內(nèi)皮素3在不同毛色綿羊皮膚的表達與定位

李亞楠，趙兵令，馬淑慧，赫曉燕，范瑞文，王海東，耿建軍，董常生*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

內(nèi)皮素3在不同毛色綿羊皮膚的表達與定位

李亞楠1，趙兵令1，馬淑慧2，赫曉燕1，范瑞文1，王海東1，耿建軍1，董常生1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

旨在探索內(nèi)皮素3(Endothelin 3，EDN3)在不同毛色綿羊皮膚的表達差異以及對毛色的影響。以不同毛色綿羊為研究對象，通過熒光定量PCR技術分析EDN3基因在不同毛色綿羊皮膚的表達量，通過免疫組織化學和ELISA方法對EDN3蛋白在不同毛色綿羊皮膚中的定位和表達進行研究。1)qRT-PCR結果顯示，EDN3 在白色綿羊皮膚的相對表達量為5.540 6±0.030 7，在黑色綿羊皮膚的相對表達量為1.005 8±0.062 0。黑白花色綿羊的白色區(qū)和黑色區(qū)的相對表達量分別為4.341 9±0.087 7和1.150 1±0.005 3。2)ELISA結果顯示，EDN3在白色綿羊皮膚中的表達量為128.424 7±2.223 4，在黑色綿羊皮膚的相對表達量為25.114 4±3.248 3。在黑白花色綿羊白色皮膚中的表達量為93.945 3±7.562 2，黑色皮膚的表達量為28.606 0±9.295 9。3)免疫組織化學顯示，EDN3在綿羊皮膚毛囊的毛基質(zhì)、內(nèi)外毛根鞘、毛乳頭等區(qū)域均有表達。綜上表明，EDN3在不同毛色綿羊皮膚中均可正常表達，且表達量存在顯著差異。EDN3是維持黑色素細胞存在不可缺少的基因，但不影響綿羊黑白花的形成。

內(nèi)皮素3；綿羊；免疫組織化學

哺乳動物被毛的生長是極其復雜的生理過程，其中毛色的形成更是受到遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)和代謝水平等多種因素的影響[1]，且遺傳基因的調(diào)控是其決定性的因素。在動物毛色形成過程中所涉及的調(diào)控基因多達上百個[2]，例如MC1R、MITF、TRP1、TRP2、EDN3等。內(nèi)皮素(Endothelin，EDN)由內(nèi)皮細胞合成，有3種形態(tài)的異構體(EDN1，EDN2，EDN3)，均由21個氨基酸組成[3]，是一類具有強大的促分化和促有絲分裂的生長因子，廣泛作用于包括皮膚在內(nèi)的大部分組織。目前已知的內(nèi)皮素受體有A和B兩種亞型，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。兩種受體分布的位置不盡相同，對內(nèi)皮素的親和力也存在差異，EDN3是近來研究較多的一種活性肽，對黑色素細胞的生存、發(fā)育以及色素的沉積有著不可或缺的作用。EDN3主要是通過與內(nèi)皮縮血管肽B型受體(EDNRB)結合，對于由神經(jīng)嵴細胞發(fā)育而來的黑色素細胞的成熟及分化發(fā)揮至關重要的作用[4]，是其有效的促進因子。已有研究表明，EDN3對小鼠的黑色素細胞色素沉積有明顯作用，因而進一步明確EDN3對不同毛色皮膚的黑色素沉積的影響作用可以對毛色的相關研究提供新的研究依據(jù)。目前有研究表明，內(nèi)源性的EDN3在胚胎形成的早期誘導神經(jīng)嵴細胞的正常遷移和分化[5-7]，隨著胚胎的發(fā)育，EDN3對真皮黑色素細胞的正常維持也是必不可少的[8]；同時還可在后期的發(fā)育中代償性的補充Kit的作用[9]，對早期色素的形成有至關重要的作用。而外源性的EDN3不僅對黑色素細胞前體的分化有明顯的促進作用，還能影響已分化的黑色素細胞的分裂增殖，最終可產(chǎn)生一種類似于人類黑色素細胞增多癥的表型。在以角化驅(qū)動的小鼠為模型的研究中，EDN3可誘導成年小鼠皮膚真皮層出現(xiàn)色素沉著[8]。前期的試驗大多以黑色素細胞為主要研究對象闡述EDN3對其產(chǎn)生的影響，對于EDN3與色素形成的關系研究較少，且對于EDN3是否會影響綿羊黑白花的形成少有提及，其與純色綿羊是否存在差異？本研究主要通過對不同毛色的綿羊皮膚中的EDN3進行檢測，以探究EDN3對綿羊毛色的影響及其與綿羊黑白花形成的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑

RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒( TaKaRa 公司)，QuantiFast SYBR Green PCR Kit( QIAGEN 公司)，綿羊內(nèi)皮素3 ELISA 試劑盒(上海西塘生物科技公司進口)，DAB顯色試劑盒(康為世紀公司)，EDN3抗體(博奧森公司)，Streptavidin-HRP試劑盒(康為世紀公司)。

1.2 材料

隨機挑取1歲左右小尾寒羊全白、全黑、花黑綿羊各3只(由渾源羊場提供)，背部皮膚凈毛后，用取皮器取約1 cm的皮膚組織3塊，其中2塊快速置于液氮保存，用于提取總RNA及總蛋白，1塊置于Bouin’s液中固定，制作石蠟切片，用于免疫組化染色。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取和cDNA合成 從液氮中取出皮膚于液氮中研磨成粉末，Trizol 法提取綿羊皮膚總 RNA，并電泳檢測其完整性。按照 TaKaRa公司反轉錄試劑盒進行 cDNA 合成。反轉錄體系：oligdT Primer 1 μL，dNTP Mix 1 μL，總 RNA 濃度<5 μg，加水至 10 μL。體系混勻后置于 PCR 儀中，按條件65 ℃ 5 min，冰上2 min進行反應；取上述產(chǎn)物10 μL，5×Primer script buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Primer script II RTase 1 μL，加水至20 μL。混勻后，置于 PCR 儀中按 45 ℃ 40 min，70 ℃ 15 min進行反應，-20 ℃保存 cDNA備用。

1.3.2 引物設計及PCR反應 根據(jù)GenBank 上綿羊的EDN3 序列并利用 Premier5.0 引物設計熒光定量 PCR 擴增引物，并通過 NCBI 初步檢測引物的特異性，引物由北京華大基因公司合成。引物序列見表1。

PCR反應體系(25 μL)：2×Taq Master Mix 12.5 μL，特異性上下游引物各1 μL，cDNA≤1 μg，加無菌水補足25 μL。反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min.，利用未加模板(以滅菌蒸餾水代替)的反應液作為陰性對照，以檢查是否存在污染。用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物，200 V 電泳15 min 后使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。PCR產(chǎn)物純化后送北京華大基因生物公司雙向測序。

表1 目的基因引物序列及PCR產(chǎn)物

Table 1 Sequence of primer and condition of PCR amplification

基因Gene引物序列(5′→3′)PrimersequencePCR產(chǎn)物/bpProductsizeEDN3F：GAGCAGGGACCAAGTCAGTT，R：ATAGGGCACAGTCCGTTCAG16218SF：GAAGGGCACCACCAGGAGT，R：CAGACAAATCACTCCACCAA158

1.3.3 qRT-PCR 擴增 熒光定量 PCR 根據(jù) QIAGEN 試劑盒進行，反應體系(10 μL)：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，模版≤100 ng，加水至10 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40～45個循環(huán)。反應結束通過2-△△CT法計算EDN3在不同毛色綿羊皮膚中的相對表達水平?！鰿T目的基因=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，△△CT = △CT白色綿羊組-△CT黑色綿羊組，EDN3 mRNA表達差別倍數(shù)以2-△△CT表示。

