大鼠不同部位脂肪形態(tài)及功能的差異

王晨，劉娟，孫坤，俞靜，丁國憲

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學科，江蘇 南京 210029)

·論 著·

大鼠不同部位脂肪形態(tài)及功能的差異

王晨，劉娟，孫坤，俞靜，丁國憲

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學科，江蘇 南京 210029)

目的:探討大鼠不同部位脂肪組織形態(tài)和功能差異，為更好地解釋代謝綜合征的發(fā)病機制提供依據。方法:收集SD大鼠各部位脂肪組織樣本，采用HE染色方法觀察脂肪細胞大小和形態(tài)，行細胞RNA抽提及cDNA轉錄，應用實時定量PCR檢測脂肪相關基因表達，抽提總蛋白并應用Western blot方法檢測脂肪特異性功能蛋白表達。結果：附睪旁、腎周、腸系膜周圍等內臟脂肪細胞較皮下脂肪細胞體積大，肩胛間、肩胛下、脊柱旁等棕色脂肪細胞最小。棕色脂肪功能基因(UCP-1、Cidea、PGC-1α)在大鼠的肩胛下、肩胛間、甲狀腺下、脊柱旁脂肪組織高度表達，與經典白色脂肪(附睪旁脂肪)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而皮下白色脂肪組織(white adipose tissue， WAT)(如腹股溝、腋下、甲狀腺旁)及內臟WAT(如附睪旁、腎周、腸系膜周圍)則以白色脂肪功能基因(AP2、HOXC9、Leptin)表達為主，與經典棕色脂肪(肩胛下脂肪)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且經典皮下WAT(腹股溝皮下)和經典內臟WAT(附睪旁)的棕色、白色脂肪功能基因表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。附睪旁、腎周、腸系膜周圍等內臟脂肪組織炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1表達水平較高，與經典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：不同部位脂肪組織細胞大小以及炎癥狀態(tài)的差異，可能與代謝綜合征的發(fā)病機制密切相關，而脂肪的棕色功能差異可能與代謝紊亂疾病的發(fā)生無明顯相關性。

棕色脂肪；功能；炎癥；代謝綜合征

近來研究顯示，脂肪組織不僅是儲能的重要組織，也是人體最大的內分泌器官，可通過其分泌因子如脂肪因子、炎癥因子、棕色化因子等調控周圍器官的功能[1-2]。已知腹型肥胖與代謝綜合征的關系較單純性肥胖更為密切[3]，提示不同部的位脂肪其功能亦有所差別。目前尚未有關于動物或人體不同部位脂肪功能的探討。本研究以大鼠為實驗對象，探討不同部位脂肪組織形態(tài)、功能基因及蛋白表達差異，為更好地解釋代謝綜合征的發(fā)病機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物 健康雄性SD大鼠10只，非特定病原體(SPF)級，體重(220±10) g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2試劑 RNA提取液Trizol(Invitrogen公司，美國)，鼠白血病病毒反轉錄酶、三磷酸脫氧核酸核苷、RNA水解酶抑制劑等逆轉錄所用試劑(Promega公司，美國)，熒光定量PCR 試劑Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo公司，日本)。UCP-1蛋白一抗(Abcam公司，美國)，Tublin蛋白一抗(Sigma公司，美國)，UCP-1、Tublin蛋白二抗(Vector公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1脂肪樣本收集 采用脊柱脫臼法處死所有大鼠，解剖暴露脂肪組織，拍攝大體標本照片，將腹股溝、附睪旁、腸系膜周圍、腎周、腋下、肩胛間、肩胛下、脊柱旁、甲狀腺旁、甲狀腺下脂肪組織取出，于-70 ℃凍存以備后續(xù)實驗。

1.2.2脂肪組織HE染色 取大鼠各部位脂肪，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，浸泡于10%甲醛中固定，送病理實驗室行石蠟包埋、切片、水化、漂洗、封閉、HE染色，光鏡觀察。

1.2.3細胞RNA抽提及cDNA轉錄 取凍存的大鼠不同部位脂肪組織各100 mg，融化后分別加入Trizol 1 ml，勻漿機破碎組織，按RNA提取試劑盒的說明進行細胞總RNA抽提及cDNA逆轉錄。

1.2.4相關基因的檢測 以cDNA為模板，用相關引物進行實時熒光定量PCR擴增，引物設計見表1?？偡磻w系為20 μl，反應條件:95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s；40個循環(huán)，繪制熔解曲線。讀取Ct值，以β-actin基因作為內參照計算樣品目的基因與內參照之間的拷貝數之比，并進行統(tǒng)計分析。

