不同因素對瘋草內(nèi)生真菌合成苦馬豆素的影響

張蕾蕾，余永濤*，何生虎，趙清梅，葛 松

(1.寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021；2.北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750021；3.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術重點實驗室，銀川 750021)

不同因素對瘋草內(nèi)生真菌合成苦馬豆素的影響

張蕾蕾1，余永濤1*，何生虎1，趙清梅2,3，葛 松1

(1.寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021；2.北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750021；3.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術重點實驗室，銀川 750021)

研究不同因素對瘋草內(nèi)生真菌——Undifilumoxytropis合成苦馬豆素的影響，篩選出顯著影響U.oxytropis苦馬豆素合成的因素。將U.oxytropis分別接種到不同pH或不同濃度聚乙二醇(PEG)、L-哌可酸、L-賴氨酸、α-酮戊二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定菌絲及其發(fā)酵液中苦馬豆素，分析各條件下真菌苦馬豆素產(chǎn)率的變化。結果表明：當pH在4.5～6.5時，隨pH增加，真菌SW產(chǎn)率顯著增加(P<0.05)；當PEG質量濃度在0～32 g·L-1時，隨PEG增加，真菌苦馬豆素產(chǎn)率顯著降低(P<0.01)；當在培養(yǎng)基中添加相同量(10-3mol·L-1)的L-哌可酸、L-賴氨酸、ɑ-酮戊二酸時，L-哌可酸添加組的苦馬豆素產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)，L-賴氨酸添加組苦馬豆素產(chǎn)率顯著增加(P<0.05)；當L-哌可酸的初始濃度為10-3和10-2mol·L-1時，真菌的苦馬豆素產(chǎn)率顯著下降(P<0.05)，當其濃度為10-4mol·L-1時，苦馬豆素產(chǎn)率顯著增加(P<0.01)；當L-賴氨酸的初始濃度為10-1、10-2或10-4mol·L-1時，真菌苦馬豆素產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)。當ɑ-酮戊二酸的初始濃度分別為10-1、10-2、10-3mol·L-1時，真菌的苦馬豆素產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)。由試驗可知，低pH或添加PEG可抑制U.oxytropis中苦馬豆素的合成，L-哌可酸、L-賴氨酸、α-酮戊二酸均對U.oxytropis的苦馬豆素合成產(chǎn)生顯著影響，但對苦馬豆素合成的影響與各物質在培養(yǎng)基中的濃度密切相關。

瘋草；內(nèi)生真菌；棘豆波狀芽管蠕孢菌；苦馬豆素；生物合成

瘋草是豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的統(tǒng)稱，廣泛分布于中國西部省區(qū)和北美地區(qū)[1-2]。瘋草的主要毒性成分是吲哚里西啶生物堿——苦馬豆素(swainsonine，SW)，它可抑制動物細胞溶酶體α-甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶II的活性，導致低聚糖代謝和糖蛋白合成障礙[3]。動物長期采食瘋草會發(fā)生以神經(jīng)系統(tǒng)機能紊亂為特征的慢性中毒病，每年給草原畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2-10]。目前SW在動物機體內(nèi)的代謝機制和毒理作用機制尚未被完全闡明，動物瘋草中毒問題仍未能從根本上得到解決。近年研究表明，瘋草內(nèi)普遍存在能夠產(chǎn)生SW的內(nèi)生真菌——Undifilumoxytropis(棘豆波狀芽管蠕孢菌)，該類真菌是瘋草中SW產(chǎn)生的主要因素[11-20]。因此，闡明瘋草內(nèi)生真菌合成SW的機制，抑制或阻斷內(nèi)生真菌合成SW，將有望降低或消除瘋草的毒性，從根本上防除動物瘋草中毒病，合理利用瘋草[21]。

寄生于其他植物的病原真菌豆類絲核菌和昆蟲病原真菌金龜子綠僵菌也能合成SW，其合成SW的部分途徑已被闡明。這兩種真菌均以L-賴氨酸為初始底物，在酵母氨酸氧化酶的催化下，賴氨酸與α-酮戊二酸縮合生成L-酵母氨酸，在該酶的作用下，酵母氨酸轉化為L-2-氨基己二酸半醛，再經(jīng)過一系列酶促反應依次生成△1,6-哌啶羧酸、哌可酸，并以哌可酸為前體合成SW[22-28]。在SW的合成中，酵母氨酸脫氫酶起負調控作用，它可促進L-2-氨基己二酸半醛逆向生成L-酵母氨酸和賴氨酸，而阻止SW的合成[29]。在此基礎上，S.Mukherjee等研究了瘋草內(nèi)生真菌U.oxytropis中酵母氨酸脫氫酶對SW合成的影響，結果表明抑制酵母氨酸脫氫酶的表達可使賴氨酸和酵母氨酸的消耗量增加，而哌可酸及SW的產(chǎn)量顯著提升[30-31]，他們認為瘋草內(nèi)生真菌中SW的合成路徑可能與豆類絲核菌等相似。楊國棟[32]研究表明，L-賴氨酸、哌可酸可增加U.oxytropis中SW的產(chǎn)量，同位素示蹤試驗也表明，L-賴氨酸中被同位素N15標記的部分氮原子在賴氨酸代謝過程中被摻入到了生成的SW分子中，認為L-賴氨酸和哌可酸是瘋草內(nèi)生真菌合成SW的前體物質。此外，W.E.Oldrup[33]評估了pH、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、溫度等因素對瘋草內(nèi)生真菌SW合成的影響，結果表明低pH(pH 4.5)或高濃度PEG可使U.oxytropis的SW產(chǎn)量顯著提高。

