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    丹翹液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的抑制效應(yīng)分析

    2015-03-22 12:45:03魏立琴王東升董書(shū)偉鄺曉嬌張世棟嚴(yán)作廷
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2015年12期
    關(guān)鍵詞:抗炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)

    魏立琴,王東升,董書(shū)偉,鄺曉嬌,張世棟*,嚴(yán)作廷*

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心,蘭州 730050;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070)

    丹翹液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的抑制效應(yīng)分析

    魏立琴1,2,王東升1,董書(shū)偉1,鄺曉嬌1,張世棟1*,嚴(yán)作廷1*

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心,蘭州 730050;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070)

    為研究丹翹液的體外抗炎作用及其抗炎機(jī)制,利用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞建立炎癥模型,MTT法檢測(cè)不同濃度丹翹液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力影響;NO測(cè)試盒檢測(cè)丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO釋放量的影響;ELISA方法檢測(cè)丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和PGE2分泌的影響;RT-PCR方法檢測(cè)丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因轉(zhuǎn)錄的影響;Western blot檢測(cè)對(duì)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示丹翹液小于700 μg·mL-1對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用;丹翹液各劑量組(100、300、600 μg·mL-1)能不同程度地抑制LPS誘導(dǎo)的NO、PGE2、TNF-α和IL-6的分泌;能顯著抑制iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞核內(nèi) NF-κB p65蛋白表達(dá)。丹翹液的抗炎作用機(jī)制可能與抑制NF-κB 通路激活,進(jìn)而抑制炎癥介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有關(guān)。

    丹翹液;抗炎機(jī)制; RAW264.7;LPS;炎癥模型

    炎癥是機(jī)體對(duì)各種致炎因素及損傷所產(chǎn)生的具有防御意義的應(yīng)答性反應(yīng),其在一定時(shí)期內(nèi)對(duì)機(jī)體是有利的,可以提高機(jī)體抵抗力,但劇烈或持久的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體造成損失,影響動(dòng)物機(jī)體的健康,炎癥反應(yīng)是一些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)[1-2]。近年來(lái),中藥制劑對(duì)炎癥有較好的抑制效果,由于其毒副作用小,對(duì)機(jī)體不良反應(yīng)較少,其影響炎癥免疫反應(yīng)作用的機(jī)制受到了廣泛的關(guān)注[3-4]。中藥影響炎癥免疫反應(yīng)的機(jī)制包括影響炎性介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子的作用、核因子的功能、活性氧的生成、神經(jīng)內(nèi)分泌激素的生成等[4-6]。

    丹翹液是以丹參和連翹等中草藥為主要成分,依據(jù)活血化瘀、縮宮排膿的治療原則研制而成的中藥子宮灌注劑,臨床上主要用于防治奶牛子宮內(nèi)膜炎[7-8]。動(dòng)物藥理學(xué)研究顯示,丹翹液具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛的藥理效應(yīng)[9],但是丹翹液的抗炎作用機(jī)制尚不清楚。因此,本試驗(yàn)利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7,建立炎癥模型,并研究了丹翹液對(duì)炎癥細(xì)胞模型的影響,旨在探討丹翹液的體外抗炎作用及其抗炎機(jī)制,為該新藥的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞株 小鼠單核/巨噬細(xì)胞株 RAW264.7(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)添加含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

    1.1.2 試劑和儀器 脂多糖(E.coli0111:B4)、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma 上海公司;胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) GIBCO 公司;小鼠 TNF-α、IL-6、PGE2的 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;NO試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TRIzol購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司;RT-PCR 試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;引物由北京六合華大基因合成;HRP羊抗兔IgG購(gòu)自西安壯志;兔多克隆抗體NF-κB p65購(gòu)自Abcam; DMI6000B倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司);SpectraMaxM2/M2e 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司);CFX96 型定量 PCR 儀(美國(guó)Bio Rad公司); HeaL Force HF90型CO2培養(yǎng)箱(中國(guó)上海力康有限公司)。

