8-OHdG在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710061)

廉民學(xué) 馮鴻飛△ 姜海濤 梁 晨 郭世文▲

8-OHdG在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義*

△陜西省洛南縣醫(yī)院神經(jīng)外科

▲通訊作者

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710061)

廉民學(xué) 馮鴻飛△姜海濤 梁 晨 郭世文▲

目的：探討8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義。方法：采用免疫組化SP法檢測(cè)45例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中8-OHdG的表達(dá)，并結(jié)合臨床資料分析其與膠質(zhì)瘤臨床特征之間的關(guān)系。結(jié)果：DNA氧化性損傷標(biāo)志物8-OHdG在高級(jí)別(Ⅲ～Ⅳ級(jí))膠質(zhì)瘤中的表達(dá)強(qiáng)于低級(jí)別(Ⅰ～Ⅱ級(jí))膠質(zhì)瘤，在不同性別、年齡的膠質(zhì)瘤患者中8-OHdG的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的DNA氧化性損傷較低級(jí)別嚴(yán)重，8-OHdG可作為膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的輔助性診斷指標(biāo)。

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤其預(yù)后與其病理級(jí)別關(guān)系密切，高級(jí)別膠質(zhì)瘤尤其是間變性星型細(xì)胞瘤(WHO Ⅲ級(jí))和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO Ⅳ級(jí))平均生存期分別為30～36個(gè)月和10～15個(gè)月[1]。雖然低級(jí)別膠質(zhì)瘤的預(yù)后較高級(jí)別膠質(zhì)瘤好，但膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)時(shí)往往伴有病理級(jí)別的進(jìn)展，這種病理級(jí)別進(jìn)展的機(jī)制目前尚不明確，可能與基因組的改變有關(guān)[2-3]。由于腦組織的特殊性,使其容易遭受氧化性損傷,尤其是膠質(zhì)瘤術(shù)后腦組織的出血、小血管痙攣、腦水腫、再灌注損傷及炎癥反應(yīng)等,更是加重了細(xì)胞的氧化性損傷。在DNA 氧化損傷中,8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷﹙8-hydroxy deoxyguanosine,8-OHdG﹚是最具代表性的損傷產(chǎn)物,已成為目前評(píng)估氧化應(yīng)激和DNA氧化損傷的常用敏感生物標(biāo)志物[4]。8-OHdG在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中8-OHdG的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料分析其與膠質(zhì)瘤臨床特征的關(guān)系及意義。

材料與方法

1 材 料 ①標(biāo)本：選取我院2011年1月至2011年12月行手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤標(biāo)本共45例，經(jīng)病理證實(shí)均為膠質(zhì)瘤。其中星型細(xì)胞瘤38例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤4例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤3例。男26例，女19例，年齡25～72歲，平均年齡49.40±12.74歲。按WHO膠質(zhì)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(2007年)分級(jí)，Ⅰ級(jí)7例、Ⅱ級(jí)22例、Ⅲ級(jí)12例、Ⅳ級(jí)4例。②試劑：8-OHdG單克隆抗體N45.1購(gòu)自亞諾法生技股份有限公司(Abnova, Taiwan)，DAB顯色試劑盒、SP試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

2 方 法 標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋制成4μm切片，采用免疫組化SP法進(jìn)行染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波抗原修復(fù)，依次滴加過(guò)氧化物酶阻斷液(37℃封閉10min)、10%非免疫性動(dòng)物血清(37℃孵育40min)、8-OHdG一抗工作液(1∶200稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜)、生物素標(biāo)記的二抗(37℃孵育20min)、S-A/HRP(37℃孵育20min)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。用已知表達(dá)8-OHdG蛋白陽(yáng)性的皮膚組織作為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