以上研究為進一步揭示瘋草內(nèi)生真菌中SW的合成機制奠定了重要基礎，但在評估不同因素對U.oxytropis合成SW的影響時，以上研究僅是測定了真菌菌絲中SW產(chǎn)量的變化，并未對真菌培養(yǎng)基中的SW進行分析，而在K.Braun等[17]的研究中已經(jīng)確定，瘋草內(nèi)生真菌可以將產(chǎn)生的SW從菌絲分泌到培養(yǎng)基中。此外，以上研究僅分析了固定量的PEG、L-賴氨酸、哌可酸對真菌SW合成的影響，這些物質量的變化是否會對SW的合成產(chǎn)生影響還不清楚。本研究擬對不同pH、不同PEG濃度、不同L-賴氨酸、哌可酸和α-酮戊二酸濃度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)U.oxytropis真菌菌絲及其培養(yǎng)液中的SW進行綜合分析，從而確定以上因素對U.oxytropis合成SW的影響，篩選出可導致瘋草內(nèi)生真菌SW合成發(fā)生顯著改變的因素，為進一步開展瘋草內(nèi)生真菌合成SW的機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌菌株 瘋草內(nèi)生真菌菌株NX-FEL001，由張蕾蕾等[34]從寧夏黃花棘豆中分離，根據(jù)真菌的形態(tài)特征、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd)、內(nèi)部轉錄間隔區(qū)(internal transcribed space，ITS)等基因序列，進行同源性比較和遺傳進化分析，確定為U.oxytropis。

1.1.2 試劑和儀器 SW標準品，由寧夏大學臨床獸醫(yī)學重點學科實驗室從黃花棘豆中分離和純化；L-賴氨酸、L-哌可酸、α-酮戊二酸、硝基苯基-ɑ-D-甘露糖苷(p-nitrophenyl-ɑ-D-mannopyranoside substrate)、ɑ-甘露糖苷酶(ɑ-mannosidase from jack bean)、氫氧化鈉、檸檬酸、硼酸、改良基礎鹽(Murashige and skoog major salts)、水解酪蛋白均購自美國Sigma 公司；間苯三酚、谷氨酸、脯氨酸、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆辛、肌醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；KG-SX-500型高壓鍋，三洋電機株式會社日本生產(chǎn)；MIP-250型霉菌培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；QYC-2102C型搖床，上海?，攲嶒炘O備有限公司；MK3型酶標儀，Thermo Fisher公司；E438酸度計，Mettler Toledo有限公司；超純水儀，Thermo Fisher公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基按以下方法配制。

蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基[32]：MgSO4·7H2O 0.6 g，KCl 0.6 g，F(xiàn)eSO40.02 g，蔗糖 15.58 g， K2HPO40.62 g，大豆蛋白胨 0.34 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 L，氯霉素 500 mg·L-1，121 ℃高壓滅菌30 min。

ULTO培養(yǎng)基：2.7 g Murashige and skoog major salts，4.4 g酸水解蛋白，12.6 mg間苯三酚，100 mg谷氨酸，0.575 g脯氨酸，100 mg VB1，25 mg VB6，肌醇，1 L去離子水，氯霉素 500 mg·L-1，121 ℃高壓滅菌30 min。

蛋白胨無機鹽液體培養(yǎng)基[32]：MgSO4·7H2O 0.6 g，KCl 0.6 g，F(xiàn)eSO40.02 g，蔗糖 15.58 g，K2HPO40.62 g，大豆蛋白胨 0.34 g，蒸餾水 1 L，氯霉素 500 mg·L-1，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 真菌U.oxytropis的預培養(yǎng)

1.2.1.1 真菌U.oxytropis固體培養(yǎng)基的篩選：將保存的瘋草內(nèi)生真菌菌株U.oxytropisNX-FEL001接種于PDA平板上，22 ℃恒溫培養(yǎng)30 d后，用滅菌的鑷子收集菌絲于研磨器中，加入適量的滅菌水，研磨菌絲，制備菌絲懸浮液。定量取制備好的菌絲懸浮液分別均勻涂布于PDA固體培養(yǎng)基、馬鈴薯浸粉瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，22 ℃恒溫15 d后，觀察真菌的生長情況，篩選出適合真菌生長的固體培養(yǎng)基。

1.2.1.2 真菌U.oxytropis的制備：取瘋草內(nèi)生真菌菌株U.oxytropisNX-FEL001接種于PDA平板上，22 ℃恒溫培養(yǎng)30 d后，用滅菌的鑷子收集菌絲于研磨器中，加入適量的滅菌水，研磨菌絲，制備菌絲懸浮液。定量取制備好的菌絲懸浮液均勻涂布于1.2.1.1篩選出的固體平板上，22 ℃恒溫30 d待用。

1.2.1.3 真菌U.oxytropis液體培養(yǎng)基的篩選：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中制備的真菌平板上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL pH 6.5的蛋白胨無機鹽液體培養(yǎng)基和ULTO液體培養(yǎng)基中，每瓶接種10 個菌餅，每個處理條件同時做10個重復，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d，篩選出適合真菌U.oxytropis快速生長的液體培養(yǎng)基。

1.2.1.4 真菌U.oxytropis培養(yǎng)方式的篩選：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中制備的真菌平板上打孔，制成直徑6 mm的菌餅，分別接種到裝有50 mL pH 6.5的ULTO培養(yǎng)基中，每瓶接種10 個菌餅，每個處理條件同時做10個重復，一組置霉菌恒溫培養(yǎng)箱，22 ℃，靜置培養(yǎng)30 d；另一組置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d，篩選出適合真菌U.oxytropis快速生長的培養(yǎng)方式。

1.2.2 不同因素下U.oxytropis的培養(yǎng)

1.2.2.1 不同pH下U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL pH分別為4.5、5.5、6.5 的ULTO液體培養(yǎng)基中，每瓶接種10 個菌餅，每個處理條件同時做10個重復，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。

1.2.2.2 不同濃度PEG下U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL PEG 濃度分別為32、16、8、0 g·L-1的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個菌餅，每個處理條件同時做10 個重復，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。