    1.1.3 中藥丹翹液的制備 稱(chēng)取丹參1 200 g、連翹800 g,粉碎成粗粉,加乙醇加熱回流提取3次,濾過(guò),合并濾液,減壓回收乙醇,干燥,加入800 mL聚乙二醇-200,4 000 r·min-1離心20 min,上清液合并后再加入聚乙二醇-200定容至1 000 mL,滅菌,即得每1 mL相當(dāng)于原生藥2 g的藥液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于培養(yǎng)板,細(xì)胞密度為8 ×104·mL-1,預(yù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組處理。① 正常對(duì)照組:不做任何處理,正常培養(yǎng) 24 h;② 炎癥模型組(LPS):1 μg·mL-1LPS 持續(xù)刺激細(xì)胞 6 h;③丹翹組:600 μg·mL-1丹翹液作用細(xì)胞 24 h;④試驗(yàn)組:1 μg·mL-1LPS 持續(xù)刺激RAW264.7細(xì)胞6 h后,加入不同濃度的丹翹液(100、300、600 μg·mL-1)共同作用24 h。

    1.2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)采用MTT試驗(yàn),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于96 孔板中,細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1,培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入20 μL的MTT(5 mg·mL-1)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入100 μL的DMSO溶解甲瓚,均勻振蕩溶解完全后在 570 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度。試驗(yàn)重復(fù)3次以上。1.2.3 NO含量測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于24 孔板中,細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1,培養(yǎng)結(jié)束后,收集各組細(xì)胞上清液,按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清中NO的釋放。酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm處的光吸收值,以亞硝酸鈉作為對(duì)照品測(cè)定并計(jì)算NO的濃度。

    1.2.4 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6、PGE2含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于24 孔板中,細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1,培養(yǎng)結(jié)束后,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,ELISA法檢測(cè)各組TNF-α、IL-6、PGE2含量,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

    1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因轉(zhuǎn)錄水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于6 孔板中,細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1,培養(yǎng)結(jié)束后,Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,得到的cDNA用于RT-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。PCR引物見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)條件是95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,循環(huán)40次;55~95 ℃循環(huán)81次,mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量采用2-△△Ct方法計(jì)算,并以β-actin為內(nèi)參基因。

    表1 RT-PCR引物序列

    Table 1 RT-PCR oligo-nucleotide primers

    引物primers序列GenesequencePCR產(chǎn)物/bpPCRproduct退火溫度/℃Annealingtemperatureβ?actinForwardReverse5′?GCCACCAGTTCGCCATGGAT?3′5′?GCTTTGCACATGCCGGAGC?3′7058TNF?αForwardReverse5′?TCGAGTGACAAGCCCGTAG?3′5′?CAGCCTTGTCCCTTGAAGAG?3′18058IL?6ForwardReverse5′?CTGATGCTGGTGACAACCAC?3′5′?TCCACGATTTCCCAGAGAAC?3′14359iNOSForwardReverse5′?GGACCCAGTGCCCTGCTTT?3′5′?CACCAAGCTCATGCGGCCT?3′17865COX?2ForwardReverse5′?TGAGTACCGCAAACGCTTCTC?3′5′?TGGACGAGGTTTTTCCACCAG?3′15165

    1.2.6 Western blot 檢測(cè) NF-κB 蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1,培養(yǎng)結(jié)束后,根據(jù)試劑盒說(shuō)明提取總蛋白質(zhì)、細(xì)胞核蛋白,BCA 法測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度,各組取40 μg蛋白質(zhì)樣品與蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻,沸水中變性 10 min后,在10% 分離膠、5% 濃縮膠中100 V恒壓進(jìn)行SDS-PAGE電泳2.5 h,結(jié)束后半干轉(zhuǎn)移法12 V恒壓轉(zhuǎn)印1 h到PVDF膜上,用 5%的BSA封閉 1 h,加入一抗過(guò)夜孵育(4 ℃),TBST 洗膜4次,每次10 min,加入HRP 標(biāo)記的二抗在室溫緩慢搖動(dòng)孵育 2 h,TBST 洗滌10 min×4次,加ECL,暗室膠片曝光、顯影、定影后顯示各組細(xì)胞中目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

    2 結(jié) 果

    2.1 丹翹液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

    圖1A為MTT法檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)不同劑量的丹翹液處理后的細(xì)胞活力變化。結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,丹翹液≤700μg·mL-1時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用(P>0.05),當(dāng)?shù)ぢN液大于700μg·mL-1時(shí),細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)。圖1B為丹翹液和LPS共同處理后細(xì)胞的活力變化,結(jié)果與丹翹液?jiǎn)为?dú)處理的一致。

