使君子多糖的超聲波提取及體外抗氧化

盧善善，張照平，李蕓達(dá)，顏?zhàn)娴埽S 濤，程世嘉，黃鎖義

(右江民族醫(yī)學(xué)院1. 護(hù)理學(xué)院；2. 臨床學(xué)院；3.藥學(xué)院，廣西 百色 533000)

使君子多糖的超聲波提取及體外抗氧化

盧善善1，張照平2，李蕓達(dá)2，顏?zhàn)娴?，黃 濤2，程世嘉2，黃鎖義3*

(右江民族醫(yī)學(xué)院1. 護(hù)理學(xué)院；2. 臨床學(xué)院；3.藥學(xué)院，廣西 百色 533000)

使君子多糖 ；超聲波提取法 ；體外抗氧化；正交設(shè)計(jì)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

1.1.1 儀器

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、植物粉碎機(jī)FZ102(上海銳豐儀器儀表有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、電熱式恒溫水浴鍋HHS-21-4(江蘇金壇宏凱儀器廠)、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、電子分析天平FA1104(上海天平儀器廠)、755B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.2 試劑與藥材

葡萄糖、雙氧水溶液、苯酚、水楊酸、無(wú)水乙醇、鄰苯三酚，95%濃硫酸等，所用試劑均為分析純?cè)噭咕庸麑?shí)采購(gòu)自百色藥店。

1.2 使君子的多糖提取方法

1.2.1 使君子多糖的提取

將干燥使君子果實(shí)在植物粉碎機(jī)上磨碎，制成使君子果實(shí)粉末備用，稱取1.000 g的使君子果實(shí)粉末若干份，分別在不同料液比、作用時(shí)間、提取溫度、超聲功率等單因素條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。冷卻后，將提取液過(guò)濾后定容，取上液適量稀釋一定的倍數(shù)，待測(cè)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以多糖提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 使君子多糖提取率的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)多糖的測(cè)定采用的是硫酸-苯酚法[9]。取待測(cè)液0.5 mL置于10.0 mL的試管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速加入5.0 mL的濃硫酸，搖勻，40 ℃水浴中反應(yīng)30 min，然后置于冷水中冷卻10 min，以葡萄糖為標(biāo)樣，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。由一元線性回歸方程推算出使君子多糖的質(zhì)量。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥(105℃)至恒重的葡萄糖50 mg，加蒸餾水定容至100 mL，得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL，分別定容至50 mL，得不同濃度的稀釋液。分別精密吸取上述稀釋液0.5 mL按“1.2.2”中方法顯色，測(cè)定吸光度值，以吸光度值(A)對(duì)質(zhì)量濃度C(mg/mL)進(jìn)行回歸，得回歸方程為：A=5.163 3C-0.030 2，r=0.999 2，表明對(duì)照品葡萄糖含量在0.010～0.100 mg/mL范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)吸光度值有良好線性關(guān)系。

1.2.4 優(yōu)化工藝條件的正交實(shí)驗(yàn)

由單因素實(shí)驗(yàn)可知，料液比、提取時(shí)間、超聲溫度、作用功率等因素均可影響使君子多糖的提取率，為了探究這4種因素的綜合影響，以多糖提取率為指標(biāo)，按L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝條件。因素水平見(jiàn)于表1，正交實(shí)驗(yàn)見(jiàn)于表2，方差分析見(jiàn)于表3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，影響使君子多糖提取的因素由主到次的順序?yàn)椋?A)料比液>(C)提取溫度>(D)超聲功率>(B)超聲時(shí)間。通過(guò)方差分析可知，料比液在超聲波提取使君子多糖中有顯著意義，因此，最佳提取工藝為A2B2C3D1即料比液1 ∶30(g/mL)、提取時(shí)間40 min、提取溫度70 ℃、超聲波功率140 W。

表1 正交因素水平試驗(yàn)