1.2.2.3 不同前體物質中U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL 1×10-3mol·L-1L-賴氨酸、1×10-3mol·L-1ɑ-酮戊二酸、1×10-3mol·L-1L-哌可酸的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個菌餅，每個處理條件同時做10 個重復，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。

1.2.2.4 不同濃度L-哌可酸中U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL 1×10-2、1×10-3、1×10-4mol·L-1L-哌可酸的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個菌餅，每個處理條件同時做10個重復，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。

1.2.2.5 不同濃度L-賴氨酸中U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL 1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4mol·L-1L-賴氨酸的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個菌餅，每個處理條件同時做10 個重復，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。1.2.2.6 不同濃度α-酮戊二酸中U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL 1×10-1、1×10-2、1×10-3mol·L-1α-酮戊二酸的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個菌餅，每個處理條件同時做10個重復，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。1.2.3 苦馬豆素的測定

1.2.3.1 菌絲及其發(fā)酵液中SW的提?。赫袷幣囵B(yǎng)結束后，將培養(yǎng)物 5 000 r·min-1離心15 min，使菌絲與發(fā)酵液分離。將菌絲置于烘至恒重的稱量瓶中，60 ℃烘至恒重，稱重。將烘干的菌絲置于研缽中充分研磨成粉末，然后加入10 mL離心管中，加入7 mL 3%乙酸溶液，超聲提取30 min，5 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，重復提取4次，合并提取液于旋轉蒸發(fā)儀上濃縮揮干，殘渣用適量100 mmol·L-1pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾后，用上述緩沖液定容至10 mL，置4 ℃冰箱中保存待檢。將發(fā)酵液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮揮干，殘渣用適量100 mmol·L-1pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾后，用上述緩沖液定容至10 mL，置4 ℃冰箱中保存待檢。

1.2.3.2 α-甘露糖苷酶法測定菌絲及其發(fā)酵液中SW的含量：精密稱量苦馬豆素標準品，將其分別配制成4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 μg·mL-1等9個質量濃度梯度的標準溶液。取40 μL不同質量濃度的苦馬豆素標準品溶液分別加入96孔板的各孔中，每個質量濃度的溶液同時做3個重復，另將60 μL 100 mmol·L-1pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液加入空白孔中作為空白對照，將40 μL 100 mmol·L-1pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液加入到陰性對照孔中作為陰性對照。然后分別在每孔中加入95 μL 1.0 mmol·L-14-Nitrophenyl α-D-mannopyranoside底物溶液，輕微振蕩混勻，置37 ℃孵育1 h；孵育結束后在每孔加入20 μL 0.375 U·mL-1的α-甘露糖苷酶溶液的酶溶液，但空白對照中不加酶溶液，輕微振蕩混勻，置37 ℃再孵育1 h。孵育結束后，每孔加入100 μL的pH 9.8的200 mmol·L-1硼酸鹽緩沖溶液，輕微振蕩混勻，置405 nm波長處測定各孔吸光度值。以SW質量濃度y對ɑ-甘露糖苷酶抑制率x進行回歸分析，繪制標準曲線方程。將1.2.3.1中制備的待檢液適當稀釋后，按照上述方法測定樣品孔的吸光度值，將ɑ-甘露糖苷酶的抑制率代入標準曲線方程計算出樣品溶液中SW的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用SAS8.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，對每個處理組進行統(tǒng)計學分析，并用不同的字母表示不同因素差異顯著(P<0.05)。其中SW產(chǎn)率依據(jù)菌絲和發(fā)酵液中SW的質量之和(mg)與菌絲干重(g)的比值進行統(tǒng)計分析，并結合Excel做t檢驗。

2 結 果

2.1 產(chǎn)SW內(nèi)生真菌的預培養(yǎng)

2.1.1 固體培養(yǎng)基對菌絲生長繁殖的影響 將菌懸液分別接種到PDA固體培養(yǎng)基、馬鈴薯浸粉培養(yǎng)基、蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基上，15 d后，蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基的菌絲生長繁殖的能力最強，鋪滿整個平板，整個平板厚度均一，而其他培養(yǎng)基上的菌絲生長緩慢，其中菌絲在馬鈴薯浸粉培養(yǎng)基上生長最慢。

2.1.2 液體培養(yǎng)基對菌絲生長繁殖的影響 真菌U.oxytropis在ULTO培養(yǎng)基、蛋白胨無機鹽液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，ULTO培養(yǎng)基中菌絲生長較快，培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量的菌絲，而蛋白胨無機鹽液體培養(yǎng)基中菌絲生長較慢。培養(yǎng)一個月后，ULTO培養(yǎng)基中菌絲生長旺盛，棕色，呈絮狀，瓶壁上有大量的菌絲，呈粗條狀，菌絲的平均干重為0.369 g，蛋白胨無機鹽液體培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢，呈白色棒狀菌絲，平均干重為0.158 g。

2.1.3 不同培養(yǎng)方式對菌絲生長繁殖的影響 真菌U.oxytropis在ULTO培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后，靜置培養(yǎng)的菌絲生長緩慢，僅有少量的菌絲，菌絲的平均干重為0.126 g；振蕩培養(yǎng)的菌絲生長迅速，產(chǎn)生大量的菌絲，菌絲的干重明顯增加，平均為0.369 g，是靜置培養(yǎng)真菌菌絲干重的2.9倍。

2.2 α-甘露糖苷酶抑制法標準曲線繪制

以α-甘露糖苷酶抑制率y對SW質量濃度x進行回歸分析，得回歸方程：y=3.177 9x+1.246 6(R2=0.999 2)，表明SW質量濃度在0.013 25～4 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3 不同因素對瘋草內(nèi)生真菌菌絲產(chǎn)量和SW合成的影響

