扶芳藤益心方對(duì)缺氧/復(fù)氧后人心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用

李成林 江會(huì)鎮(zhèn) 陳博靈 盧健琪 潘朝鋅 王慶高

湖北中醫(yī)藥大學(xué)(武漢 430000)

扶芳藤益心方對(duì)缺氧/復(fù)氧后人心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用

李成林 江會(huì)鎮(zhèn)△陳博靈▲盧健琪▲潘朝鋅▲王慶高▲

湖北中醫(yī)藥大學(xué)(武漢 430000)

目的：研究扶芳藤益心方對(duì)缺氧/復(fù)氧后人心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUMCE)增殖的影響。方法：取體外培養(yǎng)的第4代HUMCE分為造模組：扶芳藤益心方組(FY)、益心方組(Y)、卡托普利高、中、低濃度組(10-2μmol/L、10-3μmol/L、10-4μmol/L)、對(duì)照組(H/R)和非造模組(N)。造模組行缺氧/復(fù)氧(H/R)處理，非造模組不做缺氧/復(fù)氧處理,兩組均添加相應(yīng)的含藥血清干預(yù)培養(yǎng)24h后，通過MTT法測定各組OD值，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測各組血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量。結(jié)果：與造模組比較，非造模組OD值大(P<0.05)，VEGFR-2、VEGF含量與Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)均高于造模組(P<0.05)。與對(duì)照組比較，扶芳藤益心方組OD值高(P<0.05)；Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)升高9.87%(P<0.05)；VEGFR-2、VEGF濃度升高(P<0.05)。與扶芳藤益心方組比較，益心方組、卡托普利中、低劑量組OD值低，卡托普利高劑量組OD值高(P<0.05)；卡托普利低劑量組VEGFR-2、VEGF濃度低(P<0.05)，卡托普利高、中劑量組均高于扶芳藤益心方組(P<0.05)；益心方組、卡托普利中、低劑量組Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)分別較扶芳藤益心方組降低6.77%、2.49%、5.7%，卡托普利高劑量組升高4.39%(P<0.05)。結(jié)論：扶芳藤益心方可以提高內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧后的增殖活性，降低內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，優(yōu)于益心方組、卡托普利低、中劑量組，且提高缺氧/復(fù)氧損傷后內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-2、VEGF濃度，優(yōu)于卡托普利低濃度組和益心方組，改善內(nèi)皮功能。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor VEGF)是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子。生理情況下，VEGF及其受體的表達(dá)水平均很低，只有在內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)才會(huì)有增殖效應(yīng)。缺血缺氧是VEGF最強(qiáng)有力的調(diào)控因素。VEGFR主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞。缺氧對(duì)受體表達(dá)也起重要調(diào)節(jié)作用。Waltenberger發(fā)現(xiàn)，缺氧時(shí)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR-2水平上升,而VEGFR-2mRNA仍保持穩(wěn)定甚至有所下降。研究發(fā)現(xiàn)，無論在生理還是在病理情況下，均能促進(jìn)新生血管的形成，調(diào)節(jié)血管生成的大多數(shù)環(huán)節(jié)，包括內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)溶解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生和管腔形成、增加細(xì)胞間黏附和血管細(xì)胞黏附分子水平及誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)的配體和受體的表達(dá)等。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是心血管性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]，心臟缺血再灌注過程中最先波及的基本部位也是最關(guān)鍵的部位是心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞[2]，它是諸多毒素、病毒、炎癥因子等的重要靶位，該部位的變化對(duì)各組織、器官的損傷和功能的恢復(fù)影響巨大[3-5]。壯醫(yī)認(rèn)為，心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損害可歸屬于壯醫(yī)“龍路病”范疇，人體氣血虛弱的基礎(chǔ)上，邪毒滯留龍路，使局部的“龍路”網(wǎng)絡(luò)瘀阻不暢，終致道路不通、天地人三部之氣不能同步運(yùn)行、氣血瘀滯而發(fā)病。治療當(dāng)以補(bǔ)虛、通龍路、祛瘀為大法。根據(jù)壯醫(yī)組方理論，針對(duì)補(bǔ)虛、通路、祛瘀治法，需投以公藥進(jìn)行組方。筆者自擬以扶芳藤為君、人參和三七為臣、石菖蒲為佐使的扶芳藤益心方及去扶芳藤的益心方(以下簡稱益心方)，觀察試驗(yàn)中對(duì)缺氧/復(fù)氧后人心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法 1.1 試 劑 MTT試劑盒(Sigma公司)，卡托普利純粉(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司提供，批號(hào)：K0164)，VEGFR、VEGF試劑盒(武漢華美，批號(hào)：Y19012415，Y05012414)，一抗：Rabbit Anti-active-Caspase-3 antibody (ab4051)同型對(duì)照：兔IgG (碧云天A7016)，二抗：FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(ab6717)。

