電針對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能及海馬Nogo-A、NgR表達(dá)的影響*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年神經(jīng)科(西安710004)

王 輝 何 婭▲ 陳松盛 馬巧亞 王銳利

電針對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能及海馬Nogo-A、NgR表達(dá)的影響*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年神經(jīng)科(西安710004)

王 輝 何 婭▲陳松盛 馬巧亞 王銳利

目的：了解電針對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠認(rèn)知功能及海馬區(qū)Nogo-A、NgR表達(dá)的影響。方法：雙側(cè)海馬注射Aβ1-40制備大鼠AD模型，1周后加電針治療，第5周行水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知功能，并用Western Blot方法檢測(cè)海馬區(qū)Nogo-A、NgR表達(dá)的變化。結(jié)果：水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期在AD組大鼠較假手術(shù)組顯著延長(zhǎng)(P<0.05),而AD+電針組較AD組顯著縮短(P<0.05)。原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間占總時(shí)間的比值A(chǔ)D組大鼠顯著低于假手術(shù)組(P<0.05),而AD+電針組則顯著高于AD組(P<0.05)。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示：AD組大鼠較假手術(shù)組Nogo-A表達(dá)增高,NgR表達(dá)降低，AD+電針組大鼠較AD組Nogo-A表達(dá)則相對(duì)下調(diào)，NgR表達(dá)相對(duì)上調(diào)。結(jié)論：AD大鼠海馬區(qū)Nogo-A表達(dá)增高,NgR表達(dá)降低,可能與AD的病理改變有一定聯(lián)系。電針治療能明顯改善AD大鼠的認(rèn)知功能,上調(diào)NgR表達(dá)可能是其機(jī)制之一。

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶力減退、日常生活能力下降和精神行為異常等，它嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，也給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Amyloid protein β,Aβ)沉積形成的老年斑和tau蛋白異常聚集導(dǎo)致的神經(jīng)纖維原纏結(jié)是AD兩個(gè)特征性的病理變化。研究認(rèn)為[1-4],AD患者腦內(nèi)海馬區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A及其受體NgR的異常表達(dá),且這些蛋白異常表達(dá)與AD的病理改變有一定的聯(lián)系。電針在臨床上常用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療,療效肯定,但其作用機(jī)制不詳[5-6]。本實(shí)驗(yàn)用Aβ1-40雙側(cè)海馬區(qū)注射制備大鼠AD模型,加用電針治療,采用水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知功能,并用Western Blot方法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)Nogo-A、NgR蛋白表達(dá)的變化,了解電針對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能的影響及其可能的機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 成年健康清潔級(jí)雄性SD大鼠36只(220～250g),由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自由飼養(yǎng)1周,行水迷宮實(shí)驗(yàn)排除訓(xùn)練異常的大鼠。動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組12只、AD模型組12只、AD模型+電針治療組12只，術(shù)前12h禁食,自由飲水。Aβ1-40、NgR抗體為海南醫(yī)學(xué)院馬琳教授惠贈(zèng),Aβ1-40使用前溶于滅菌的雙蒸水配成濃度5g/L的溶液,37℃孵育7d。Nogo-A抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

