美洲水貂(Neovisonvison)黑素皮質(zhì)激素受體-1

(1R)基因序列鑒定及生物信息學(xué)分析

宋興超，徐 超，岳志剛，王 雷，叢 波，劉琳玲，楊福合*

美洲水貂(Neovisonvison)黑素皮質(zhì)激素受體-1

(MC1R)基因序列鑒定及生物信息學(xué)分析

宋興超，徐 超，岳志剛，王 雷，叢 波，劉琳玲，楊福合*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130112)

旨在探明美洲水貂黑素皮質(zhì)激素受體-1(Melanocortin-1 receptor，MC1R)基因序列結(jié)構(gòu)特征及其對(duì)皮毛顏色的調(diào)控機(jī)制。根據(jù)歐洲水貂MC1R基因(GenBank登錄號(hào)：AB189820)核苷酸序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，利用PCR及克隆技術(shù)測(cè)定美洲短毛黑水貂MC1R基因完整編碼區(qū)序列(CDS)，并對(duì)該序列進(jìn)行了BLAST比對(duì)及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，獲得的美洲水貂MC1R基因與歐洲水貂相似性為95%，為單一外顯子基因，核苷酸序列長(zhǎng)度為1 324 bp，包括部分5′UTR(188 bp)、CDS(954 bp)和3′UTR(182 bp)，編碼區(qū)堿基G+C含量高達(dá)66.04%，由CDS推導(dǎo)共編碼317個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的MC1R蛋白理論分子質(zhì)量為34.49 ku，等電點(diǎn)(PI)為8.97，不穩(wěn)定系數(shù)是36.63，屬于弱堿性穩(wěn)定蛋白質(zhì)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，美洲水貂MC1R基因編碼的蛋白存在1個(gè)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域和7個(gè)典型的跨膜區(qū)，N-端不存在信號(hào)肽，定位于細(xì)胞質(zhì)膜，具有典型的細(xì)胞膜受體結(jié)構(gòu)。分子進(jìn)化分析顯示，美洲水貂與歐洲水貂親緣關(guān)系較近，與二者均屬鼬科、鼬屬動(dòng)物的傳統(tǒng)動(dòng)物分類學(xué)一致。美洲水貂MC1R基因的獲取及序列結(jié)構(gòu)特征分析為揭示其皮毛顏色多樣性的分子遺傳學(xué)機(jī)制奠定了詳細(xì)的生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

美洲水貂；黑素皮質(zhì)激素受體-1基因；皮毛顏色；跨膜區(qū)；生物信息學(xué)

水貂(Neovisonvison)屬哺乳綱(Mammalia)、食肉目(Carnivore)、鼬科(Mustelidae)、鼬屬(Mustela)、水貂亞屬動(dòng)物，在自然界水貂亞屬動(dòng)物有3個(gè)種，即歐洲水貂(Mustelalutreola)、美洲水貂(Neovisonvison)和海水貂(Mustelamacrodon，已絕種)[1]。目前，世界各地飼養(yǎng)的水貂均由野生美洲水貂馴養(yǎng)和培育而來(lái)。野生水貂全身被毛一致，呈深褐色，在家養(yǎng)條件下，稱為標(biāo)準(zhǔn)貂。彩色水貂是深褐色標(biāo)準(zhǔn)貂的突變型，目前已出現(xiàn)30多個(gè)毛色突變基因(包括復(fù)等位基因)，并通過(guò)各種組合，已增加到100余種[2]。水貂以其珍貴的毛皮和獨(dú)特的皮張顏色等特點(diǎn)深受消費(fèi)者青睞，由于利用水貂華麗的毛皮制裘，故在育種工作中十分重視毛色遺傳及彩色新品種的培育，據(jù)常規(guī)雜交育種理論，彩色水貂根據(jù)色型可以分為黑色系、白色系、淺褐色系和灰藍(lán)色系等4大類[3]。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物皮膚及毛發(fā)的顏色主要由毛皮中黑色素細(xì)胞合成的真黑色素(黑與褐)和褐黑色素(紅與黃)的比例及分布情況決定[4]，黑素皮質(zhì)激素受體-1(Melanocortin-1 receptor gene，MC1R)基因由毛色擴(kuò)展位點(diǎn)(Extension，E)編碼，屬G-蛋白偶聯(lián)受體-黑素皮質(zhì)素受體(Melanorcortin receptors，MCRs)家族中的一員，主要在動(dòng)物黑色素細(xì)胞中表達(dá)[5]。研究證實(shí)，MC1R基因變異與馬[6]、牛[7]、家兔[8]、家犬[9]等哺乳動(dòng)物的皮毛顏色及雞[10]、鵪鶉[11]等禽類的羽色相關(guān)。然而，有關(guān)MC1R基因與水貂毛色關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以MC1R基因作為影響水貂毛色性狀的候選基因，對(duì)其進(jìn)行克隆、測(cè)序及生物信息學(xué)分析，旨在為從分子水平深入解析水貂MC1R基因功能及進(jìn)一步開(kāi)展MC1R基因多態(tài)性與水貂毛色的相關(guān)性研究提供基礎(chǔ)信息，同時(shí)也為水貂功能基因組學(xué)研究奠定分子遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取材

