mg／L，充分混勻后，均勻倒入3個平皿中。以加入等量無菌水的PSA 培養(yǎng)基作對照。培養(yǎng)基凝固后用直徑5mm［16］的打孔器切取哈茨木霉菌碟，菌絲面朝下［11］接種于含不同濃度多菌靈平板培養(yǎng)基中央，將各處理置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，十字交叉法［12］測量菌落直徑，計算抑菌率。

以多菌靈濃度對數(shù)值為自變量（x），相對抑制率的幾率值為因變量（y），線性回歸法求出毒力回歸方程和決定系數(shù)。由毒力回歸方程，令y＝5（即抑制率為50%的幾率值），查反常用對數(shù)表得出的x值即為有效抑制中濃度EC50［13］。

1.2.2 哈茨木霉的氯化鋰-紫外復(fù)合誘變以及突變菌株的篩選

在PSA 平板培養(yǎng)基上接種哈茨木霉出發(fā)菌株hc，25℃培養(yǎng)7d，待產(chǎn)生大量綠色孢子后，用移液槍吸取無菌水沖洗孢子，制成孢子懸浮液，利用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)量，并稀釋至106個／L［14］。以單獨進(jìn)行紫外照射與氯化鋰誘變時致死率分別為80%［15］左右的劑量進(jìn)行復(fù)合誘變。將菌懸液置于20 W 紫外燈下30cm 處照射3min，避開其他光源［13］，然后在紅燈下取0.1 mL 菌懸液涂布于含有0.01%氯化鋰，3 mg／L多菌靈的平板上，共涂150個平板；同時取0.1 mL未經(jīng)紫外線照射的菌懸液涂布于不含氯化鋰和多菌靈的平板上作為對照，對照涂5個平板，用黑紙包好平板在避光條件下培養(yǎng)［16］。計算正突變率。

正突變率（%）＝含藥平板中突變菌株菌落個數(shù)／未做任何處理不含藥平板中出發(fā)菌株菌落個數(shù)×稀釋倍數(shù)×100。

培養(yǎng)5d后，選取含藥平板上長出的直徑大于1cm的菌落，打取直徑5 mm 的菌碟接于含多菌靈濃度更高（3.5 mg／L）的PSA 平板上，25℃恒溫培養(yǎng)，最終選出生長速率最快的菌落即為抗藥性最強(qiáng)菌株［17］，編號為hcb-35。

1.2.3 突變菌株抗藥能力檢測

利用菌絲生長速率法檢測多菌靈對抗性突變株hcb-35有效抑菌中濃度，有效中濃度計算方法同1.2.1。

1.2.4 哈茨木霉突變株hcb-35的抗藥遺傳穩(wěn)定性

將篩選出的哈茨木霉突變菌株hcb-35 接種于PSA 平板上，每7d傳代1次，連續(xù)轉(zhuǎn)接12次，每3代進(jìn)行1次抗藥性測定，分別標(biāo)記為hcb-35-3、hcb-35-6、hcb-35-9、hcb-35-12，以hcb-35菌株作對照，比較傳代過程中多菌靈對其有效抑菌中濃度的變化。

1.2.5 哈茨木霉出發(fā)菌株及突變株與病原菌的拮抗試驗

采用平板對峙培養(yǎng)法。分別從培養(yǎng)3d的哈茨木霉出發(fā)菌株hc、突變菌株hcb-35和病原菌上打取直徑5mm 的菌碟，并將拮抗菌與病原菌菌碟放置于經(jīng)過平皿圓心相距4cm［18］的位置上進(jìn)行對峙培養(yǎng)，同時設(shè)只接病原菌的培養(yǎng)皿作對照，每處理3次重復(fù)，置于25 ℃溫箱中培養(yǎng)。逐日觀察病原菌和哈茨木霉的生長狀況。待對照菌落長滿皿后測量處理病原菌菌落半徑，計算抑菌率。

I代表抑菌率，C為對照皿中病原菌菌落半徑，T為病原菌指向哈茨木霉菌落的半徑［19］。當(dāng)兩菌落接觸后，觀察記錄哈茨木霉對病原菌的抑制、包圍、侵入并占領(lǐng)病原菌營養(yǎng)空間的過程。統(tǒng)計哈茨木霉對病原菌的拮抗系數(shù)，拮抗系數(shù)的分級標(biāo)準(zhǔn)［20］如下：