1.2.5組織總蛋白抽提及Western blot檢測 取凍存的相關組織融化后勻漿，按照試劑盒說明書提取組織蛋白并測其濃度，加入loading buffer，煮沸5 min使蛋白變性；行聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%分離膠和5%濃縮膠)；轉膜，用5%TBST配制的牛奶封閉1 h；分別加入UCP-1一抗(1∶3 000)、Tublin一抗(1∶2 500)，UCP-1二抗(1∶30 000)、Tublin二抗(1∶20 000)孵育。按發(fā)光液試劑盒(美國Pierce公司)說明進行發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學處理

數據用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析，結果采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 脂肪部位及形態(tài)

腸系膜、附睪、腎臟等內臟周圍脂肪細胞較甲狀腺旁、腋下、腹股溝等皮下脂肪細胞體積大；肩胛間、脊柱旁、肩胛下等棕色脂肪細胞與內臟、皮下白色脂肪細胞相比，棕色脂肪細胞體積及脂滴空泡明顯小(圖1)。

表1 實時定量PCR引物序列

A.甲狀腺旁脂肪；b.腹股溝皮下脂肪；c.腋下脂肪；d.肩胛間棕色脂肪；e.脊柱旁脂肪；f.肩胛下脂肪；g.腸系膜周圍脂肪；h.附睪旁脂肪；i.腎周脂肪 HE ×10

圖1 SD大鼠各部位脂肪組織HE染色

2.2 相關脂肪基因表達

棕色脂肪功能基因(UCP-1、Cidea、PGC-1α)在大鼠的肩胛下、肩胛間、甲狀腺下、脊柱旁脂肪組織中高度表達，與經典白色脂肪(附睪旁脂肪)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而皮下白色脂肪組織(white adipose tissue， WAT)(如腹股溝皮下、腋下、甲狀腺旁)及內臟WAT(如附睪旁、腎周、腸系膜周圍)則以白色脂肪功能基因(AP2、HOXC9、Leptin)表達較高，與經典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且經典皮下WAT(腹股溝皮下)和經典內臟WAT(附睪旁)的棕色、白色脂肪功能基因表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。附睪旁、腎周、腸系膜周圍等內臟脂肪組織炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1表達水平較高，與經典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

A

B

C

A.大鼠附睪旁、腋下、腎周、腸系膜、甲狀腺旁、腹股溝皮下、肩胛間、肩胛下、甲狀腺下、脊柱旁脂肪組織棕色脂肪功能基因(UCP-1、Cidea、PGC-1α)mRNA的表達量，與經典白色脂肪(附睪旁脂肪)相比差異有統(tǒng)計學意義(aP<0.05)；B.大鼠附睪旁、腋下、腎周、腸系膜、甲狀腺旁、腹股溝皮下、肩胛間、肩胛下、甲狀腺下、脊柱旁脂肪組織白色脂肪功能基因(AP2、Leptin、HOXC9)mRNA的表達量，與經典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比差異有統(tǒng)計學意義(aP<0.05)；C.大鼠附睪旁、腋下、腎周、腸系膜、甲狀腺旁、腹股溝皮下、肩胛間、肩胛下、甲狀腺下、脊柱旁脂肪組織炎癥因子(TNF-α、IL-6、MCP-1) mRNA的表達量，與經典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比差異有統(tǒng)計學意義(aP<0.05)

圖2 SD大鼠各部位脂肪基因表達

2.3 脂肪特異性功能蛋白表達

脂肪棕色功能標志UCP-1蛋白在大鼠的脊柱旁、肩胛間、心周脂肪組織表達量高于其他部位，皮下WAT和內臟WAT(除心周脂肪)的UCP-1蛋白表達量無明顯差異(圖3)。

圖3 SD大鼠各部位脂肪UCP1蛋白表達

3 討 論

隨著社會經濟的發(fā)展，代謝綜合征的發(fā)病率逐年升高，已嚴重威脅人類健康，脂肪組織與其發(fā)病機制密切相關。研究發(fā)現，皮下、內臟周圍等不同部位脂肪組織功能的差異并非周圍環(huán)境所致，而是因其內在的根本性差異。哺乳動物主要含有WAT和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)兩種。目前認為，皮下WAT和BAT參與維持機體能量的穩(wěn)態(tài)和代謝的平衡，而內臟WAT則參與代謝性疾病的發(fā)生。WAT主要通過分泌多種脂肪因子、炎癥因子等影響機體代謝[4]。BAT主要是通過線粒體解耦聯蛋白-1(uncoupling protein 1，UCP-1)來發(fā)揮產熱和消耗能量的作用。人體的相關研究發(fā)現，大網膜、腎周、附睪旁等部位的內臟WAT與胰島素抵抗、糖尿病等心血管疾病危險因素的相關性比大腿、臀部處的皮下WAT更高[4-6]。本研究發(fā)現，棕色脂肪功能基因(UCP-1、Cidea、PGC-1α)在大鼠的肩胛下、脊柱旁、甲狀腺下脂肪組織高度表達，而皮下WAT(如腹股溝、腋下、甲狀腺旁)及內臟WAT(如附睪旁、腸系膜周圍、腎周)則以白色脂肪功能基因(HOXC8、HOXC9、Leptin)表達為主，且經典皮下(腹股溝皮下)WAT和經典內臟(附睪旁)WAT的棕色、白色脂肪功能基因表達無顯著性差異。這些結果提示不同部位棕色脂肪功能的顯著差異可能并不是腹型肥胖患者更易出現代謝紊亂及心血管并發(fā)癥的重要原因。