表2 L9(34)正交試驗(yàn)及結(jié)果

表3 方差分析

注：F0.05(2，2)=19；F0.01(2，2)=99

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

取使君子果實(shí)干粉3份，每份1.000 g，按最佳提取條件A2B2C3D1進(jìn)行提取，即按1 ∶30(g/mL)料液比，以140 W的超聲功率在70 ℃下進(jìn)行提取40 min將提取液過(guò)濾后定容，取上液適量稀釋一定的倍數(shù)，測(cè)定吸光度，計(jì)算使君子多糖的提取率。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，按最佳提取條件進(jìn)行提取，多糖提取率平均為10.36%，RSD為0.51%，結(jié)果與正交試驗(yàn)中的5號(hào)試驗(yàn)的多糖提取率相近，因此我們認(rèn)為正交試驗(yàn)得出的結(jié)果是可靠的且工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

1.2.6 羥基自由基的清除

用Fenton反應(yīng)法[7]產(chǎn)生羥基自由基(·OH)。H2O2/Fe2+體系可以通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生經(jīng)自由基化學(xué)反應(yīng)式如下：

H2O2+ Fe2+→·OH+OH-+Fe3+

以· OH有色物質(zhì)氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm處有強(qiáng)吸收峰，若體系中加入清除·OH的物質(zhì)，則會(huì)減少有色物質(zhì)生成，吸光度降低，吸光度越低，清除率·OH效果越好。

方法：取5支試管，依次編號(hào)，每支試管各加入9 mmol/L FeSO41 mL, 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2.0 mL，按試管編號(hào)依次加入不同濃度的多糖溶液2.0 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O22.0 mL啟動(dòng)反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)1.0 h。以蒸餾水代替多糖溶液作空白調(diào)零，在510 nm處測(cè)定樣品的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，清除率可用公式表示：

清除率=(A0-As)/A0×100%

式中A0為空白對(duì)照液的吸光度，As為加入提取液后的吸光度

圖1 羥自由基清除率

由圖1可以看出，不同濃度的使君子多糖對(duì)H2O2/Fe2+通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH具有清除作用，并且在一定范圍內(nèi)，隨多糖濃度的增加，·OH清除率有明顯的上升趨勢(shì)，說(shuō)明使君子多糖對(duì)·OH的清除效果明顯。

1.2.7 超氧陰離子的清除

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%

圖2 超氧自由基清除率

2 結(jié) 論

超聲波輔助提取多糖的過(guò)程是一種物理破碎過(guò)程，它利用空化和機(jī)械振動(dòng)作用瞬間使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破裂，不僅縮短提取時(shí)間，并且還可避免高溫對(duì)提取成分的影響，提高了多糖的提取率，同時(shí)還能產(chǎn)生乳化、熱效應(yīng)等，加速了植物有效成分的擴(kuò)散[10]。與傳統(tǒng)提取工藝相比，超聲提取使君子多糖具有省時(shí)、高效、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)。因此，超聲波新技術(shù)應(yīng)用于中藥類有效成分提取是一種高效、便捷、值得推廣的新方法。

使君子多糖對(duì)羥自由基及超氧陰離子均表現(xiàn)為較強(qiáng)的清除能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加清除能力在增強(qiáng)。因此，從整體上來(lái)說(shuō)，使君子多糖抗氧化性顯著，這預(yù)示著使君子在對(duì)人類醫(yī)學(xué)、保健事業(yè)及食品開發(fā)上有潛在的利用價(jià)值。

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Ultrasonic Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Fructus Quisqualis

Lu Shanshan1, Zhang Zhaoping2, Li Yunda2，Yan Zudi2，Huang Tao2，Cheng Shijia2，Huang Suoyi3

(1.School of Nursing; 2.School of Clinical Medicine; 3.School of Pharmacy，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000, China)

polysaccharide ofQuisqualpindica; ultrasonic extracting；antioxidant activity; orthogonal experimental design

2014-08-12

國(guó)家中醫(yī)藥管理局“十二五”中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科中藥化學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(國(guó)中醫(yī)藥人教發(fā)[2012]32號(hào))；廣西重點(diǎn)學(xué)科藥物化學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(桂教科研[2013]16號(hào))；2014年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目(201410599006)；2014年廣西自治區(qū)級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目(201410599035)；右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)藥協(xié)會(huì)資助項(xiàng)目(20131103)。

盧善善(1991-)，女，本科在讀。研究方向：中藥有效成分提取。E-mail：18777615250@163.com

*通訊作者:黃鎖義，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)、藥物化學(xué)、食品衛(wèi)生、中草藥與植物化學(xué)。E-mail：huangsuoyi@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.02.003

R284.2

A

1006-9690(2015)02-0009-04