1級：木霉菌絲面積占據(jù)100%平皿面積；2級：2／3平皿面積≤木霉菌絲面積＜100%平皿面積；3級：1／3平皿面積≤木霉菌絲面積＜2／3平皿面積；4級：0＜木霉菌絲面積＜1／3平皿面積；5級：病原菌菌絲面積占據(jù)100%平皿面積。

1.2.6 哈茨木霉出發(fā)菌株和突變株對病原菌的重寄生作用

將載玻片上均勻蘸一層水瓊脂，凝固后在載玻片兩端分別接哈茨木霉出發(fā)菌株與病原菌、哈茨木霉突變菌株與病原菌菌碟，置于滅菌的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，待兩菌落菌絲接觸時于顯微鏡下觀察兩者菌絲的相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉的氯化鋰-紫外復(fù)合誘變

預(yù)試驗結(jié)果表明，單獨采用紫外照射3min，木霉致死率為82%，單獨采用氯化鋰誘變，氯化鋰濃度0.01%時，致死率為79%。選擇紫外照射時間3 min，氯化鋰濃度0.01%進(jìn)行氯化鋰-紫外復(fù)合誘變，得到315株抗性突變菌株。經(jīng)計算正突變率為0.000 89%。通過藥劑篩選，獲得1 株抗藥性較強(qiáng)的突變菌株hcb-35。

2.2 哈茨木霉出發(fā)菌株與突變菌株的抗藥性

對哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變株hcb-35進(jìn)行抗藥性測定，結(jié)果如表1所示，多菌靈對哈茨木霉出發(fā)菌株hc的有效抑菌中濃度為0.966mg／L，對菌株hcb-35的抑菌中濃度達(dá)到3.72mg／L，有效抑菌中濃度提高285%。

表1 哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35對多菌靈的抗性Table 1 Resistance of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to carbendazim

2.3 哈茨木霉突變株的抗藥遺傳穩(wěn)定性

對哈茨木霉突變菌株進(jìn)行抗藥遺傳穩(wěn)定性測試，結(jié)果如表2所示，隨著傳代次數(shù)的增加，多菌靈對哈茨木霉突變菌株的有效抑菌中濃度沒有明顯降低，抗藥遺傳穩(wěn)定性較好。

表2 哈茨木霉突變菌株抗藥遺傳穩(wěn)定性Table 2 Determination of the genetic stability of carbendazim-resistance in Trichoderma harzianum mutant strains

2.4 哈茨木霉出發(fā)菌株及突變株對病原菌的拮抗作用

圖1為哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35對4 種病原真菌的拮抗情況。對照組立枯絲核菌、茄鐮孢菌、核盤菌長滿皿時，哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35均未完全覆蓋病原菌菌落；而對照組茄鏈格孢菌尚未長滿皿時哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35均完全覆蓋病原菌菌落，并占據(jù)100%平皿面積。由表3 可知，哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35對立枯絲核菌、茄鐮孢菌、核盤菌和茄鏈格孢菌的抑制率不同，但對同一病原菌抑制率相近，如在對茄鏈格孢菌的抑制中，最高均可達(dá)100%。觀察發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉出發(fā)菌株hc和突變菌株hcb-35在與不同病原菌菌落接觸之后，經(jīng)不同時間后，在兩菌交界處的病原菌菌絲漸漸被哈茨木霉的菌絲消融萎縮，直至被哈茨木霉孢子完全覆蓋，如立枯絲核菌和茄鏈格孢菌被覆蓋時間為接觸后2d，核盤菌被覆蓋時間為接觸后5d，茄鐮孢菌被覆蓋時間為接觸后10d，表明hcb-35菌株拮抗能力沒有因抗性突變而降低。

圖1 哈茨木霉出發(fā)菌株hc及突變菌株hcb-35對幾種病原真菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic action of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to several pathogenic fungi

表3 哈茨木霉出發(fā)菌株hc與突變菌株hcb-35對幾種病原真菌的拮抗作用Table 3 Antagonistic action of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to several pathogenic fungi