2 方 法 ①大鼠AD模型的制備：按照2%異戊巴比妥50mg/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后的大鼠俯臥于大鼠立體定向儀上,門齒鉤、耳棒固定頭部,使前后囟在同一平面上,剪去頭頂部毛發(fā),正中切口,分離暴露前囟。參照大鼠腦立體定向圖譜,按照海馬CA1坐標(biāo)確定進(jìn)針點(diǎn)位于前囟后3mm，向左右各旁開2.2mm，做好標(biāo)記，顱鉆鉆一小孔，深度以鉆透顱骨不傷及硬腦膜為宜,使用立體定向儀配套的夾持器將微量注射器從定位處緩慢穿入，深度為2.8mm,緩慢注入Aβ1-40 1μl,注射時(shí)間為5min，留針5min，緩慢退出微量注射器。雙側(cè)均注射結(jié)束后用牙科水泥封固顱骨孔，縫合切口，局部消毒，術(shù)后每只大鼠腹腔注射青霉素8萬(wàn)U。術(shù)后將大鼠保持側(cè)臥位，60W白炙燈照射使肛溫保持在 37℃左右，注意吸痰保持呼吸道通暢，待大鼠清醒后放回籠內(nèi)。假手術(shù)組除雙側(cè)注入生理鹽水外，其余操作同手術(shù)組。②電針治療：AD+電針組大鼠于AD模型制備后1周行電針治療。參考《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》定位[7]，于大鼠頭部正中兩耳間取“百會(huì)”，前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)約3mm的尺橈骨間取“內(nèi)關(guān)”，第2腰椎棘突下旁開1寸取“腎俞”，大鼠后肢膝部外側(cè)前下方取“足三里”。采用28號(hào)0.5寸不銹鋼毫針，“百會(huì)”平刺1～2mm，“腎俞”稍向內(nèi)斜刺5mm，“內(nèi)關(guān)”直刺1mm，行提插捻轉(zhuǎn)平補(bǔ)平瀉法，“足三里”直刺5mm，加用“三元牌”電針儀(型號(hào)G6805-Ⅲ)，采用疏密波刺激以上穴位,頻率2Hz,電壓為2V,每次20min,連續(xù)治療20d。③水迷宮實(shí)驗(yàn)：所有大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)前及AD模型制備后第5周分別行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮為直徑1.2m的圓形水池,水深約30cm,水溫23～25℃左右,迷宮上方裝有攝像頭并與計(jì)算機(jī)相連，應(yīng)用水迷宮分析軟件可記錄大鼠的游泳軌跡等數(shù)據(jù)。迷宮池壁內(nèi)側(cè)標(biāo)明4個(gè)入水點(diǎn),將水池隨意分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限,在象限Ⅱ中央設(shè)置一個(gè)平臺(tái),平臺(tái)距水面約2cm。獲得性訓(xùn)練：每天4次,將大鼠分別從4個(gè)象限頭朝池壁投入水池,記錄其尋找到平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期,最長(zhǎng)限制時(shí)間為120s,若120s內(nèi)未找到平臺(tái)，則逃避潛伏期記為120s，并由實(shí)驗(yàn)人員引導(dǎo)其游到平臺(tái)，讓其在平臺(tái)休息30s后擦干身體放入籠中休息，再投入其它大鼠。所有大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行1天的獲得性訓(xùn)練,每只大鼠4次，若其中有2次不能在120s內(nèi)找到隱藏的平臺(tái)，則被視為訓(xùn)練異常,不納入實(shí)驗(yàn)。AD模型制備后第5周進(jìn)行的水迷宮實(shí)驗(yàn)共有兩項(xiàng)內(nèi)容，其中獲得性訓(xùn)練共進(jìn)行5d(分別記為D1～D5)，每天4次，取4次的均值記為當(dāng)天的逃避潛伏期數(shù)據(jù)。第二項(xiàng)內(nèi)容是探查訓(xùn)練：完成獲得性訓(xùn)練的第二天撤去平臺(tái)，記錄其在一定時(shí)間內(nèi)的游泳軌跡，計(jì)算大鼠在象限Ⅱ(原平臺(tái)所在象限)游泳的時(shí)間與總時(shí)間的比值，考察大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶。④Nogo-A、NgR蛋白檢測(cè)：采用Western blot方法進(jìn)行。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠于10%水合氯醛3.5ml/kg體重腹腔注射麻醉,斷頭取腦,迅速分離海馬組織,液氮速凍,后置于-80℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)取大鼠海馬組織勻漿后提取總蛋白，用蛋白試劑盒定量,將3組大鼠海馬的蛋白樣品上樣,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,再將電泳凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉后分別加入抗Nogo-A、NgR抗體,后加入酶標(biāo)二抗依次反應(yīng),ECL顯色。結(jié)果用光密度掃描計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析,以背景光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正,計(jì)算Nogo-A、NgR蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