2.3.1 不同pH對真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 隨著培養(yǎng)基pH的不斷增加，內(nèi)生真菌菌絲的平均干重無顯著變化(P>0.05，結果未展示)，SW產(chǎn)率呈增加的趨勢，各組之間差異顯著(P<0.05)，SW的產(chǎn)率分別為0.56、0.74、0.78 mg·g-1。pH 5.5與pH 6.5、pH 4.5與pH 6.5相比，隨著菌絲平均干重的增加，SW的產(chǎn)率呈上升的趨勢；pH 4.5與pH 5.5相比，隨著菌絲平均干重的降低，SW的產(chǎn)率反而增加(圖1)。

2.3.2 不同濃度聚乙二醇(PEG)對真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 隨著PEG質量濃度的增加，U.oxytropis的菌絲產(chǎn)量顯著增加(P<0.01)，而苦馬豆素的產(chǎn)量顯著降低(P<0.01)，產(chǎn)率分別為1.16、0.95、0.77、0.18 mg·g-1。當PEG質量濃度達到32 g·L-1時，菌絲的平均干重為對照組的3倍，而苦馬豆素的產(chǎn)量顯著降低，為0.126 mg(圖

相同字母表示不同pH下，在0.05水平上差異不顯著The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level圖1 不同pH下SW產(chǎn)率Fig 1 The yield of swainsonine under different pH

2)。表明隨著PEG質量濃度的增加，菌絲的生長速度加快，但會抑制SW合成。

2.3.3 不同前體物質對真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 當3種前體物質在培養(yǎng)基中的濃度分別為10-3mol·L-1時，L-賴氨酸、α-酮戊二酸對U.oxytropis的菌絲的產(chǎn)量無顯著影響(P>0.05)，α-酮戊二酸對真菌SW產(chǎn)量沒有顯著影響，但有促進SW合成的趨勢，L-賴氨酸可顯著提高SW的產(chǎn)量，高達0.214 mg，為對照組的3.8倍，SW的產(chǎn)率為0.54 mg·g-1(P<0.05)；L-哌可酸可顯著增加U.oxytropis的菌絲的產(chǎn)量，但SW產(chǎn)量反而顯著降低，其SW產(chǎn)率僅為0.33 mg·g-1(P<0.01)(圖3)。2.3.4 不同濃度L-哌可酸對真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 不同濃度L-哌可酸下，菌絲的平均干重存在明顯的差異(P<0.05)，隨著L-哌可酸濃度的增加，SW的產(chǎn)量反而顯著降低，SW產(chǎn)率分別為0.5、0.34、0.23 mg·g-1(P<0.05)。與對照組相比，當L-哌可酸的濃度為1×10-4mol·L-1時，SW產(chǎn)量顯著增加，為對照組的1.25倍(P<0.01)；當L-哌可酸的濃度為1×10-2、1×10-3mol·L-1時，SW的產(chǎn)量顯著降低，分別為對照組的57.5%、85%。當L-哌可酸的濃度為1×10-2、1×10-3mol·L-1時，隨著菌絲干重的增加，SW產(chǎn)量增加；當L-哌可酸的濃度為1×10-3、1×10-4mol·L-1時，隨著菌絲干重的降低，SW產(chǎn)量反而上升(圖4)。推測L-哌可酸濃度在一定的范圍可促進菌絲的生長，從而加速SW的合成；在某一濃度范圍內(nèi)可抑制菌絲的生長，促進SW的合成速度，總體來說L-哌可酸有促進SW合成的趨勢。

A.菌絲平均干重；B.SW產(chǎn)率。不同字母表示，不同質量濃度PEG下在0.01水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different PEG；B.The yield of swainsonine under different PEG.The different letters show significant difference of lines at 0.01 level圖2 不同質量濃度PEG下菌絲的平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.2 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different PEG

A.菌絲平均干重；B.苦馬豆素產(chǎn)率。相同字母表示，不同前體物質在0.05水平上差異不顯著；不同字母表示，不同前體物質在0.05水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different precursor；B.The yield of swainsonine under different precursor.The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level;The different letters show significant difference of lines at 0.05 level圖3 不同前體物質下，菌絲平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.3 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different precursor

A.菌絲平均干重；B.苦馬豆素產(chǎn)率。相同字母表示，不同濃度L-哌可酸在0.05水平上差異不顯著；不同字母表示，不同濃度L-哌可酸在0.05水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different L-pipecolic acids；B.The yield of swainsonine under different L-pipecolic acids.The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level;The different letters show significant difference of lines at 0.05 level圖4 不同濃度L-哌可酸下菌絲平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.4 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different L-pipecolic acids

2.3.5 不同濃度L-賴氨酸對真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 L-賴氨酸濃度為1×10-1、1×10-2、1×10-3mol·L-1時，菌絲的平均干重無顯著的變化(P>0.05)，僅當L-賴氨酸濃度為1×10-4mol·L-1時，菌絲的平均干重顯著增加(P<0.01)；L-賴氨酸濃度為1×10-1、1×10-2、1×10-4mol·L-1時，SW產(chǎn)量顯著降低，SW產(chǎn)率分別為0.028、0.29、0.18 mg·g-1(P<0.01)；L-賴氨酸濃度為1×10-3mol·L-1時，SW產(chǎn)量顯著增加，SW產(chǎn)率為0.54 mg·g-1(P<0.01)(圖5)。推測L-賴氨酸濃度與產(chǎn)SW內(nèi)生真菌生長及SW合成密切相關，濃度為1×10-1、1×10-2、1×10-4mol·L-1時，L-賴氨酸可抑制菌絲合成SW，L-賴氨酸濃度為1×10-3mol·L-1時，可促進菌絲合成SW。

A.菌絲平均干重；B.苦馬豆素產(chǎn)率。相同字母表示，不同濃度L-賴氨酸在0.05水平上差異不顯著；不同字母表示，不同濃度L-賴氨酸在0.05水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different L-lysine；B.The yield of swainsonine under different L-lysine.The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level；The different letters show significant difference of lines at 0.05 level圖5 不同濃度L-賴氨酸下菌絲平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.5 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different L-lysine