1.3.4 ELISA 蛋白含量測定 取液氮凍存的綿羊皮膚組織，用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白。根據(jù)ELISA試劑盒對皮膚組織中EDN3的濃度進行測定。將蛋白樣品加入包被過綿羊EDN3單抗的酶標板上，并于37 ℃孵育40 min，反應完成后，甩去多余的液體，并用洗滌液充分清洗30 s×5次；每孔加入蒸餾水和一抗工作液各50 μL(空白除外)，混勻，37 ℃放置20 min；反應完成后甩去多余的液體并用洗滌液充分清洗30 s×5次；每孔加入酶標抗體工作液100 μL，混勻放置37 ℃ 10 min；反應完成后，甩去多余的液體，并用洗滌液充分清洗30 s×5次；每孔加入底物工作液100 μL，置于37 ℃暗處反應15 min；每孔加入終止液100 μL混勻，用酶標儀在450 nm處測吸光值。

1.3.5 免疫組織化學 石蠟切片脫蠟，滴加內(nèi)源性過氧化物酶封閉液；置37 ℃烘箱10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 緩沖液搖洗切片5 min×3 次；滴加適量正常羊血清封閉，37 ℃溫箱孵育10 min，甩去多余液體，并滴加 1∶100 兔抗EDN3多克隆抗體，陰性對照滴加PBS緩沖液代替；4 ℃過夜；次日室溫放置30 min，PBS緩沖液沖洗5 min×3 次；滴加生物素標記羊抗兔二抗工作液，放入37 ℃溫箱反應10 min，用 PBS緩沖液沖洗5 min×3次；滴加HRP標記的鏈霉親和素，放入37 ℃溫箱反應10 min，用PBS 緩沖液沖洗5 min×3次；滴加DAB顯色10 min，PBS 緩沖液沖洗3 min×3次，蘇木素輕度復染、脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.6 免疫組織化學圖像數(shù)據(jù)分析 用DP軟件在每張毛囊組織切片上，采集5～8個視野，應用Image-pro plus 6.0軟件(美國MediaCybernetics公司) 對不同毛色綿羊皮膚EDN3免疫組織化學結果進行分析，測得陽性細胞的IOD(Integral optical density)值，單因素方差分析，結果用“平均值±標準誤(Mean±SE)”表示。

2 結 果

2.1 PCR擴增電泳檢測

1%凝膠電泳結果顯示，EDN3條帶清晰，無非特異性條帶。條帶大小為162 bp左右(圖1)。切膠后送華大基因測序，結果比對后正確，說明EDN3可在綿羊體內(nèi)正常表達。

M.DL2000 DNA marker;1.全黑綿羊皮膚EDN3 PCR產(chǎn)物;2.花黑綿羊皮膚EDN3 PCR產(chǎn)物;3.全白綿羊皮膚EDN3 PCR產(chǎn)物;4.花白綿羊皮膚EDN3 PCR產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker;1.EDN3 PCR product of black sheep skin；2.EDN3 PCR product of flower black sheep skin；3.EDN3 PCR product of white sheep skin；4.EDN3 PCR product of flower white sheep skin圖1 EDN3 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of EDN3 PCR product

2.2 qRT-PCR的擴增

qRT-PCR結果顯示，目的基因與內(nèi)參基因的熔解曲線僅有一個明顯的峰，擴增產(chǎn)物的Tm值均一，目的基因及內(nèi)參基因沒有產(chǎn)生非特異性擴增及引物二聚體(圖2A、B)；且EDN3熒光定量的擴增動力學曲線為“S”型，曲線平行性良好，無明顯偏差，起峰點清晰，符合標準曲線要求(圖2C)。qRT-PCR 結果顯示，EDN3 在全白色綿羊皮膚中 mRNA 的相對表達量為5.540 6±0.030 7；而在黑白花綿羊的白色皮膚中EDN3 的 mRNA 相對表達量為4.341 9±0.087 7，黑白花綿羊的黑色皮膚中mRNA的相對表達量為1.150 1±0.005 3；在全黑色綿羊皮膚的相對表達量為1.005 8±0.062 0。全白綿羊皮膚中EDN3的表達量是黑白花綿羊黑色皮膚的4.8倍，是全黑綿羊皮膚表達量的5.5倍；黑白花綿羊白色皮膚EDN3的表達量是黑白花綿羊黑色皮膚的3.8倍，是全黑綿羊皮膚的4.3倍。白色綿羊皮膚與黑色綿羊皮膚的EDN3 mRNA水平的表達差異極顯著(P<0.01)(圖2D)。