近來研究發(fā)現，脂肪細胞的大小及功能與脂肪組織的分布密切相關，臟器周圍脂肪組織細胞體積明顯較皮下脂肪細胞大[4-6]。擴張的脂肪組織，因血液供應減少，引起脂肪細胞中細胞器如內質網、線粒體的氧化應激功能障礙，最終導致各種脂肪細胞因子分泌失常[8-9]。肥大的脂肪細胞將產生大量的促炎細胞因子，例如TNF-α、IL-6、MCP-1等。本研究在大鼠模型中亦發(fā)現附睪旁、腎周、腸系膜周圍等內臟脂肪組織上述炎癥因子的表達水平較高。這些因子將激活巨噬細胞，繼而向脂肪組織大量浸潤，導致機體處于一種慢性炎癥狀態(tài)，最終導致代謝相關性疾病的產生以及周圍臟器的功能障礙[10]。

綜上所述，不同部位的脂肪組織在代謝及內分泌功能方面存在明顯差異。內臟脂肪組織的堆積易導致胰島素抵抗、糖利用障礙及脂肪分解增加，是代謝綜合征發(fā)生的關鍵因素。本研究發(fā)現，不同部位脂肪組織細胞大小以及炎癥狀態(tài)的差異，可能與代謝綜合征的發(fā)病機制密切相關，而棕色脂肪功能差異可能與代謝紊亂疾病的發(fā)生無明顯相關性。脂肪組織的形態(tài)和部位多樣性使肥胖的治療變得更加復雜及重要，具體而有效的防治措施還有待進一步研究發(fā)現。

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Difference of the adipose forms and functions in rat′s different parts

WANG Chen，LIU Juan，SUN Kun，YU Jing，DING Guo-xian

(DepartmentofGeriatrics，theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China)

Objective: To explore the difference of adipose forms and functions in rat′s different parts in order to provide evidence for better explanation of the pathogenesis of metabolic syndrome. Methods: The adipose tissue samples of rat′s different parts were collected. HE staining was adopted to observe the sizes and forms of adipose cells. Cell RNA extraction and cDNA transcription were carried out to accept the inspection with real-time quantified PCR in respect of the expression of related genes. Total protein was extracted and applied with Western blot to inspect the expression of the specific functional protein of fat. Results: The visceral adipose cells around epididymis， kidney， and mesentery were relatively large in size than the subcutaneous adipose cells while the brown adipose cells between scapulars， below scapulars and beside spine were the smallest. The brown adipose functional genes (UCP-1， Cidea， and PGC-1α) were highly expressed in the adipose tissues below scapulars and thyroid as well as beside the spine of rats than the classic white adipose(around epididymis adipose)(P<0.05). The subcutaneous WAT (such as around groin， armpit and thyroid) as well as the visceral WAT (around epididymis， kidney and mesentery) were mainly expressed as white adipose functional genes (AP2， HOXC9 and Leptin) than the classic brown adipose(below scapulars adipose)(P<0.05)， and there was no significant difference (P>0.05) in the brown and white adipose functional gene expression of classic subcutaneous(around groin) and visceral(around epididymis) WAT. The inflammatory factors(TNF-α， IL-6 and MCP-1) had high expression level in the visceral adipose tissues around the epididymis， kidney and mesentery than the classic brown adipose(below scapulars adipose)(P<0.05). Conclusion: The difference of the adipose tissue cell size and inflammatory state in different parts of rats may be closely related to the pathogenesis of metabolic syndrome， and the difference in the brown functions of fats may has no significant correlation with the occurrence of metabolic disorders.

brown adipose tissue; function; inflammation; metabolic syndrome

2014-11-07

2015-01-22

王晨(1989-)，女，江蘇南京人，在讀碩士研究生。E-mail:343959616@qq.com

丁國憲 E-mail:dinggx_jsph@163.com

王晨，劉娟，孫坤，等.大鼠不同部位脂肪形態(tài)及功能的差異[J].東南大學學報:醫(yī)學版，2015,34(3)：399-404.

R-332

A

1671-6264(2015)03-0399-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.017