2.3.6 不同濃度ɑ-酮戊二酸對真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 隨著ɑ-酮戊二酸濃度的遞增，SW的產(chǎn)量顯著降低(P<0.05)。當ɑ-酮戊二酸濃度為1×10-1mol·L-1時菌絲的干重顯著降低，而SW產(chǎn)量顯著降低，SW產(chǎn)率為對照組的44%，為0.20 mg·g-1；1×10-2mol·L-1時，菌絲的平均干重無顯著的變化，而SW產(chǎn)量顯著降低，SW產(chǎn)率為對照組的84%，達0.38 mg·g-1(圖6)。推測ɑ-酮戊二酸濃度在1×10-1～1×10-2mol·L-1，可抑制SW的合成，小于1×10-1mol·L-1時，可抑制真菌的生長及SW的合成。

A.菌絲平均干重；B.苦馬豆素產(chǎn)率。相同字母表示，不同濃度ɑ-酮戊二酸下，在0.05水平上差異不顯著；不同字母表示，不同濃度ɑ-酮戊二酸條件下，在0.05水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different ɑ-ketone glutaric acid；B.The yield of swainsonine under different ɑ-ketone glutaric acid.The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level；The different letters show significant difference of lines at 0.05 level圖6 不同濃度ɑ-酮戊二酸下菌絲平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.6 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different ɑ-ketone glutaric acid

3 討 論

目前，國內(nèi)外一致認為U.oxytropis是瘋草中唯一能夠產(chǎn)生SW的內(nèi)生真菌，該類真菌與瘋草的毒性緊密相關。近幾年來，對于該類菌株的研究主要集中在分離與鑒定[11-20]、瘋草毒性與瘋草內(nèi)生真菌的關系[37-39]、傳播機制[40]、環(huán)境因素對SW合成影響[33，37]、瘋草與內(nèi)生真菌的共生關系[41]、基因及蛋白組學[29]上SW合成的機制等方面。

本研究對真菌U.oxytropis的固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式進行篩選，并對不同pH、不同質量濃度PEG、不同濃度L-賴氨酸、L-哌可酸和α-酮戊二酸的培養(yǎng)條件下真菌U.oxytropis的菌絲及其培養(yǎng)液中的SW進行綜合分析，結果顯示蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基及ULTO液體培養(yǎng)基有利于真菌U.oxytropis的生長繁殖。研究表明，碳源、氮源、金屬離子的濃度及無機鹽種類，都會對絲狀真菌生長繁殖產(chǎn)生影響[11,42]，蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基含有真菌U.oxytropis生長所必需的碳源、氮源、金屬離子，促進菌絲生長；微量元素及氨基酸是生命體必需的物質，ULTO培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，含有菌絲生長所需的微量元素及氨基酸，從而促進菌絲的生長；蛋白胨無機鹽液體培養(yǎng)的主要成分為鹽類，與ULTO液體培養(yǎng)基相比，相對缺少促進菌絲生長的維生素和氨基酸，U.oxytropis生長相對緩慢。

靜置培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)相比，振蕩培養(yǎng)更適合菌絲的生長。據(jù)報道，振蕩培養(yǎng)可改善菌絲與培養(yǎng)基成分的接觸和氧的供應[43]，菌絲的生長繁殖比較均一，繁殖能力強，特別是在霉菌的培養(yǎng)中，菌餅不易形成附有菌膜的小球。pH對U.oxytropis的生長無顯著的影響，可能是真菌自身通過某種方式調節(jié)其生長環(huán)境pH，使環(huán)境pH更利于其生長繁殖，這一研究與C.Tamerler等[42]報道一致；隨著pH的遞增，SW的產(chǎn)率逐漸的增加，這與W.E.Oldrup[33]的結果相反。本研究不僅檢測了菌絲提取物中的苦馬豆素，還檢測了發(fā)酵液中的苦馬豆素，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的SW高于菌絲提取物中的SW。在植物研究中，PEG溶液經(jīng)常被用作滲透脅迫劑，研究顯示任何PEG質量濃度對植物種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚根和胚芽長都有極顯著的影響；另一方面PEG具有親水性，可以改變細胞的膜結構，在細胞融合中起決定性的作用；然而高質量濃度、高相對分子質量的PEG會對細胞產(chǎn)生毒性[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)高質量濃度的PEG脅迫下，隨著PEG質量濃度的增高，菌絲的生長能力增強，SW合成受到阻礙，與W.E.Oldrup[33]、M.H.Ralphs等[37]的研究結果不一致，但在W.E.Oldrup的研究中僅對真菌菌絲中的SW做了檢測。另據(jù)K.Braun等[17]報道，真菌在生長的過程中不僅進行SW胞內(nèi)分泌，還可將SW分泌到細胞的外部，并且在菌絲發(fā)酵液中檢測到SW的存在。余永濤[11]在發(fā)酵培養(yǎng)試驗中，檢測到發(fā)酵液中的苦馬豆素產(chǎn)量為2～85 mg·L-1?？赡茉谡婢L的過程中，高質量濃度的PEG會對細胞產(chǎn)生毒性，破壞細胞膜結構的完整性，從而抑制真菌吸收豐富的營養(yǎng)物質，導致SW產(chǎn)量下降；低質量濃度的PEG條件下，細胞的膜結構改變，細胞易于融合，促進真菌吸收豐富的營養(yǎng)物質，菌絲生長加快，促進SW合成。

目前，國內(nèi)外學者推測瘋草中U.oxytropis內(nèi)生真菌合成SW的機制類似于豆類絲核菌及金龜子綠僵菌，并認為賴氨酸、ɑ-酮戊二酸、酵母氨酸、哌可酸、酵母氨酸氧化酶等為U.oxytropis內(nèi)生真菌合成SW關鍵物質[24，29-32]。