    2.2 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥介質(zhì)的影響

    NO檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,LPS處理組的NO釋放量極顯著升高(P<0.01),丹翹液處理組的NO釋放量不明顯,與LPS處理組相比,丹翹液各組均能極顯著抑制NO的釋放量(P<0.01)。各劑量丹翹液抑制后NO含量與正常對(duì)照組差異顯著(P<0.01或P<0.05)(圖2A)。ELISA檢測(cè)PGE2結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,LPS處理組的PGE2釋放量極顯著升高(P<0.01),與LPS處理組相比,丹翹液高、中劑量組能顯著抑制PGE2的釋放量(P<0.05或P<0.01),低劑量差異不顯著(P>0.05)。高劑量丹翹液抑制后PGE2含量與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),中、低劑量丹翹液抑制后PGE2含量與正常對(duì)照組顯著差異(P<0.01或P<0.05)(圖2B)。

    A.不同濃度的丹翹液(0~1 000 μg·mL-1)作用24 h時(shí)細(xì)胞的活力變化;B.1 μg·mL-1LPS 持續(xù)刺激RAW264.7細(xì)胞6 h后,不同濃度的丹翹液(0~1 000 μg·mL-1)作用24 h時(shí)細(xì)胞的活力變化。標(biāo)注不同大寫(xiě)字母表示組間差異極顯著(P<0.01),標(biāo)相同或未標(biāo)字母表示組間差異不顯著(P>0.05)A.Viabilities of cells that treated with or without Danqiao liquid(0-1 000 μg·mL-1) for 24 h;B.Cells were treated with or without Danqiao liquid for 24 h after exposure to LPS(1 μg·mL-1) for 6 h.Values with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01),and with the same letters or without letters mean not significant difference(P>0.05)圖1 丹翹液對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒活性作用Fig.1 The effects of Danqiao liquid on viability in RAW264.7 cells

    標(biāo)注不同大寫(xiě)字母表示組間差異極顯著(P<0.01),標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05),標(biāo)相同小寫(xiě)字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。下圖同Values with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01),with different letters mean significant difference(P<0.05),and with the same letters mean not significant difference(P>0.05).The same as below圖2 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌NO和PGE2的影響Fig.2 The effects of Danqiao liquid on PGE2 and Nitrite in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

    2.3 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子分泌的影響

    圖3A、B為 ELISA法檢測(cè)丹翹液對(duì) LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6含量的影響,結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,LPS處理組的TNF-α、IL-6釋放量極顯著升高(P<0.01),丹翹液組的釋放量變化不明顯(P>0.05),與LPS處理組相比,高劑量丹翹液能顯著抑制 TNF-α、IL-6的釋放量(P<0.01或P<0.05),但中、低劑量對(duì)TNF-α、IL-6的抑制無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量丹翹液抑制后TNF-α、IL-6含量與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),低劑量丹翹液抑制后TNF-α、IL-6含量與正常對(duì)照組極顯著差異(P<0.01)。

    圖3 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的影響Fig.3 The effects of Danqiao liquid on TNF-α and IL-6 in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

    2.4 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

    RT-PCR檢測(cè)各處理組細(xì)胞的TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示,與正常組相比,LPS處理組的TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2 mRNA轉(zhuǎn)錄均極顯著升高(P<0.01),與LPS處理組相比,丹翹液各劑量組均能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞iNOS和COX-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄的升高(P<0.01或P<0.05)(圖4A、B),也能夠顯著抑制TNF-α、IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄的升高(圖4C、D),且對(duì)TNF-α、iNOS和COX-2具有一定的劑量效應(yīng)。各劑量丹翹液抑制后IL-6、iNOS和COX-2 mRNA轉(zhuǎn)錄與正常對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01),高、中劑量丹翹液抑制后TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄與正常對(duì)照組相比,無(wú)顯著差異(P>0.05)。

    圖4 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 The effects of Danqiao liquid on gene transcription of TNF-α,IL-6, iNOS and COX-2 in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

    2.5 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 蛋白表達(dá)

    Western blot對(duì)不同處理組細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)檢測(cè),結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比,LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞活化后,細(xì)胞核內(nèi) NF-κB p65蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01),與LPS處理組相比,不同濃度的丹翹液處理后,顯著抑制NF-κB p65 表達(dá)(P<0.05),并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性(圖5)。

    圖5 丹翹液對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effects of Danqiao liquid on nuclear translocation of NF-κB p65 in RAW264.7 cells by LPS