2.5 哈茨木霉出發(fā)菌株及突變菌株對病原菌的重寄生作用

顯微鏡下可觀察到哈茨木霉突變菌株hcb-35和出發(fā)菌株hc對立枯絲核菌（R.solani）的纏繞現(xiàn)象（圖2），表明哈茨木霉突變株仍然具有對植物病原真菌的寄生作用。

圖2 哈茨木霉及其突變株對立枯絲核菌的重寄生作用（10×40）Fig.2 Hyperparasitism of Trichoderma harzianum and its mutant strain against Rhizoctonia solani（10×40）

3 結(jié)論與討論

本試驗利用氯化鋰-紫外復(fù)合誘變與含藥平板培養(yǎng)基篩選的方法成功獲得對殺菌劑多菌靈具有較高抗性的哈茨木霉突變菌株hcb-35，利用毒力測定法測得多菌靈對其有效抑菌中濃度為3.72 mg／L，較出發(fā)菌株hc提高285%?？顾庍z傳穩(wěn)定性結(jié)果表明，哈茨木霉抗藥性突變菌株的抗性可穩(wěn)定遺傳。拮抗試驗與顯微鏡觀察菌絲互作結(jié)果表明，哈茨木霉突變株hcb-35仍具備出發(fā)菌株hc對病原真菌的拮抗作用，且拮抗能力沒有降低。

哈茨木霉因其在生物防治與環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力［21］而備受矚目。自1932年Weindling［22］發(fā)現(xiàn)木素木霉具有生防作用以來，人們在對木霉的生防應(yīng)用、生物菌劑的開發(fā)以及生防機(jī)制等方面做了許多嘗試和深入的研究［23］。木霉雖然具有很強(qiáng)的生防能力，但因其制劑較難與當(dāng)前普遍使用的化學(xué)農(nóng)藥混配使用，從而使木霉制劑的推廣應(yīng)用受到一定的限制［24］。通過誘變木霉產(chǎn)生對化學(xué)農(nóng)藥的抗性很好地解決了木霉與化學(xué)殺菌劑不可共同施用的難題。王勇等［25］采用藥劑馴化法篩選獲得了抗速克靈拮抗菌株。然而單純地通過藥劑篩選獲得抗藥性木霉菌株，在數(shù)量及功能上遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用需要［8］。采用微波、紫外線、X 射線、化學(xué)藥物等手段都可以導(dǎo)致病原菌遺傳性狀的改變，構(gòu)建高效的木霉菌株，其中紫外線［26］應(yīng)用最為廣泛，且往往與其他方法復(fù)合使用。紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變對獲得抗性菌株而言是一種簡便易行的手段，相比單一因素誘變的方法效果更佳，更易篩選出適合生產(chǎn)應(yīng)用的優(yōu)良菌株［7，13，27］。本試驗通過氯化鋰與紫外線復(fù)合誘變的方法篩選出多菌靈對其有效抑菌中濃度（EC50）提升285%的哈茨木霉突變株hcb-35，且抑菌能力不弱于出發(fā)菌株hc，與田連生［16］的研究相符。哈茨木霉的抗藥性誘變，為與殺菌劑多菌靈混配應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，使生防菌哈茨木霉的應(yīng)用更加契合現(xiàn)階段農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的水平，彌補(bǔ)化學(xué)殺菌劑的不足，發(fā)揮強(qiáng)大生防能力的同時減少化學(xué)殺菌劑的使用，對降低環(huán)境污染，發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)有著積極的促進(jìn)作用，也為其他生防菌的抗藥性誘變與應(yīng)用提供了理論和實踐經(jīng)驗。

［1］Hasan M M，Rahman S M E，Kim G H，et al.Antagonistic potentiality ofTrichodermaharzianumtowards seed-borne fungal pathogens of winter wheat cv.protivainvitroandinvivo［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，22（5）：585-591.

［2］Harman G E，Howell C R，Viterbo A，et al.Trichodermaspecies-opportunistic，avirulent plant symbionts［J］.Nature Reviews Microbiology，2004，2（1）：43-56.

［3］王芊.木霉菌在生物防治上的應(yīng)用及拮抗機(jī)制［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（1）：41-43.

［4］Howell C R.Mechanisms employed byTrichodermaspecies in the biological control of plant diseases：The history and evolution of current concepts［J］.Plant Disease，2003，87（1）：4-10.