本試驗研究了L-賴氨酸、ɑ-酮戊二酸、L-哌可酸三種前體底物及不同濃度前體物質對U.oxytropis真菌生長及SW合成的影響，研究發(fā)現(xiàn)當L-哌可酸濃度為1×10-3mol·L-1時可顯著促進U.oxytropis的生長，但會抑制SW的合成，L-賴氨酸可顯著促進SW的合成，ɑ-酮戊二酸具有促進U.oxytropis的生長及SW合成的趨勢；與楊國棟[32]的試驗結果存在差異，其試驗中添加的化合物按質量計算，而本試驗改進方法，用化合物物質的量濃度來確定添加量，每個化合物相對分子質量存在差異，該法更合理化。此外，在楊國棟[32]的研究中，也未對發(fā)酵液中的SW量進行測定。不同濃度前體物質在一定的范圍可促進U.oxytropis的生長，從而加速SW的合成；在某一濃度范圍內(nèi)可抑制U.oxytropis的生長，從而阻礙SW的合成速度。L-哌可酸、L-賴氨酸、ɑ-酮戊二酸為內(nèi)生真菌U.oxytropis合成SW的前體底物，猜測U.oxytropis的生長與SW合成之間存在復雜的關系，SW合成不僅與真菌U.oxytropis菌絲的干重有關，而且與其自身合成SW的能力相關。

4 結 論

U.oxytropis內(nèi)生真菌與瘋草中SW含量密切關聯(lián)，不同pH、不同PEG質量濃度、不同L-賴氨酸、L-哌可酸和α-酮戊二酸濃度的培養(yǎng)條件下對瘋草內(nèi)生真菌的生長及SW的合成具有一定的影響。U.oxytropis自身具有調節(jié)其生長環(huán)境pH的能力，適應其生長；低pH抑制SW的合成，高pH下促進SW的合成；高質量濃度的PEG可促進真菌U.oxytropis的生長，但抑制U.oxytropis合成SW，L-賴氨酸、L-哌可酸和α-酮戊二酸是真菌U.oxytropis合成SW的前體底物，均對U.oxytropis的苦馬豆素合成產(chǎn)生顯著影響，但對苦馬豆素合成的影響與各物質在培養(yǎng)基中的濃度密切相關。

[1] 史志誠.中國草地重要有毒植物[M].北京 ：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：12-66. SHI Z C.Importent poisonous plants of china grassland[M].Beijing：China Agriculture Press，1997:12-66.(in Chinese)

[2] 趙寶玉，樊月圓，樊澤峰，等.我國西部草原瘋草危害及其動物中毒病的控制[J].草食家畜，2006(1)：12-15. ZHAO B Y，F(xiàn)AN Y Y，F(xiàn)AN Z F，et al.The damage and control of locoweed and locosim in western grassland of China [J].GrassFeedingLivestock，2006(1):12-15.(in Chinese)

[3] MOLYNEUX R J，JAMES L F.Loco intoxication：indolizidine alkaloids of spotted locoweed(Astragaluslentiginosus)[J].Science，1982，216(4542)：190-191.

[4] 王 凱，曹光榮，段得賢，等.黃花棘豆對山羊的毒性研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，1990，21(1) ：80-86. WANG K，CAO G R，DUAN D X，et al.A study on toxicity ofOxytropisochrochphalain goats[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，1990，21(1)：80-86.(in Chinese)

[5] 李建科，楊具田，潘和平，等.家畜黃花棘豆、甘肅棘豆中毒的調查[J].中國獸醫(yī)科技，1987(5)：22-23. LI J K，YANG J T，PAN H P，et al.A investigation on poisoning ofOxytropisochrochphalaandOxytropiskansuensisin livestock [J].VeterinaryScienceinChina，1987(5)：22-23.(in Chinese)

[6] 趙寶玉，曹光榮，段得賢，等.西藏莖直黃芪對山羊的毒性研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，1992，23(3)：276-280. ZHAO B Y，CAO G R，DUAN D X，et al.A study on toxicity ofAstragalusstrictusin goats in Tibet[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，1992，23(3)：276-280.(in Chinese)

[7] 余永濤，耿果霞，劉志濱,等.家畜毛瓣棘豆中毒研究[J].草業(yè)科學，2006，23(5) ：75-77. YU Y T，GENG G X，LIU Z B，et al.Progress in the study of Oxytropisserioopetalapoisoning in domestic animals[J].PrataculturalScience，2006，23(5)：75-77.(in Chinese)

[8] 余永濤.毛瓣棘豆的毒性及其主要化學成分研究[D].楊凌 ：西北農(nóng)林科技大學，2006. YU Y T.Studies on the toxicity and major chemical constitutients ofOxytropisserioopetalaC.R.C.Fisch[D].Yangling：Northwest A&F University,2006.(in Chinese)

[9] 高新磊，韓 冰，趙萌莉，等.瘋草及毒性成分研究進展[J].草業(yè)科學，2011，20(3)：279-286. GAO X L，HAN B，ZHAO M L，et al.Locoweed and advances in research on toxic components[J].PrataculturalScience，2011，20(3)：279-286.(in Chinese)

[10] 曹光榮，李紹君，段得賢,等.黃花棘豆有毒成分的分離與鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)大學學報，1989，17(3)：1-8. CAO G R，LI S J，DUAN D X，et al.The isolation and identification of toxic components fromOxytropisochrochphala[J].JournalofNorthwestA&FUniversity,1989，17(3):1-8.(in Chinese)

[11] 余永濤.產(chǎn)苦馬豆素瘋草內(nèi)生真菌的分離鑒定及其遺傳多態(tài)性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2009. YU Y T.Isolation，identification and genetic polymorphism of swainsonine-producing fungal endophytes from locoweeds in China[D].Yangling：Northwest A&F University,2009.(in Chinese)

[12] 余永濤,王建華,王 妍,等.西藏3種瘋草中合成苦馬豆素內(nèi)生真菌的鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2009，42(10)：3662-3671. YU Y T，WANG J H，WANG Y，et al.Identification of swainsonine-producing fungal endophytes from three species of locoweeds in Tibet[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2009，42(10)：3662-3671.(in Chinese)

[13] 余永濤，王建華，趙清梅，等.甘肅棘豆中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版)，2009，37(2)：40-46，51. YU Y T，WANG J H，ZHAO Q M，et al.Isolation and identification of swainsonine-producing fungal endophyte fromOxytropiskansuensis[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition)，2009，37(2):40-46,51.(in Chinese)

[14] YU Y T，ZHAO Q M，WANG J N，et al.Swainsonine-producing fungal endophytes from major locoweed species in China[J].Toxicon，2010，56(3)：330-338.