1.2 主要儀器與動(dòng)物 酶標(biāo)儀(BioTek公司)，Millpore Guava 6HT 流式細(xì)胞儀，Eppendorf冷凍離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)(天津，型號(hào)：UV-1800)，SD大鼠，SPF級(jí)，180～220g，雌雄各半(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，原代人心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞、原代內(nèi)皮細(xì)胞特制培養(yǎng)體系(武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，HUM-CELL-0017，)，扶芳藤益心方醇提膏、益心方醇提膏(廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提取，藥材紅參、三七、石菖蒲由南寧市景昌中藥飲片有限公司提供，扶芳藤由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供)。

1.3 制備含藥血清 12只SD大鼠分為扶芳藤益心方組(FY)、益心方組(Y)和空白組，每組4只大鼠，雌雄各半。按所需濃度稱取卡托普利純粉溶解在大鼠血清中制備卡托普利藥物血清。根據(jù)表1，配成藥液，4℃保存。FY組、Y組大鼠以20mL/Kg藥液濃度灌胃，空白組以20mL/Kg的蒸餾水灌胃，連續(xù)3d，1d2次。第3d最后1次給藥1h后，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2h后，3000r/min離心分離血清，56℃水浴滅活，0.22μm無菌濾器過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 扶芳藤益心方及益心方藥液配置

注：人用劑量這里扶芳藤益心方以臨床日用劑量58g生藥/人/次；益心方為28g生藥/人/次

1.4 試驗(yàn)分組與H/R模型造模 按照說明書用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng) HUMCE。取第3代HUMCE隨機(jī)分為非造模組(N)和造模組：對(duì)照組(H/R)、卡托普利組(高(CAP1)、中(CAP2)、低(CAP3))、扶芳藤益心方組(FY)、益心方組(Y))。造模組細(xì)胞，預(yù)先用純氮?dú)怙柡虳MEM培養(yǎng)基10min，并充入純氮?dú)馀艃襞囵B(yǎng)瓶中氧氣后，密封置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中2h后，換未經(jīng)處理的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。N組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)同等時(shí)間。

1.5 MTT法 調(diào)整非造模組與造模組HUMCE密度至每孔3×104/mL，按實(shí)驗(yàn)分組接種到96孔培養(yǎng)板中，且每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后棄各組細(xì)胞上液，F(xiàn)Y、Y、CAP1、CAP2、CAP3各組均加入100μL相應(yīng)的含藥血清，N、H/R組另加入100μL空白大鼠血清，將各組均放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12h后，向每孔中加入10μLMTT溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育4h，棄上液，每孔加入150μLDMSO，在搖床上低速振蕩10min。用酶標(biāo)儀測定在490nm處吸光值OD。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測 檢測細(xì)胞Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)及平均熒光強(qiáng)度 收集各組實(shí)驗(yàn)干預(yù)后細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備1×105/100μL細(xì)胞懸液，加入100μL 4%多聚甲醛4℃放置15mins,PBS洗細(xì)胞4次，每次400g,5min,100μL 0.1%Triton 4℃放置5min，PBS洗細(xì)胞4次，每次400g,5min,100μL Anti-Caspase-3 antibody(1∶100比例稀釋)或兔IgG(1∶100比例稀釋)，4℃放置30min，PBS洗細(xì)胞4次，每次400g,5min,100μFITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶100比例稀釋)，4℃放置30min，PBS洗細(xì)胞4次，每次400g,5min，加入200μ的PBS，上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.7 ELISA法檢測 檢測VEGFR-2、VEGF濃度:取試驗(yàn)處理后各組細(xì)胞上液，按ELISA試劑盒說明操作。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)所測得結(jié)果為計(jì)量資料表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間單因素比較采用方差分析，P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3.1 對(duì)H/R后HUMCE增殖和凋亡的的影響

表2 MTT法檢測各組細(xì)胞在490nm波長吸光值(OD值)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(±s)

注：與非造模組比較，▲(P<0.05)；與扶芳藤益心方組比較，△(P<0.05)；與益心方組比較，□(P<0.05)