結(jié) 果

1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 在獲得性訓(xùn)練中，每組大鼠的逃避潛伏期均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增多而逐漸縮短。與假手術(shù)組相比,AD模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從第2天開始,與AD組相比，AD+電針治療組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見(jiàn)表1)。在探查訓(xùn)練中,AD組大鼠在象限Ⅱ的游泳時(shí)間占總時(shí)間的比值明顯低于假手術(shù)組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。AD+電針組大鼠在象限Ⅱ的游泳時(shí)間占總時(shí)間的比值明顯高于AD組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)性意義(P<0.05)。(見(jiàn)表2)。

表1 獲得性訓(xùn)練中大鼠的逃避潛伏期

注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與AD組比較**P<0.05

表2 探查訓(xùn)練中大鼠在水池各象限游泳的時(shí)間與總時(shí)間的比值

注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與AD組比較**P<0.05

2 Nogo-A、NgR蛋白檢測(cè) Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示：相對(duì)于假手術(shù)組，AD組大鼠Nogo-A表達(dá)明顯增高，NgR表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖1)；而相對(duì)于AD組，AD+電針組大鼠Nogo-A表達(dá)下調(diào)，NgR表達(dá)上調(diào), 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖1 三組大鼠Nogo-A蛋白Western Blot結(jié)果(*P<0.05)

圖2 三組大鼠NgR蛋白Western Blot結(jié)果(*P<0.05)

討 論

海馬是參與學(xué)習(xí)記憶的重要器官，AD的病理改變首先出現(xiàn)在海馬-內(nèi)嗅皮層,影像學(xué)的研究也發(fā)現(xiàn)AD患者雙側(cè)海馬體積明顯縮小。在本實(shí)驗(yàn)中,大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ1-40后表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知功能下降癥狀,提示AD模型構(gòu)建成功。本實(shí)驗(yàn)中AD+電針治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力雖明顯低于假手術(shù)組,但仍顯著高于AD組，提示電針治療能明顯改善阿爾茨海默病大鼠的認(rèn)知功能。

Nogo-A是一種抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的髓鞘相關(guān)蛋白，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白R(shí)TN家族成員，被認(rèn)為是阻礙中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損神經(jīng)軸突再生修復(fù)的重要因素。NgR是位于細(xì)胞膜表面能夠與Nogo-A的Nogo-66區(qū)域特異結(jié)合的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)[3]NgR與P75或TAJ/TROY、Lingo-1組成受體復(fù)合物，Nogo-A與其結(jié)合后，激活下游的RhoA激酶，使無(wú)活性的Rho-GDP轉(zhuǎn)變成有活性的Rho-GTP,后者進(jìn)而激活ROCK，通過(guò)影響肌動(dòng)-肌球蛋白系統(tǒng)導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)錐的塌陷，發(fā)揮其神經(jīng)生長(zhǎng)抑制作用。Nogo-A、NgR在動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)。隨著研究的深入,人們逐漸發(fā)現(xiàn)Nogo-A、NgR與阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。

He等[8]研究發(fā)現(xiàn)RTN家族成員可與β淀粉樣前體蛋白APP的轉(zhuǎn)換酶BACE1結(jié)合，減少對(duì)APP的酶切，抑制Aβ產(chǎn)生。Park等[9]研究發(fā)現(xiàn)NgR與APP可相互作用減少Aβ分泌，敲除NgR基因的AD小鼠Aβ水平升高，老年斑形成增加。同年他們還報(bào)道[10]，在敲除NgR基因的AD小鼠，皮下給予可溶性的Nogo受體片段NgR-Fc能夠減少腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生，提高動(dòng)物的認(rèn)知能力。對(duì)于NgR在海馬區(qū)的表達(dá)有研究得出了不同的結(jié)論，唐寒芬等[11]研究發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病大鼠海馬區(qū)NgR表達(dá)下降。雖然NgR作為阿爾茨海默病一個(gè)可能的治療方向引起了研究者的廣泛關(guān)注，但對(duì)于Nogo-A及NgR在AD發(fā)生發(fā)展中的作用尚需進(jìn)一步的研究。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)電針刺激相應(yīng)穴位能夠?qū)Χ喾N中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，已有很多研究[12]證實(shí)電針對(duì)阿爾茨海默病療效肯定，但機(jī)制尚不明確。目前有很多相關(guān)的學(xué)說(shuō)，如：調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、抗氧化應(yīng)激、改善神經(jīng)元突觸的可塑性、提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量、抑制tau蛋白的表達(dá)、降低Aβ的水平、上調(diào)自噬活性等。