［5］李淼，產(chǎn)祝龍，檀根甲，等.木霉菌防治植物真菌病害研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2009，20（2）：286-290.

［6］周紅姿，李寶聚，劉開啟.抗藥性木霉菌研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2003（6）：10-11.

［7］吳紅艷，鄭喜群，姚蕤.紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變選育羧肽酶高產(chǎn)菌株［J］.中國調(diào)味品，2004（6）：15-17.

［8］于雪云，扈進(jìn)冬，楊合同.木霉菌抗藥性研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：81-85.

［9］程東美，張志祥，區(qū)麗文，等.哈茨木霉T2菌株耐藥性的測定及其對幾種病原菌的抑制作用研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（10）：4170-4172.

［10］田連生.紫外光誘導(dǎo)哈茨木霉產(chǎn)生對多菌靈抗藥性的菌株［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報2007，26（1）：318-321.

［11］段銀芝，郎劍鋒，孔凡彬，等.4種農(nóng)藥對哈茨木霉生長的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：101-102.

［12］牛芳勝，馬志強(qiáng)，畢秋艷，等.不同作用機(jī)制殺菌劑對番茄灰霉病菌拮抗木霉菌的毒力測定［J］.農(nóng)藥，2012，51（8）：601-604.

［13］張麗榮，康萍芝，杜玉寧，等.紫外線誘變拮抗木霉產(chǎn)生對百菌清抗藥性菌株的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（31）：17533-17535.

［14］丁中，劉峰，慕立義.紫外光誘導(dǎo)哈茨木霉產(chǎn)生腐霉利抗性菌株的研究［J］.中國生物防治，2002，18（2）：75-78.

［15］祖國仁，辛雪嬌，孔繁東，等.紫外線、氯化鋰復(fù)合誘變篩選納豆菌高抑菌活性菌株及培養(yǎng)條件研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（4）：187-190.

［16］田連生，李貴香，高玉爽.紫外光誘導(dǎo)木霉產(chǎn)生對速克靈抗藥性菌株的研究［J］.中國植保導(dǎo)刊，2006，26（6）：18-20.

［17］尹婷，徐秉良，梁巧蘭，等.耐藥性木霉T2菌株的篩選、紫外誘變與藥劑馴化［J］.草業(yè)學(xué)報，2013，22（2）：117-122.

［18］產(chǎn)祝龍，丁克堅，檀根甲，等.哈茨木霉對水稻惡苗病菌的拮抗作用［J］.植物保護(hù)，2003，29（3）：35-39.

［19］Kumar K，Amaresan N，Bhagat S，et al.Isolation and characterization ofTrichodermaspp.for antagonistic activity against root rot and foliar pathogens［J］.Indian Journal of Microbiology，2012，52（2）：137-144.

［20］李貴香，高海霞，田連生，等.拮抗木霉耐多菌靈菌株的篩選［J］.生物技術(shù)，2006，16（6）：29-32.

［21］呂黎，許麗媛，羅志威，等.哈茨木霉生物防治研究進(jìn)展［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（17）：92-95.

［22］Weindling R.Studies on lethal principle effective in the parasit-ic action ofTrichodermaharzianumonRhizoctoniasolaniand other soil fungi［J］.Phytopathology，1932，22：837-845.

［23］郭潤芳，史寶勝，高寶嘉，等.木霉菌在植病生物防治中的應(yīng)用［J］.河北林果研究，2001，16（3）：294-298.

［24］顏湯帆，高必達(dá)，劉志誠，等.兩種生物藥劑混配對木霉抑菌作用的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（9）：80-82.

［25］王勇，楊秀榮，劉水芳.拮抗木霉耐藥性菌株的篩選及其與速克靈防治灰霉病的協(xié)同作用［J］.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2002，9（4）：19-22.

［26］劉朋虎，江枝和，雷錦桂，等.60Co與紫外復(fù)合誘變選育姬松茸新品種-福姬77［J］.核農(nóng)學(xué)報，2014，28（3）：365-370.

［27］張建，馬玉超，孫劍秋，等.紫外線-氯化鋰對柴油杉醇產(chǎn)生菌HQD33原生質(zhì)的誘變［J］.克山師專學(xué)報，2003（3）：1-4.