    3 討 論

    炎癥是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng),表現(xiàn)為紅腫熱痛和功能障礙。炎癥反應(yīng)是損傷與抗損傷的過(guò)程,損傷因子一方面可以直接或間接破壞組織和細(xì)胞,另一方面可以通過(guò)炎癥充血和滲出反應(yīng),殺傷和包圍損傷因子,通過(guò)實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞的再生修復(fù)和愈合受損的組織[10-11]。如損傷過(guò)程占優(yōu)勢(shì),則炎癥加重,并向全身擴(kuò)散;若抗損傷過(guò)程占優(yōu)勢(shì),則炎癥逐漸趨向痊愈。所以,控制損傷、加強(qiáng)抗損傷過(guò)程是機(jī)體維持正常生理功能的重要環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞參與吞噬、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、新陳代謝和炎癥等多種生理過(guò)程。微生物刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎性細(xì)胞因子和趨化因子,這些促炎因子反過(guò)來(lái)引起細(xì)胞滲出和激活其他類(lèi)型的免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞),這些因素共同介導(dǎo)形成免疫炎癥反應(yīng)[12-13]。因此本研究利用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型對(duì)丹翹液的體外抗炎作用及機(jī)制進(jìn)行深入的探討。本試驗(yàn)首先檢測(cè)丹翹液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響,MTT試驗(yàn)結(jié)果表明,藥物濃度在700 μg·mL-1以?xún)?nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。因此,選擇0~700 μg·mL-1的丹翹液進(jìn)行下一步的抗炎活性研究。

    NO既能參與機(jī)體生理過(guò)程的調(diào)節(jié)及免疫應(yīng)答反應(yīng),其過(guò)度產(chǎn)生又可導(dǎo)致組織損傷和炎性反應(yīng)。體內(nèi)NO產(chǎn)生由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生。NOS可以分為結(jié)構(gòu)型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。eNOS只產(chǎn)生少量NO,發(fā)揮正常生理作用,病原微生物感染及組織損傷都可誘導(dǎo)iNOS表達(dá),促進(jìn)NO大量產(chǎn)生。NO具有抗炎和促炎雙重功能[14-15]。少量NO可通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附表現(xiàn)抗炎活性[16]。反之,炎癥性疾病過(guò)程中,過(guò)度的NO通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6等的產(chǎn)生促進(jìn)炎性反應(yīng),這些細(xì)胞因子又能激活iNOS,促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更多的NO,使NO及細(xì)胞因子的分泌得以持續(xù),從而使炎癥反應(yīng)更持久,更劇烈[17]。環(huán)氧酶(COX)是機(jī)體催化花生四稀酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎氐南匏倜?,COX有三種同工酶,其中COX-2為誘導(dǎo)性表達(dá),在脂多糖(LPS)等炎癥因子的誘導(dǎo)下,COX-2大量合成,進(jìn)而催化PGs大量合成,參與并放大炎癥反應(yīng)[18-21]。在炎癥過(guò)程中,若能夠抑制炎性介質(zhì)NO和PGE2的釋放及其催化酶的活化,就能有效抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,LPS刺激細(xì)胞后NO 和PGE2的分泌水平極顯著升高,說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了極顯著的炎癥反應(yīng),不同劑量的丹翹液作用炎性細(xì)胞后均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO和PGE2的分泌及iNOS和COX-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄,且表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng),結(jié)果表明丹翹液抑制炎癥限速酶的基因表達(dá)和介質(zhì)分泌是其抗炎機(jī)制之一。但是丹翹液抑制后NO和PGE2的分泌及iNOS和COX-2 mRNA轉(zhuǎn)錄與正常對(duì)照組相比有顯著差異,說(shuō)明丹翹液有抗炎癥作用,但不能完全阻斷細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

    細(xì)胞因子是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性、且功能復(fù)雜的小分子蛋白質(zhì)。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,被視為促進(jìn)炎癥反應(yīng)最重要的細(xì)胞因子之一,它能引起急性炎癥性疾病并引起組織損傷[22-23]。IL-6也是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要因素,它能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分化,和其他炎性細(xì)胞因子協(xié)同作用,級(jí)聯(lián)促進(jìn)和放大炎癥反應(yīng)造成組織損傷[24]。因此,TNF-α和IL-6作為炎癥標(biāo)志物,對(duì)藥物的抗炎作用研究具有指示作用[25]。試驗(yàn)結(jié)果顯示,高劑量丹翹液能顯著抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)中TNF-α和IL-6的釋放,但中、低劑量對(duì)TNF-α和IL-6的釋放抑制效果不顯著。同時(shí)TNF-α和IL-6基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄結(jié)果顯示,丹翹液各劑量組均能劑量依懶性的抑制TNF-α和IL-6的轉(zhuǎn)錄,以上結(jié)果說(shuō)明丹翹液對(duì)促炎細(xì)胞因子分泌的抑制是抑制其基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。此外,兩種檢測(cè)結(jié)果間有差異可能與不同方法的靈敏度有關(guān)。