本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot檢測(cè)大鼠海馬區(qū)Nogo-A、NgR蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在AD組大鼠Nogo-A表達(dá)較假手術(shù)組明顯增高，NgR表達(dá)則明顯降低。與唐寒芬等的研究結(jié)果一致，而與Zhu等人的研究結(jié)果似乎矛盾。考慮可能的原因：Zhu等的研究曾提示，在阿爾茨海默病患者海馬的CA1、CA2區(qū)NgR表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞占整個(gè)錐體層細(xì)胞的百分比明顯高于對(duì)照組患者，而在CA3、CA4區(qū)域未觀察到這種差別。本實(shí)驗(yàn)中未對(duì)海馬組織的亞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步詳細(xì)區(qū)分，且動(dòng)物樣本量不夠大，可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致。另外，Zhu等的研究對(duì)象是AD患者，與大鼠的表達(dá)是否一致尚需進(jìn)一步研究。加之研究方法以及AD病程等方面的不一致也是可能的原因。由于Nogo-A與BACE1以及NgR與APP有相互作用位點(diǎn)，因此Nogo-A與NgR的異常表達(dá)可能與AD的病理改變有一定的聯(lián)系。

實(shí)驗(yàn)中觀察到，相對(duì)于AD組，AD+電針治療組大鼠海馬區(qū)Nogo-A表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參考He等的研究，Nogo-A作為Aβ沉積的負(fù)性調(diào)控因子，表達(dá)下調(diào)有利于Aβ沉積，不利于大鼠認(rèn)知功能的改善，因此我們推斷Nogo-A表達(dá)下調(diào)可能與神經(jīng)再生方面的調(diào)控有關(guān)。同時(shí)我們還觀察到，AD+電針治療組大鼠海馬區(qū)NgR表達(dá)上調(diào)。參考Park等人的研究，NgR能夠減少Aβ的產(chǎn)生，從而有利于認(rèn)知功能的改善，這可能是電針治療改善AD大鼠認(rèn)知功能的機(jī)制之一。

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(收稿：2014-09-22)

Effects of electro-acupuncture on cognitive functions and expression of Nogo-A and NgR in hippocampus of Alzheimer’s disease rats

Department of Elderly Neurology, The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Wang Hui He Ya Chen Songsheng et al

Objective：To observe the effects of electro-acupuncture on cognitive functions and expression of Nogo-A and NgR in hippocampus of Alzheimer’s disease rats.Methods：The rats of Alzheimer’s disease were established by injection β amyloid 1-40 into bilateral hippocampus and were treated with electro-acupuncture for twenty days after one week. The cognitive functions were evaluated by Morris water maze testing in fifth week and the expression of Nogo-A and NgR in hippocampus were detected by Western Blot.Results：The escape latency of rats in AD group was significantly longer than that in sham-operated group and was significantly shorter in electro-acupuncture group than that in AD group. The percentage of swimming time in the original quadrant in AD group was significantly lower than that in sham-operated group and was significantly higher in electro-acupuncture group than in AD group. The down-regulated Nogo-A and up-regulated NgR were discovered in AD group and were corrected by electro-acupuncture.Conclusion：The Nogo-A up-regulation and NgR down-regulation in AD rats have relationship with the pathological changes. The treatments of electro-acupuncture obviously improved the cognitive functions, of which the change of NgR expression are supposed to be one of the mechanisms.

Alzheimer disease Hippocampus Electroacupuncture @Nogo-A @NgR

*陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目資助[2006K13-G1(7)]

▲通訊作者

阿爾茨海默病 海馬 電針 @Nogo-A @NgR

R749.16

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.006