**.P<0.01。下同。A.EDN3的熔解曲線；B.18S的熔解曲線；C.EDN3和18S的擴增曲線；D.不同綿羊皮膚EDN3的qRT-PCR分析結果**.P<0.01.The same as below.A.qRT-PCR melt curve for EDN3；B.qRT-PCR melt curve for 18S；C.qRT-PCR amplification plots for EDN3 and 18S；D.qRT-PCR analysis of EDN3 in different colors of sheep skin圖2 EDN3 mRNA表達的qRT-PCR分析Fig.2 qRT-PCR analysis of the expression of EDN3 mRNA

2.3 ELISA試驗

經(jīng)酶標儀在450 nm處測得OD值，使用CurveExpert 1.4軟件分析制作標準曲線(圖3)，獲得樣品中EDN3蛋白的相對表達量。EDN3在全白色綿羊皮膚中蛋白的相對表達量為128.424 7±2.223 4；而在黑白花綿羊的白色皮膚中EDN3蛋白相對表達量為93.945 3±7.562 2，黑白花綿羊的黑色皮膚中蛋白的相對表達量為28.606 0±9.295 9；在全黑色綿羊皮膚的相對表達量為25.114 4±3.248 3。全白綿羊皮膚中EDN3蛋白表達量是黑白花綿羊黑色皮膚的4.5倍，是全黑綿羊皮膚表達量的5.1倍；黑白花綿羊白色皮膚EDN3蛋白表達量是黑色皮膚的3.3倍，是全黑綿羊皮膚的3.7倍。白色綿羊皮膚與黑色綿羊皮膚EDN3蛋白水平表達差異極顯著(P<0.01)。

2.4 免疫組織化學分析

免疫組織化學結果顯示(圖4)，綿羊黑色皮膚和白色皮膚中均有EDN3棕黃色的陽性表達，且其主要表達部位為毛基質(zhì)、內(nèi)外毛根鞘等處，著色深淺不一。另黑色綿羊毛囊的毛乳頭區(qū)有少量表達，白色皮膚則比黑色的表達更少，幾乎不可見。通過光密度分析比較EDN3在不同毛色綿羊皮膚的表達水平，陽性試驗組結果表明(圖5)，白色皮膚EDN3的表達量高于黑色皮膚且差異極顯著(P<0.01)，花黑EDN3表達量高于全黑，差異顯著(P<0.05)，該結果與ELISA試驗結果相一致。

A.EDN3的標準曲線；B.EDN3蛋白表達量的ELISA分析A.The standard curve of EDN3；B.ELISA analysis of EDN3 in different colors of sheep skin圖3 不同毛色綿羊皮膚中EDN3蛋白的相對表達量Fig.3 Relative expression of EDN3 in different hair color sheep skin

A.白色綿羊皮膚EDN3陽性組；a.白色綿羊皮膚EDN3陰性對照組；B.花白綿羊皮膚EDN3陽性組；b.花白綿羊皮膚EDN3陰性對照組；C.花黑綿羊皮膚EDN3陽性組；c.花黑綿羊皮膚EDN3陰性對照組；D.黑色綿羊皮膚EDN3陽性組；d.黑色綿羊皮膚EDN3陰性對照組。1.毛基質(zhì)；2.內(nèi)毛根鞘；3.外毛根鞘；4.毛乳頭A.White sheep skin EDN3 positive group；a.White sheep skin EDN3 negative control group;B.Flower white sheep skin EDN3 positive group；b.Flower white sheep skin EDN3 negative control group;C.Flower black sheep skin EDN3 positive group；c.Flower black sheep skin EDN3 negative control group；D.Black sheep skin EDN3 positive group；d.Black sheep skin EDN3 negative control group.1.Hair follicle matrix；2.Inside root sheath；3.Outside root sheath；4.Dermal papilla圖4 EDN3在不同毛色綿羊毛囊的免疫定位200×Fig.4 Immunohistochemistry results of EDN3 in different hair color sheep skin 200×

3 討 論

*.P<0.05圖5 EDN3在不同毛色綿羊皮膚組織中的平均光密度分析Fig.5 Average optical density analysis of EDN3 in different hair color sheep skin