[15] BRAUN K，COOK T，LIDDELLC M.Locoism of cattle caused by a species ofAlternaria[J].Phytopathology，1997，87：S11-S12.

[16] BRAUN K.Fungal endophyte infection and swainsonine toxi city in locoweed[D].Las Cruces，N.M ：New Mexico State University，1999.

[17] BRAUN K，ROMERO J，LIDDELL C，et al.Production of swainsonine by fungal endophytes of locoweed[J].MycolRes，2003，107(8)：980-988.

[18] WANG Q，NAGAO H，LI Y，et al.Embellisiaoxytropis，a new species isolated fromOxytropiskansuensis in China[J].Mycotaxon，2006，95：255-260.

[19] 盧 萍.內(nèi)蒙古三種棘豆屬植物中苦馬豆素相關因子的研究[D].呼和浩特 ：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2007. LU P.Factors related to swainsonine in threeOxytropisspecies in Inner Mongolia[D].Huhehaote：Inner Mongolia Agricultural University，2007.(in Chinese)

[20] PRYOR B，CREAMER R，SHOEMAKER R，et al.Undifilum，a new genus for endophyticEmbellisiaoxytropisand parasiticHelminthosporiumbornmuellerion legumes[J].Botany，2009，87(2)：178-194.

[21] OLDRUP E，MCLAINROMERO J，PADILLA A,et al.Localization of endophyticUndifilumfungi in locoweed seed and influence of environmental parameters on a locoweed in vitro culture system[J].Botany，2010，88(5)：512-521.

[22] HARRIS T M，HARRIS C M，HILL J E，et al.(1S,2R,8aS)-1,2-Dihydroxyindolizidine formation byRhizoctonialeguminicola，the fungus that produces slaframine and swainsonine[J].JOrgChem，1987，52(14)：3094-3098.

[23] HARRIS C M，SCHNEIDER M J，UNGERMACH F S，et al.Biosynthesis of the toxic indolizidine alkaloids slaframine and swainsonine inRhizoctonialeguminicola：metabolism of 1-hydroxyindolizidines[J].JAmChemSoc，1988，110(3)：940-949.

[24] HARRIS C，CAMPBELL B，MOLYNEUX R，et al.Biosynthesis of swainsonine in the Diablo locoweed(Astragalusoxyphysus)[J].TetrahedronLett，1988a，29(38)：4815-4818.

[25] WICKWIRE B M，HARRIS C M，HARRIS T M，et al.Pipecolic acid biosynthesis in Rhizoctonia leguminicola.I.The lysine saccharopine，delta 1-piperideine-6-carboxylic acid pathway[J].JBiolChem，1990，265(25):14742-14747.

[26] WICKWIRE B M，WAGNER C，BROQUIST H P.Pipecolic acid biosynthesis inRhizoctonialeguminicola.II.Saccharopine oxidase：a unique flavin enzyme involved in pipecolic acid biosynthesis[J].JBiolChem，1990，265(25):14748-14753.

[27] 路宏朝,楊鳴琦,朱曉飛,等.金龜子綠僵菌發(fā)酵代謝物中苦馬豆素的初步研究[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2006，15(4)：70-72. LU H Z，YANG M Q，ZHU X F，et al.Preliminary study of swainsoine from metabolism products of theMetarhiziumanisopliae[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica，2006，15(4)：70-72.(in Chinese)

[28] SIM K，PERRY D.Analysis of swainsonine and its early metabolic precursors in cultures ofMetarhiziumanisopliae[J].GlycoconjJ，1997，14：661-668.

[29] 李海利.產(chǎn)苦馬豆素瘋草內(nèi)生真菌蛋白質雙向電泳及蛋白質組學研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2012. LI H L.Studies on the two-dimensional gel electrophoresis and proteomic of locoweed endophytic fungi synthesizing swainsonine[D].Yangling：Northwest A&F University,2012.(in Chinese)

[30] MUKHERJEE S，DAWE A L，CREAMER R.Potential role for saccharopine reductase in swainsonine metabolism in endophytic fungus，Undifilumoxytropis[J].FungalBiol，2012，116(8)：902-909.

[31] MUKHERJEE S，DAWE A L，CREAMER R.Development of a transformation system in the swainsonine producing，slow growing endophytic fungus，Undifilumoxytropis[J].JMicrobiolMeth，2010，81(2)：160-165.

[32] 楊國棟.瘋草內(nèi)生真菌合成苦馬豆素的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2012. YANG G D.Study on biosynthesis of swainsonine by the locoweed’s endophytic fungi[D].Yangling：Northwest A&F University,2012.(in Chinese)

[33] OLDRUP W E.Determining the influence of environmental parameters on swainsonine production inOxytropissericeaand its fungal endophyte[D].Las Cruces：New Mexico State University，2005.

