百里香組織培養(yǎng)過程中玻璃化問題的研究

雷 穎

(甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林系，甘肅 天水 741020)

百里香組織培養(yǎng)過程中玻璃化問題的研究

雷 穎

(甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林系，甘肅 天水 741020)

以百里香莖切段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)和快速繁殖試驗(yàn)研究，分化率很高，可達(dá)100%；但培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象較為嚴(yán)重，解決這一問題的途徑，主要是在增殖倍數(shù)較高的培養(yǎng)基MS+KT 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L的基礎(chǔ)上，加入0.3 mg/L的GA3，增加蔗糖濃度為50 g/L，瓊脂8 g/L，可有效控制玻璃化苗的比例和玻璃苗的逆轉(zhuǎn)。

百里香；組培快繁；玻璃化問題；有效控制

百里香(ThymusmongolicusRonn.)別名地椒、千里香、地姜。唇形科，半灌木，植株矮小，高5～20 cm。有芳香，匍匐莖平臥，末端多為開花枝。上密生多數(shù)平行直立莖，當(dāng)年生枝紫色，老枝灰色。葉小近無柄，為長(zhǎng)橢圓形或長(zhǎng)方條形全緣，有側(cè)脈2～3對(duì)，具透明油點(diǎn)，花密集枝端，或圓頭狀花序；花冠二唇形，二強(qiáng)雄蕊[1]。生于向陽山坡或林區(qū)陽坡灌木叢中。分布于東北、河北、內(nèi)蒙、甘肅、青海和新疆等省區(qū)。藥用植物，解表袪風(fēng)，行氣止痛，止咳，降壓[2-3]。西北師范大學(xué)張繼教授對(duì)其藥用成分含量進(jìn)行了生化分析，對(duì)其藥理效應(yīng)正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

百里香枝葉茂盛，花色艷麗，生長(zhǎng)粗放，因此，也是良好的花壇和地被植物[4]。百里香在藥用和觀賞方面的應(yīng)用已引起了人們的廣泛關(guān)注，但其野生資源種群數(shù)量少，近年來作為藥原，人為采挖較為嚴(yán)重，為有效保護(hù)野生資源，避免資源枯竭，大力開展百里香的繁育工作勢(shì)在必行，但常規(guī)方式育苗，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的需要，因此，開展百里香組織培養(yǎng)和快速繁殖具有十分重要的意義，但百里香組培快繁過程中的玻璃化現(xiàn)象以成為試管苗培育的嚴(yán)重障礙。為解決這一問題，作者以百里香莖段為外植體，對(duì)各種影響因子在不同水平上進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，以期獲得有效控制方案和逆轉(zhuǎn)效果。

1 材料和方法

1.1 材料

材料來自甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院野生花卉引種馴化示范基地，原產(chǎn)小隴山林區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理及接種

5月初，在晴朗的上午采集百里香當(dāng)年生幼嫩莖段，剪去葉片用毛刷蘸洗衣粉刷掉表面灰塵，用清水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精浸泡30 s，無菌水沖3遍，再轉(zhuǎn)入0.1%的升汞+吐溫80溶液中，浸2,4,6,8 min ,用無菌水沖5遍，然后置于高壓滅菌過的鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，剪成長(zhǎng)0.5～1.0 cm，含有一個(gè)節(jié)的小莖段，接種在分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 初代誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)6-BA和NAA、KT和IBA兩個(gè)組合共18種不同激素配比。所有培養(yǎng)基都附加蔗糖3%、瓊脂0.6%、pH 5.8，培養(yǎng)室溫度為(20±2)℃，每日光照12 h，強(qiáng)度1 600 lx，濕度70%。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基設(shè)計(jì)KT和IBA不同濃度配比。所有培養(yǎng)基都附加蔗糖3%、瓊脂0.6%、pH 5.8，培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃，每日光照14 h，強(qiáng)度2 000 lx，濕度70%。

1.2.4 生根培養(yǎng)

切取2 cm左右的嫩莖，進(jìn)行生根培養(yǎng)。以1/2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)不IBA和IAA的不同濃度配比。所有培養(yǎng)基都附加蔗糖50%、瓊脂0.8%、pH 5.8，培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃，每日光照14 h，強(qiáng)度3 000 lx，濕度70%。

1.2.5 玻璃化的控制與逆轉(zhuǎn)

初代誘導(dǎo)時(shí)BA對(duì)簇生芽的分化具有顯著影響，但相對(duì)于同濃度的KT培養(yǎng)基而言玻璃化程度更為嚴(yán)重。因此，在繼代增殖階段選用KT與IBA組合可降低玻璃苗的概率。在此基礎(chǔ)上要保證較高的增殖倍數(shù)和較低的玻璃苗比率，需在培養(yǎng)基中加入不同濃度的GA3進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，可望獲得降低玻璃化程度的最佳配比[5-7]。同時(shí)適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖與瓊脂的含量，也有利于玻璃化苗的逆轉(zhuǎn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒時(shí)間的確定