哺乳動物毛色的形成取決于成熟黑素細胞的相對數(shù)量、分布部位以及其合成的黑色素的含量、種類、分布和運輸途徑等因素。黑色素細胞來源于神經(jīng)嵴細胞[10]，在黑色素小體中合成黑色素，并由其決定哺乳動物皮膚、毛發(fā)及眼睛的最終表型[11]。內(nèi)皮素(Endothelin，EDN)由內(nèi)皮細胞合成，有3種形態(tài)的異構體(EDN1，EDN2，EDN3)。EDN通過與G蛋白偶聯(lián)受體結合激活磷脂酶C(PLC)，誘發(fā)細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加進而參與各種生理過程[12]，主要包括血管收縮和細胞增殖[13]。已有研究表明，EDN3在鳥類神經(jīng)嵴細胞的培養(yǎng)中可以通過與EDNRB結合促進神經(jīng)嵴細胞的增殖和黑色素細胞的分化[14]。在黑色素通路中，EDN3與KIT共同參與黑色細胞的存活、增殖和分化等，而同時阻斷EDNRB和KIT信號則會導致黑色素前體細胞完全消失，任一通路的存在均可維持黑色素前體細胞的存在[9]。A.G.Baynash等[15]通過細胞試驗發(fā)現(xiàn)EDN3及其受體在神經(jīng)嵴細胞和黑色素細胞的增殖和分化中起重要的作用，并推測人類EDN3缺失可能會導致神經(jīng)性巨結腸病癥。另有報道稱KIT受體酪氨酸激酶W位點的突變不影響黑色素細胞的遷移和分化，但是嚴重影響黑色素細胞的存在[16]。體外研究表明，黑色素前體細胞的增殖和分化對EDN3活性肽存在一定的劑量依賴[17-19]。本試驗蛋白定位和定量結果顯示，EDN3在不同毛色皮膚毛囊內(nèi)均有表達，但是白色皮膚表達量明顯多于黑色。不同毛色皮膚定位圖所顯示的陽性反應區(qū)也存在一些差異，白色與花白色皮膚定位顯示陽性反應的區(qū)域均勻分布于內(nèi)外毛根鞘和毛基質(zhì)等處，而在毛乳頭區(qū)僅有少量存在。黑色與花黑色皮膚則顯示EDN3陽性反應在毛基質(zhì)等黑色素細胞活躍的區(qū)域大量存在，毛乳頭區(qū)的陽性反應也有明顯的增多。試驗結果提示，EDN3對黑色與花黑色綿羊皮膚內(nèi)的黑色素細胞有一定的促進作用，活化細胞增加色素的合成。EDN3對白色及花白色綿羊皮膚毛囊內(nèi)的黑色素細胞有維持作用，即EDN3對黑色素細胞的生存是必不可少的，白色綿羊皮膚需要EDN3較高的表達量以維持色素細胞的存在。楊姍姍等[20]認為EDN3可能與綿羊毛色形成具有相關性，但從本試驗結果推測EDN3可能與維持黑色素細胞活性及其發(fā)育有較大關系，在色素顆粒形成上具有協(xié)調(diào)作用。同時由于存在樣品采集時對綿羊品種和年齡等選擇上的不一致，均可能導致結果存在差異。