選取農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)白山野生生物資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站毛皮動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地雄性短毛黑水貂(66只)作為受試動(dòng)物，水貂取皮時(shí)心采血5.0 mL，置于真空抗凝采血管中。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、ExTaqDNA 聚合酶均購(gòu)自大連寶生物公司；瓊脂糖購(gòu)自Promega公司。

1.3 基因組DNA提取

采用傳統(tǒng)酚-氯仿抽提法[12]略加修改提取水貂血液基因組DNA，取5 μL用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性、含量及純度，-20 ℃保存待用。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

由于在GenBank中未檢索到美洲水貂MC1R基因序列，因此本研究以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中歐洲水貂(登錄號(hào)：AB189820)MC1R基因序列作為參照，將該序列在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中雪貂(Mustelaputoriusfuro)全基因組序列進(jìn)行搜索，獲得一段2 000 bp的核苷酸序列，以該序列作為假定的美洲水貂MC1R基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件在完整編碼區(qū)兩端設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增美洲水貂MC1R基因，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 324 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：M1F：5′-TTAGTGGATTTTACCTGGATGGG-3′，M1R：5′-ATTGGCTTACTTGCTGTTTGTCTG-3′。

1.5 PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

反應(yīng)體系25 μL：ExTaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1) 0.25 μL，10×PCR Buffer(Mg2+Plus) 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1 μL，滅菌去離子水17.25 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸82 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將目的片段經(jīng)過(guò)切膠、回收純化后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.6 序列鑒定與生物信息學(xué)分析

測(cè)序峰圖用軟件Chromas 2.3進(jìn)行校對(duì)、整理，以確保序列無(wú)誤；采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST工具(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列鑒定。通過(guò)BioEdit 7.0軟件統(tǒng)計(jì)MC1R基因編碼序列堿基含量；利用ProtParam在線工具(http：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)推導(dǎo)MC1R蛋白分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)等理化特性；采用PSORT II在線服務(wù)器和Softberry網(wǎng)站(http：//linux1.softberry.com/)分析美洲水貂MC1R蛋白的亞細(xì)胞定位，用TMHMM 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)美洲水貂MC1R蛋白跨膜區(qū)，MC1R蛋白潛在功能基序利用在線工具M(jìn)otif Scan(http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)完成預(yù)測(cè)。美洲水貂MC1R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用PHD方法完成(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_phd.html)。利用DNAStar 7.0軟件包中的MegAlign程序?qū)Λ@取的美洲水貂等8個(gè)食肉目物種的MC1R基因編碼區(qū)核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)，并基于該基因編碼氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果采用非加權(quán)組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)對(duì)不同物種MC1R蛋白序列進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，分析物種間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 血液基因組DNA提取

本試驗(yàn)提取了66只短毛黑水貂的血液基因組

DNA，取5 μL基因組DNA溶液用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。由圖1可知，采用酚-氯仿抽提獲得的基因組DNA條帶清晰，大小約21 kb，無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明DNA完整性較好，含量較高，符合PCR的要求。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～10.水貂基因組DNAM.λ-DNA/EcoR Ⅰ+Hind Ш Marker；1-10.Genomic DNA of mink圖1 水貂血液基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of genomic DNA for mink

2.2MC1R基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以M1F和M1R作為上、下游引物，水貂血液基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)，片段大小與預(yù)期設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度相吻合，條帶單一、清晰，無(wú)拖尾，表明擴(kuò)增效果較好，可用于后續(xù)克隆反應(yīng)。

M.DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1.陰性對(duì)照；2～13.水貂MC1R基因產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2000；1.Negative control；2-13.Products of MC1R gene圖2 水貂MC1R基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis of the products of MC1R gene in mink

2.3MC1R基因鑒定

經(jīng)過(guò)對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，獲得了一條長(zhǎng)度為1 324 bp的核苷酸序列，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)該序列189～1 142 bp與NCBI中公布的歐洲水貂(AB189820)MC1R基因1～954位核苷酸序列相似性達(dá)到95%，且189～1 078位核苷酸序列與白鼬(AB189829)1～890位存在97%的相似性(圖3)。以其他物種MC1R基因序列為參考，發(fā)現(xiàn)水貂該基因完整編碼區(qū)(CDS)序列長(zhǎng)度也為954 bp，初步表明，本研究獲得的序列就是水貂MC1R基因序列。序列已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)： KJ152766。

圖3 水貂MC1R基因核苷酸序列BLAST部分結(jié)果Fig.3 Partial results of BLAST for nucleotide sequence of mink MC1R gene