如表2所示，缺氧/復(fù)氧降低HUMCE的增殖活性且顯著降低,扶芳藤益心方對(duì)H/R后HUMCE具有明顯增殖作用和抑制凋亡的作用。

3.2 扶芳藤益心方對(duì)Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)及平均熒光強(qiáng)度影響 圖1所示，扶芳藤益心方可提高H/R后HUMCE的增殖活性，且優(yōu)于益心方組，卡托普利中、低劑量組(P<0.05)。 與扶芳藤益心方組比較，益心方組，卡托普利中、低劑量組Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)分別較扶芳藤益心方組降低6.77%、2.49%、5.7%，卡托普利高劑量組升高4.39%(P<0.05)。

3.3 扶芳藤益心方對(duì)VEGFR-2、VEGF濃度的影響

表3 ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞VEGFR-2、VEGF濃度統(tǒng)計(jì)結(jié)果(±s)

注：與非造模比較，▲P<0.05；與FY比較，△P<0.05；與Y組比較，對(duì)照組P<0.05

表3所示，扶芳藤益心方可以提高H/R損傷后HUMCE的VEGFR-2、VEGF濃度，且優(yōu)于益心方組、卡托普利低劑量組(P<0.05)，但低于卡托普利高、中劑量組(P<0.05)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)用散點(diǎn)圖表示，右上角表示陽性細(xì)胞的百分 IgG

4 討 論 《素問》:“血?dú)獠缓?百病乃變化而生”，“血能載氣，氣能行血”。壯醫(yī)認(rèn)為：“疾患并非無中生，乃系氣血不均衡”。心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血損傷大多由高血壓病、冠心病等疾病所致，中醫(yī)可以歸納為“胸痹”、“心悸”、“怔忡”等范疇，壯醫(yī)可以歸納為“龍路病”，中醫(yī)和壯醫(yī)均認(rèn)為由氣血不調(diào)所致，以益氣活血通絡(luò)為治療原則。扶芳藤益心方中，扶芳藤、人參、三七、石菖蒲均為公藥，其中扶芳藤是特色壯藥，《中國壯醫(yī)學(xué)》載：“扶芳藤，辛、平，能通火路、龍路，舒筋脈，止出血，散瘀血，補(bǔ)虛”，具有補(bǔ)虛、活血止血、通脈絡(luò)的扶芳藤在方中為主藥;人參擅長補(bǔ)氣、三七擅長祛瘀，二藥共為幫藥，協(xié)助主藥，增強(qiáng)主藥的作用?！吨袊鴫厌t(yī)學(xué)》載：“三七，甘、微苦、溫，具有止血，除瘀血，通龍路，消腫，止疼痛”?！稄V西本草選編》載：“石菖蒲，化痰開竅，化濕和胃，醒神益智，可溫通龍路?！笨v觀全方，公藥、主藥、幫藥、帶藥合用，符合壯醫(yī)理論的組方原則。根據(jù)中醫(yī)理論及理法方藥原則，要遵循君臣佐使進(jìn)行組方，該扶芳藤益心方中，以扶芳藤為君，人參、三七為臣，石菖蒲為佐使藥。故本方既符合中醫(yī)組方原則，又符合壯醫(yī)理論的組方原則，四藥合用，更大地發(fā)揮益氣活血通絡(luò)之功。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，表2、圖1結(jié)果顯示，扶芳藤益心方可以顯著改善H/R后內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性，且較益心方，卡托普利低劑量組效果明顯；扶芳藤益心方還能提高內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)，分別較益心方、卡托普利中、低劑量提高6.77%、2.49%、5.7%。表3結(jié)果顯示，扶芳藤益心方通過提高H/R后內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-2、VEGF濃度，促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管重建，從而維持微血管內(nèi)皮的完整性及功能，且優(yōu)于益心方與卡托普利低劑量組。綜上所述具有益氣活血通絡(luò)功效的扶芳藤益心方能夠改善心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性及內(nèi)皮功能，而且效果均優(yōu)于益心方和卡托普利中、低劑量組，為將扶芳藤益心方開發(fā)為改善缺氧/復(fù)氧損傷后心內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖藥物提供了理論依據(jù)。

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(收稿2014-12-19；修回2015-01-18)

微血管 內(nèi)皮細(xì)胞 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠 @扶芳藤益心方

R29

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.047

△廣西中醫(yī)藥大學(xué) (南寧 530001)

▲廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 ( 南寧 530023)