試驗(yàn)表明，百里香當(dāng)年生細(xì)嫩莖段用0.1%的升汞消毒4 min，可取得最佳效果，污染率10%，存活率可達(dá)85%。

2.2 不同濃度的激素配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

經(jīng)過消毒處理的嫩莖切段，接種于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，不定芽誘導(dǎo)的激素配比(表1)，40天后檢查，結(jié)果表明： 6-BA和NAA的濃度與分化率和平均芽數(shù)呈正相關(guān)，但玻璃苗的比率也跟著上升，當(dāng)6-BA大于3.0 mg/L,時(shí)平均芽數(shù)減少，分化時(shí)間推遲，不定芽節(jié)間變短，NAA的濃度對(duì)不定芽分化沒有顯著影響。KT+IBA的組合中，有部分配比的分化率同樣較高，雖然平均芽數(shù)稍低了一些，但玻璃化程度明顯較低，因此， MS+KT3 mg/L +IBA 0.2 mg/L是百里香最適合的分化培養(yǎng)基。

表1 不同濃度激素配比對(duì)百里香初代培養(yǎng)的影響

2.3 不同濃度的激素配比對(duì)芽苗增殖的影響

將初代培養(yǎng)所得的簇生嫩莖切成1～1.5 cm長(zhǎng)的小段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后增殖結(jié)果因激素配比不同而異(表2)，嫩莖增殖倍數(shù)隨細(xì)胞分裂素濃度的增高而增大，但濃度過高會(huì)影響芽苗的高生長(zhǎng)，且玻璃化現(xiàn)象加重。試驗(yàn)表明， MS+KT 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L是百里香增殖培養(yǎng)較理想的培養(yǎng)基。雖然增殖倍數(shù)不算太高，為6.6，但玻璃化程度相對(duì)較低，為13.6%。

表2 KT與IBA不同濃度配比對(duì)芽增殖的影響

2.4 不同濃度的GA3對(duì)芽苗玻璃化的影響

增殖培養(yǎng)結(jié)果表明，培養(yǎng)基MS+KT 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L產(chǎn)生的芽苗增殖倍數(shù)較高，但幼苗生長(zhǎng)較細(xì)弱，且有13.6%的玻璃苗，而培養(yǎng)基MS+KT 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L產(chǎn)生的芽苗增殖倍數(shù)更高，但幼苗生長(zhǎng)緩慢、矮小、節(jié)間短，玻璃化程度較高可達(dá)26%。因此在以上兩個(gè)配比中加入不同濃度的GA3進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)， 4周后統(tǒng)計(jì)見表(3)，結(jié)果顯示，加入GA3對(duì)芽苗高生長(zhǎng)具有顯著影響，且隨著GA3濃度的升高，苗高呈增高趨勢(shì)，玻璃化受到了較大程度的控制，但當(dāng)GA3濃度大于0.5 mg/L時(shí)，苗莖細(xì)弱，葉片皺縮，而降低GA3濃度可恢復(fù)正常。植株玻璃苗百分率隨GA3濃度的升高而下降，GA3濃度為0.3時(shí)玻璃化程度較低，芽苗分化較好。

表3 不同濃度的KT和GA3對(duì)玻璃苗發(fā)生的影響

2.5 不同濃度的蔗糖與瓊脂對(duì)玻璃苗逆轉(zhuǎn)的影響

培養(yǎng)基2.0 mg/L KT+0.2 mg/L IBA+0.3 mg/L GA3雖然使增殖階段芽苗的玻璃狀受到了極大的限制，但還存在5.8%的玻璃苗，且部分芽苗基部略帶水浸狀，由于吸收功能受到限制而使芽苗生長(zhǎng)較弱，增加培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的含量，使芽苗在不同程度上都降低了玻璃化的比例，且表現(xiàn)為健壯生長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的配比見表4，試驗(yàn)結(jié)果表明：2.0 mg/L KT+0.2 mg/L IBA+0.3 mg/L GA3+50 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂是百里香增殖培養(yǎng)最隹培養(yǎng)基組合。芽苗健壯，形態(tài)正常，增殖倍數(shù)較高。

表4 不同濃度的蔗糖與瓊脂對(duì)玻璃苗逆轉(zhuǎn)的影響

2.6 NAA和IAA對(duì)芽苗生根的影響

為了保持移栽苗的質(zhì)量，最理想的情況是產(chǎn)生大量的根而不長(zhǎng)出新苗。在培養(yǎng)基中僅添加IAA或NAA就能取得良好的效果，接種20天后觀察以1/2 MS+0.2 mg/L IAA的培養(yǎng)基生根效果較好，每個(gè)嫩莖基部有根5～8條，長(zhǎng)約2～3 cm，成為完整的再生植株。