EDN3與EDNRB任一位點的隱形突變會產(chǎn)生相似的表型，包括不同程度的色素減退和無神經(jīng)節(jié)的巨結腸疾病，其中色素減退的表型是胚胎期黑色素細胞的減少和隨后黑色素細胞的異常遷移所造成。R.J.Garcia等[8]成功得到內(nèi)皮素3過表達轉基因小鼠模型，結果顯示轉基因小鼠胚胎早期EDN3的表達對表型的形成非常重要，黑色素前體細胞的數(shù)量顯著增多，成年轉基因鼠的真皮層已分化的黑色素細胞數(shù)量增多，且成年鼠皮膚色素沉著的表型需要內(nèi)皮素3的持續(xù)表達來維持。該轉基因鼠與Agouti、KIT等基因的突變體小鼠雜交可改變其原有表型。有研究顯示，EDN3和EDNRB途徑對黑色素前體細胞和已分化成熟的黑色素細胞都有促進作用。但是也有研究表明，毛發(fā)與皮膚中的黑色素細胞即使在分享或共用同一信號通路時，表型顏色的形成也是相互獨立的[21]。EDN3在成年綿羊皮膚中存在差異，且在白色綿羊皮膚內(nèi)表達量較高，說明在成年綿羊中EDN3并未直接作用于色素的生成，后期毛發(fā)顏色形成時受到其他路徑的調(diào)控，影響表型的形成。C.B.Kaelin等[22]對貓科動物花紋表型的形成做了相關研究，發(fā)現(xiàn)EDN3在花紋間的表達存在差異，并進一步證實EDN3對早期花紋的形成有一定的影響，且作為第二信使誘導胚胎時期黑色素細胞增多，對后期花紋的形成有明顯的異化作用。同時他們還證實EDN3在相鄰花紋區(qū)域維持高低不同的表達進而維持毛發(fā)空間的差異，這一差異始終貫穿于毛囊的發(fā)育周期。而表型的變化則歸因于EDN3引起的色素顆粒類型的變化，即真黑素向褐黑素的轉變。該研究說明EDN3對褐黑素的生成和顆粒的沉積有一定的影響并對花紋的形成有促進作用，但是本試驗結果卻顯示白色與花白色綿羊皮膚內(nèi)EDN3的表達量均顯著高于花黑色綿羊皮膚的表達量，與其研究結果不符，表明EDN3不是影響綿羊皮膚黑白花形成的主要基因，影響綿羊皮膚黑白花形成的因素還有待進一步研究。試驗結果顯示真黑素大量聚集的黑色綿羊皮膚內(nèi)，EDN3的存在較少，表明EDN3與真黑素及褐黑素之間存在一定的協(xié)調(diào)相關性。

4 結 論

本研究結果表明，EDN3在不同毛色綿羊皮膚中均可正常表達，且存在顯著差異。EDN3是維持黑色素細胞存在不可缺少的基因，但不影響綿羊黑白花的形成。

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(編輯 程金華)

EDN3 Expression and Localization in Sheep Skin with Different Coat Color

LI Ya-nan1，ZHAO Bing-ling1，MA Shu-hui2，HE Xiao-yan1，F(xiàn)AN Rui-wen1WANG Hai-dong1，GENG Jian-jun1，DONG Chang-sheng1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China;2.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

To explore the expression of endothelin 3 in different coat color of sheep skin and the effect ofEDN3 on the sheep coat color，the experiment analyzed the mRNA and protein expression level ofEDN3 in sheep skin of different coat colors in different coat color ship by real-time quantitative PCR，ELISA and immunohistochemistry.1)qRT-PCR showed that the relative expressive ofEDN3 mRNA in white sheep skin was 5.540 6±0.030 7，while in black was 1.005 8±0.062 0.The gene expression quantity ofEDN3 in white and black skin tissue of the same individuality was 4.341 9±0.087 7 and 1.150 1±0.005 3.2)ELISA results showed that the expression ofEDN3 protein in white and black were 128.424 7±2.223 4 and 25.114 4±3.248 3.The protein expression ofEDN3 in white and black skin of the same individuality were 93.945 3±7.562 2 and 28.606 0±9.295 9.3)TheEDN3 was located in the matrix，outer root sheath and dermal papilla of hair follicular by immunohischemistry.Experiments showed that theEDN3 expressed normally in black and white sheep skin，and the expression quantity had significant differences.The research indicated thatEDN3 was indispensable to maintain the presence of the melanocyte，and didn’t affect the formation of friesian sheep.

endothelin-3；sheep；immunohistochemistry

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.026

2014-03-12

國家“863”計劃(2013AA102506);國家自然科學基金項目(31302049;31172283);山西省自然科學基金項目(2012011046-6);高校博士點基金(20131403120002)

李亞楠(1989-)，女，河南扶溝人，碩士生，主要從事毛色相關研究，E-mail：18404966095@163.com

*通信作者：董常生，教授，E-mail：csdong18@163.com

S826.2

A

0366-6964(2015)12-2322-07