    此外,NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥反應(yīng)的各階段起重要的調(diào)控作用,其主要的誘導(dǎo)型亞基是p50/p65[26]。 靜息狀態(tài)時(shí),NF-κB與 IκB 形成復(fù)合體存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到特定刺激后,IκB 被活化的激酶復(fù)合體(IκB kinase,IKK)磷酸化,NF-κB與 IκB 解離,游離的 NF-κB p65迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,與κB 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)炎性介質(zhì)及促炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[27-31]。本試驗(yàn)NF-κB蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,LPS刺激細(xì)胞后,細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)升高,說(shuō)明NF-κB被激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),丹翹液能抑制細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)升高,說(shuō)明丹翹液可抑制NF-κB的活化與核轉(zhuǎn)移,進(jìn)而抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。

    4 結(jié) 論

    丹翹液能夠抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)NO和PGE2;也能抑制炎性因子TNF-α和IL-6的分泌及其基因轉(zhuǎn)錄;亦對(duì)炎癥關(guān)鍵酶iNOS、COX-2的基因轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。丹翹液能抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的激活,抑制NF-κB p65活化因子的入核轉(zhuǎn)移,從而抑制炎癥過(guò)程中關(guān)鍵酶和炎癥因子的基因表達(dá)及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。因此,丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抗炎保護(hù)作用。

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    (編輯 白永平)

    Inhibiting Effect Analysis ofDanqiaoLiquid on Inflammation-related Factors Induced by LPS in RAW264.7 Cells

    WEI Li-qin1,2,WANG Dong-sheng1,DONG Shu-wei1,KUANG Xiao-jiao1,ZHANG Shi-dong1*,YAN Zuo-ting1*

    (1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS/KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticsDiscovery,MinistryofAgriculture/Engineering&TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince,Lanzhou730050,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

    The aim of the present study was to study the anti-inflammatory effects and possible underlying mechanisms ofDanqiaoliquid in LPS-stimulated RAW264.7 cells.The cytotoxicity ofDanqiaoliquid was detected by MTT method.The NO kit assay was adopted to detect the effect ofDanqiaoliquid on NO release from LPS-induced RAW264.7 cells.ELISA was used to evaluate the production of TNF-α,IL-6 and PGE2in LPS-induced RAW264.7 cells.Real-time PCR was used to detect the transcription of COX-2,iNOS,TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells.The protein expression of nuclear NF-κB p65 was detected by Western blot.The result showed that the safe medication range ofDanqiaoliquid was less than 700 μg·mL-1.Compared with the LPS model group,Danqiaoliquid(100,300,600 μg·mL-1) could reduce the secretion of NO,PGE2,TNF-α,and IL-6 in cells induced by LPS,and significantly inhibit the mRNA transcription of iNOS,COX-2,TNF-α,IL-6 and the protein expression of NF-κB p65.In conclusion,this study preliminarily proves the protective effect ofDanqiaoliquid on LPS-induced RAW264.7 macrophages.Its action mechanism may be related to inhibit NF-κB signal pathway and the genes expressions and secretion of inflammatory mediators and cytokines.

    Danqiaoliquid;anti-inflammatory mechanism;RAW264.7;LPS;inflammatory models

    10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.023

    2015-04-13

    “十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD12B03);中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程-奶牛疾病研究

    魏立琴(1986-),女,甘肅蘭州人,碩士,主要從事中獸醫(yī)臨床和奶牛疾病防治的研究,E-mail:24weiliqin@163.com,Tel:0931-2115262

    *通信作者:張世棟(1983-),男,甘肅張掖人,助理研究員,碩士,主要從事藥理毒理學(xué)研究,E-mail:zhangshidong@caas.cn,Tel:0931-2115262;嚴(yán)作廷(1962-),男,甘肅武威人,研究員,博士,主要從事中獸醫(yī)臨床和奶牛疾病防治的研究,E-mail:yanzuoting@caas.cn,Tel:0931-2115261

    S853.9

    A

    0366-6964(2015)12-2299-08

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