3 結(jié)果判定 細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片400倍光鏡下連續(xù)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比率和染色深度分別評(píng)估，最后綜合評(píng)定。陽(yáng)性細(xì)胞的比率評(píng)分：0分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)<10%，1分為陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)11%～25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)26%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)>50%。染色深度評(píng)分：0分為無(wú)染色，1分為淡黃色，3分為棕黃色，2分為染色強(qiáng)度介于1分和3分之間。總分=陽(yáng)性細(xì)胞比率評(píng)分+染色深度評(píng)分：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為中強(qiáng)陽(yáng)性()，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

結(jié) 果

1 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤臨床特征比較 見(jiàn)表1。高級(jí)別組和低級(jí)別組膠質(zhì)瘤患者的性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而且，高級(jí)別組膠質(zhì)瘤患者年齡(51.00±12.65歲)與低級(jí)別組患者年齡(48.00±12.68歲)之間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者年齡、性別的比較

注：年齡的比較采用t檢驗(yàn)，性別比較采用卡方檢驗(yàn)

2 8-OHdG在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá) 見(jiàn)表2。8-OHdG定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性著色為黃色或棕黃色核著色(見(jiàn)附圖)。低級(jí)別(Ⅰ～Ⅱ級(jí))組8-OHdG表達(dá)強(qiáng)度中度或強(qiáng)陽(yáng)性(～)者占13.79%(4/29)，而高級(jí)別(Ⅲ～Ⅳ級(jí))組占50%(8/16)，兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 8-OHdG表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床特征之間的關(guān)系 見(jiàn)表3。在男性膠質(zhì)瘤患者中，8-OHdG表達(dá)中度或強(qiáng)陽(yáng)性(～)者占26.92%(7/26)，在女性膠質(zhì)瘤患者中占26.31%(5/19)，兩者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.020，P=0.964)。50歲以下患者8-OHdG表達(dá)強(qiáng)度中度或強(qiáng)陽(yáng)性(～)者占33.33%(7/21)，50歲以上患者占20.83%(5/24)，兩者之間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.895，P=0.344)。

表2 8-OHdG在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)的比較

注：χ2=6.912，P=0.014

A：Ⅰ級(jí)； B：Ⅱ級(jí)； C：Ⅲ級(jí)； D：Ⅳ級(jí)

表3 8-OHdG在不同性別、年齡組中表達(dá)的比較

注：年齡、性別比較均采用卡方檢驗(yàn)

討 論

活性氧(ROS)是氧化應(yīng)激主要的表現(xiàn)形式，過(guò)多的自由基可以直接引起生物脂質(zhì)膜的過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損，其中活性最強(qiáng)的ROS表現(xiàn)形式是羥自由基(HO.)。DNA中所有的嘌呤和嘧啶均可能受到ROS的攻擊，但以鳥(niǎo)嘌呤(G)最易被修飾。羥自由基攻擊DNA鏈上的鳥(niǎo)嘌呤堿基，使C-8位發(fā)生羥化而生成8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)，后者是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物之一[5]。

8-OHdG代表DNA氧化性損傷程度，意味著細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)多、抗氧化系統(tǒng)異?；駾NA修復(fù)系統(tǒng)缺陷。內(nèi)源性的ROS產(chǎn)生主要來(lái)源于線粒體，與呼吸鏈的電子傳遞有關(guān)，當(dāng)該過(guò)程受到抑制時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS會(huì)明顯升高[6]。ROS的促腫瘤作用體現(xiàn)在直接或間接兩方面。前者指ROS對(duì)基因組DNA的直接損傷，比如所形成的8-OHdG可以與C以外的其他堿基配對(duì)形成點(diǎn)突變，其中GC-TA突變的發(fā)生已被大量研究證實(shí)[7]。另外ROS可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子，激活包括NF-κB、AP-1等在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄異常，間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)分為酶和非酶系統(tǒng)兩大類(lèi)，前者包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶，后者包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽、硫氧還原蛋白等，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)中具有重要意義。在一般情況下機(jī)體修復(fù)機(jī)制正常時(shí)，8-OHdG等DNA氧化性損傷產(chǎn)物可以在人8-羥基鳥(niǎo)嘌呤糖苷酶(hOGG1)等的作用下從DNA鏈上切除并重新?lián)饺胝５镍B(niǎo)嘌呤堿基，避免由于錯(cuò)配導(dǎo)致的基因突變[9]。