表5 NAA與IAA不同濃度對(duì)百里香嫩莖生根的影響

2.7 煉苗及移栽

當(dāng)試管苗根長(zhǎng)約2～3 cm時(shí)，不開蓋在溫室中置5 天后，開蓋置3 天，然后移栽于蛭石 ∶森林土(1 ∶1)的基質(zhì)中，用塑料薄膜覆蓋，2周后檢查成活率。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)上述方法處理后的試管苗，移栽2周后生長(zhǎng)良好，成活率95%。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA與KT對(duì)百里香不定芽的誘導(dǎo)具有顯著影響，當(dāng)培養(yǎng)基中濃度各為3.0 mg/L時(shí)分化率都為100%， 6-BA使外植體分化的平均芽數(shù)8.5遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于KT的5.5，但玻璃化的嚴(yán)重程度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于KT，因此，初代培養(yǎng)時(shí)選擇MS+3.0 mg/L KT +0.2 mg/L IBA的激素組合較為理想。

對(duì)百里香玻璃化的控制與逆轉(zhuǎn)，主要在增殖階段完成。試驗(yàn)結(jié)果表明：GA3、蔗糖及瓊脂對(duì)百里香玻璃化的控制與逆轉(zhuǎn)都有顯著影響，隨著GA3濃度的升高，玻璃苗的比率下降，但濃度大于0.5%時(shí)產(chǎn)生逆向結(jié)果；隨著瓊脂和蔗糖濃度的增加，玻璃化苗比率減少。但瓊脂濃度過高，硬化了的培養(yǎng)基影響了試管苗對(duì)養(yǎng)分的吸收[9]，而生長(zhǎng)緩慢。碳源不僅為芽的形成提供能量，而且也起滲透調(diào)節(jié)作用，但糖的濃度過高時(shí)水解緩慢，同時(shí)也影響其它物質(zhì)的吸收[10]，因此，芽苗增殖階段以：：2.0 mg/L KT +0.2 mg/L IBA +0.3 mg/L GA3+50 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂為培養(yǎng)基，效果較好，芽苗健壯，生長(zhǎng)旺盛，增殖倍數(shù)較高為6.6。

生長(zhǎng)素的種類及濃度對(duì)試管苗根的形成具有重要作用，從本次試驗(yàn)結(jié)果看，0.2 mg/L的IAA適合于百里香試管苗的生根，再生后的完整植株苗形美觀，色澤深綠，移栽后生長(zhǎng)良好。

[1] 中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)高等植物圖鑒:第3冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1983.

[2] 員銘，呂國(guó)華.百里香應(yīng)用價(jià)值研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007(1)：25.

[3] 張繼，田玉汝，劉忠旺，等.百里香屬植物研究進(jìn)展[J].北方園藝,2010(1)：15.

[4] 北京林業(yè)大學(xué)園林系花卉教研室.花卉學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1999.

[5] 卜學(xué)賢，陳維倫.試管植物的玻璃化現(xiàn)象[J].植物生理學(xué)通訊,1987,23(5):13-19.

[6] Ziv M,Meir G,Harlevy A.Factors influencing the production of hardened glaucous carnation plantlets in virtro [J].Plant cell:Tissue and Organ Culture,1982,2(1):55-65.

[7] 張洪勝，牟云官，辛培剛.蘋果離體培養(yǎng)中試管苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生機(jī)理探討[J].果樹科學(xué),1991,8(2)：71-74.

[8] 劉敏.花卉組織培養(yǎng)與工廠化生產(chǎn)[M].北京：地質(zhì)出版社，2002.

[9] 曹孜義，劉國(guó)民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].修定版.蘭州： 甘肅科學(xué)技術(shù)出版社,1999.

[10] 李浚明.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992.

Research on Vitrification of Thymus mongolicus Ronn.during Tissue Culture

Lei Ying

(Department of Landscape Architecture, Gansu Vocational and Technical College of Forestry, Tianshui 741020, China)

UsingThymusmongolicusRonn. stem segments as explants for tissue culture and rapid propagation, the differentiation rate was up to 100%.However, vitrification was serious during the tissue culture.The way to solve this problem was adding 0.3 mg/L of GA3to MS+ KT 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L , and increasing sucrose concentration to 50 g/L，agar to 8 g/L.These measures can control the vitrification effectively.

ThymusmongolicusRonn.; tissue culture; vitrification; effectively control

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.01.005

2014-08-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(50773064)；教育部高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新工程重大項(xiàng)目培育資金項(xiàng)目(706056)；甘肅省中醫(yī)藥科研資助項(xiàng)目(GZK-2008-22)。

雷穎(1966-)，女，副教授，主要從事園林植物栽培與養(yǎng)護(hù)的教學(xué)與研究工作。

S682

A

1006-9690(2015)01-0015-04