[34] 張蕾蕾，何生虎，余永濤，等.寧夏黃花棘豆中產(chǎn)苦馬豆素內(nèi)生真菌的分離及鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(12)：77-84. ZHANG L L，HE S H，YU Y T，et al.Isolation and identification of swainsonine-producing fungal endophyte from Oxytropis ochrocephala Bunge in Ningxia[J].ChinaAmimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2013，40(12):77-84.(in Chinese)

[35] 張 靜，崔 穎，孫 堯，等.不同程度干旱脅迫對油菜種子萌發(fā)及幼苗生長特性的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2011，29(2)：164-167. ZHANG J，CUI Y，SUN X，et al.Effect of different degree of drought stress on germination and seedling growth of rapeseed (BrassicanapusL.)[J].AgriculturalResearchintheAridAreas，2011，29(2)：164-167.(in Chinese)

[36] 丁 振，賈士儒，王文哲，等.聚乙二醇(PEG) 模擬干旱脅迫對液體懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藍細菌生長及生理生化的影響[J].中國釀造，2012，31(8)：82-84. DING Z，JIA S R，WANG W Z，et al.Response ofNostocflagelliformein liquid suspension culture to polyethylene glycol (PEG) simulated drought stress[J].ChinaBrewing，2012，31(8):82-84.(in Chinese)

[37] RALPHS M H，CREAMER R，BAUCOM D，et al.Relationship between the endophyteEmbellisiaspp.and the toxic alkaloid swainsonine in major locoweed species(AstragalusandOxytropis)[J].JChemEcol，2008，34(1)：32-38.

[38] COOK D，GARDNER D R，RALPHS M H，et al.Swainsonine concentrations and endophyte amounts ofUndifilumoxytropisin different plant parts ofOxytropissericea[J].JChemEcol，2009，35(10)：1272-1278.

[39] COOK D，GARDNER D R，GRUM D，et al.Swainsonine and endophyte relationships inAstragalusmollissimusandAstragaluslentiginosus[J].JAgricFoodChem，2011，59(4)：1281-1287.

[40] RALPHS M H，COOK D，GARDNER D R，et al.Transmission of the locoweed endophyte to the next generation of plants[J].FungalEcol，2011，4(4)：251-255.

[41] 袁志林，章初龍，林福呈.植物與內(nèi)生真菌互作的生理與分子機制研究進展[J].生態(tài)學報，2008，28(9)：4431-4438. YUAN Z L，ZHANG C L，LIN F C.Recent advances on physiological and molecular basis of fungal endophyte-plant interactions [J].ActaEcologicaSinica，2008,28(9)：4431-4438.(in Chinese)

[42] TAMERLER C，ULLAH M，ADLARD M W，et al.Effect of pH on physiology ofMetarhiziumanisopliaefor production of swaisonine[J].FEMSMicrobiolLett，1998，168(1)：17-23.

[43] 熊 強，徐 晴，顧 帥，等.絲狀真菌形態(tài)控制及其在發(fā)酵過程優(yōu)化中的應用[J].生物工程學報，2012，28(2)：178-190. XIONG Q，XU J，GU S，et al.Controlling the morphology of filamentous fungi for optimization of fermentation process [J].ChineseJournalofBiotechnology，2012，28(2):178-190.(in Chinese)

(編輯 白永平)

Influence of Different Factors on Swainsonine Production in Fungal Endophyte from Locoweed

ZHANG Lei-lei1，YU Yong-tao1*，HE Sheng-hu1，ZHAO Qing-mei2,3，GE Song1

(1.CollegeofAgronomyNingxiaUniversity，Yinchuan750021，China； 2.CollegeofBiologicalScienceandEngineering，BeifangUniversityofNationalities，Yinchuan750021，China； 3.KeyLaboratoryofFermentationBrewingEngineeringandBiotechnologyofStateNationalitiesAffairsCommission，Yinchuan750021，China)

The research was conducted to screen the influence factors on swainsonine production in fungal endophyte，Undifilumoxytropis，from locoweed.U.oxytropiswere inoculated in liquid medium of different pH or containing different concentration of PEG，L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric acid，respectively.To estimate the influence of different factors on swainsonine production inU.oxytropis，the swainsonine of cultured fungal mycelia and zymotic fluid were extracted and detected after shaking culture.The results showed that low pH (pH4.5) inhibit significantly (P<0.05) the synthesis of swainsonine in fungi.With the increase of PEG in culture medium，the production of swainsonine in fungi was also inhibited significantly (P<0.01).When the fungi were inoculated respectively in liquid medium that contained equivalent concentration (10-3mol·L-1) of L-pipecolic acid，L-lysine or ɑ-ketoglutaric acid，the production of swainsonine was inhibited significantly (P<0.05) in the group added L-pipecolic acid.However，the yield of swainsonine were increased significantly(P<0.05) in the group added L-lysine.When the initial concentration of L-pipecolic acid was 10-3and 10-2mol·L-1，the production of swainsonine inU.oxytropiswas inhibited significantly (P<0.05).However，when the initial concentration of L-pipecolic acid was 10-4mol·L-1，the yield of swainsonine inU.oxytropiswas increased significantly (P<0.01).When the initial concentration of L-lysine was 10-1，10-2and 10-4mol·L-1，the production of swainsonine inU.oxytropiswas inhibited significantly (P<0.05).When the initial concentration of ɑ-ketoglutaric acid was 10-1，10-2and 10-3mol·L-1，the production of swainsonine inU.oxytropiswas inhibited significantly(P<0.05).Low pH or PEG added to medium could significantly inhibit the production of swainsonine inU.oxytropis.It was significant that the influence of L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric acid on the swainsonine producing of fungal endophyte.However，the extent of influence on fungal swainsonine producing was highly correlated with the concentration of L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric in liquid media.

locoweed；fungal endophyte；Undifilumoxytropis；swainsonine；biosynthesis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.021

2014-05-05

國家自然科學基金(31201962)；寧夏自然科學基金(NZ1118)

張蕾蕾(1989- )，女，陜西渭南人，碩士生，主要從事獸醫(yī)臨床診斷技術研究，E-mail：andybeilei@163.com

*通信作者：余永濤(1980- )，男，寧夏平羅人，副教授，博士，碩導，主要從事動物中毒病與營養(yǎng)代謝病研究，E-mail：yyt1211@163.com

S852.66

A

0366-6964(2015)01-0163-11