目前，8-OHdG在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組化法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中的8-OHdG表達(dá)水平，結(jié)果表明：8-OHdG在高級(jí)別(Ⅲ～Ⅳ級(jí))膠質(zhì)瘤中的表達(dá)強(qiáng)于低級(jí)別(Ⅰ～Ⅱ級(jí))膠質(zhì)瘤，提示8-OHdG所代表的DNA氧化性損傷在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、病理級(jí)別進(jìn)展中具有重要意義。膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別與其預(yù)后密切相關(guān)，研究顯示低級(jí)別膠質(zhì)瘤較高級(jí)別膠質(zhì)瘤無(wú)進(jìn)展生存期長(zhǎng)28個(gè)月[10]。但是初發(fā)膠質(zhì)瘤并非停滯不前，復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤往往伴隨有病理級(jí)別的進(jìn)展。這種病理級(jí)別進(jìn)展的機(jī)制目前尚不明確，通過(guò)基因芯片等多方面的研究表明膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的進(jìn)展可能與腫瘤基因組改變有關(guān)。黃強(qiáng)等通過(guò)基因芯片發(fā)現(xiàn)197條在惡性進(jìn)展膠質(zhì)瘤中高表達(dá)的基因，并通過(guò)生物信息學(xué)方法分析出其中17條與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3]。而8-OHdG形成所導(dǎo)致的堿基錯(cuò)配是基因突變的一個(gè)重要原因，因此膠質(zhì)瘤的進(jìn)展可能與細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性的DNA氧化性損傷相關(guān)。

由于大腦的高代謝活性、相對(duì)性低抗氧化系統(tǒng)、低DNA修復(fù)能力，導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞容易受到氧化性損傷。尤其是對(duì)于膠質(zhì)瘤術(shù)后患者，手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的出血、小血管痙攣、腦水腫、再灌注損傷及炎癥反應(yīng)，均可以加重氧化性損傷[11]。另外腦組織較其他組織含有更多的金屬離子(比如鐵離子)，這些金屬離子在催化過(guò)氧化氫形成高活性的羥自由基中是必需的，羥自由基是最具損傷性的活性分子，這也是腦組織容易遭受氧化性損傷的重要原因[12]。本研究從氧化損傷方面揭示了膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，同時(shí)也提示對(duì)于膠質(zhì)瘤術(shù)后患者給予自由基清除劑、抗氧化劑等藥物可能減輕膠質(zhì)瘤術(shù)后氧化性損傷，防止DNA損傷加重導(dǎo)致疾病惡化。另一方面，本研究結(jié)果提示8-OHdG可作為膠質(zhì)瘤進(jìn)展的輔助性生物標(biāo)記物。

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(收稿：2014-09-22)

Expression and significance of 8-OHdG in different graded glioma

Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Medical College of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Lian Minxue Feng Hongfei Jiang Haitao et al

Objective：To evaluate the expression and significance of 8-hydroxy deoxyguanosine (8-OHdG) in different degraded glioma.Methods：SP immunohistochemistry was employed to detect the expression of 8-OHdG in forty-five different degraded glioma,and the relationship between the expression of 8-OHdG and clinical features of glioma was analyzed.Results：The expression of 8-OHdG was stronger in high grade glioma (Ⅲ～Ⅳ grade) group than that in low grade glioma (Ⅰ～Ⅱ grade) group, and there was no statistical significance of 8-OHdG expression in different age and gender glioma patients. Conclusion：DNA oxidative damages is much serious in high grade glioma tissues. 8-OHdG can be a marker for the pathological diagnosis of glioma.

Glioma Immunohistochemistry @Oxidative damage @8-hydroxy deoxyguanosine

神經(jīng)膠質(zhì)瘤 免疫組織化學(xué) @氧化損傷 @8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷

R739.41

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.009

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012K13-02-14)