2.4 美洲水貂MC1R基因核苷酸及氨基酸序列結(jié)構(gòu)特性

以其他物種MC1R基因序列結(jié)構(gòu)作為參照，將經(jīng)過(guò)BLAST鑒定正確的美洲水貂MC1R基因核苷酸序列分析后，表明獲得的基因序列長(zhǎng)度為1 324 bp，包括5′UTR(188 bp)、CDS(954 bp)和3′UTR(182 bp)，ATG作為起始密碼子，終止密碼子為T(mén)GA，從NCBI下載的8種食肉目動(dòng)物該基因CDS核苷酸組成表現(xiàn)為C>G>T>A，其中美洲水貂G+C含量最高(66.04%)(表1)。

表1 食肉目動(dòng)物MC1R基因完整編碼區(qū)序列堿基組成

Table 1 Base composition ofMC1R gene CDS among Carnivore

物種SpeciesGenBank登錄號(hào)堿基組成/%Basecomposition核苷酸Nucleotide氨基酸AminoacidACGTA+TG+C美洲水貂N.visonKJ152766AHN9090813.3136.7929.2520.6533.9666.04歐洲水貂M.lutreolaAB189820BAE4715714.6836.5826.9421.8036.4863.52烏蘇里貉N.procyonoidesHM852533ADR8190115.4134.3826.0024.2139.6260.38北極狐A.lagopusAJ786717CAH1074015.4134.2826.0024.3239.7360.27赤狐V.vulpesX90844CAA6234915.4134.5925.8924.1139.5260.48家貓F(tuán).catusFM877776CAT0057413.2136.1628.9321.7034.9165.09美洲虎P.oncaAY237396AAO6241313.3136.0628.8321.8035.1264.88美洲山貓H.yaguarondiAY237399AAO6241613.4236.1628.8321.5935.0164.99

美洲水貂MC1R基因CDS序列推導(dǎo)為氨基酸序列后，共編碼317個(gè)氨基酸。ProtParam程序預(yù)測(cè)結(jié)果表明，美洲水貂MC1R基因編碼的317個(gè)氨基酸中，包括13個(gè)酸性氨基酸(Asp、Glu)，占4.1%，22個(gè)堿性氨基酸(Lys、Arg)，占6.9%，73個(gè)極性氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr)，占23.0%，158個(gè)疏水性氨基酸(Ala、Ile、Leu、Phe、Trp、Val)，占50.8%，可見(jiàn)美洲水貂MC1R蛋白中疏水性氨基酸的比例最高。美洲水貂MC1R蛋白化學(xué)分子式為C1583H2523N413O403S22，由4 944個(gè)原子組成，分子質(zhì)量為34.49 ku，理論等電點(diǎn)(PI)為8.97，屬于弱堿性蛋白；其消光系數(shù)在280 nm時(shí)為34 795，推導(dǎo)半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為36.63，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)(計(jì)算指數(shù)<40：穩(wěn)定，計(jì)算指數(shù)>40：不穩(wěn)定)；脂肪系數(shù)為125.77，總平均親水性系數(shù)為0.836，表明該蛋白是一種親水蛋白。美洲水貂MC1R蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu(50個(gè)，15.8%)和Val(38個(gè)，12.0%)含量豐富，Trp(4個(gè)，1.3%)含量最少，帶正電氨基酸殘基(Arg+Lys)為22個(gè)，帶負(fù)電氨基酸殘基(Asp+Glu)為13個(gè)。

2.5 美洲水貂MC1R蛋白亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)及重要功能基序預(yù)測(cè)

利用PSORT II在線服務(wù)器分析美洲水貂MC1R蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，美洲水貂MC1R蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜(Plasma membrane)的可能性為65.2%，預(yù)測(cè)該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum)、液泡(Vacuolar)、高爾基體(Golgi)和細(xì)胞核(Nuclear)的可能性分別為17.4%、8.7%、4.3%和4.3%；Softberry網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，美洲水貂MC1R蛋白定位于細(xì)胞膜的分?jǐn)?shù)為9.79(滿分：10.00)。因此，綜合上述2種預(yù)測(cè)結(jié)果，可以推斷美洲水貂MC1R蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜。

TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè)美洲水貂MC1R整個(gè)蛋白多肽鏈存在7個(gè)強(qiáng)跨膜區(qū)(第42～64、76～98、118～140、160～182、186～208、243～265和280～302位氨基酸)，4個(gè)細(xì)胞外區(qū)(位于1～41、99～117、183～185和266～279位氨基酸)和4個(gè)細(xì)胞內(nèi)區(qū)(位于65～75、141～159、209～242、303～317位氨基酸)(圖4)。

小圓點(diǎn)表示與美洲水貂氨基酸序列一致，序列上面的o表示胞外區(qū)，t表示跨膜區(qū)，i表示胞內(nèi)區(qū)，方框表示美洲水貂特異性氨基酸位點(diǎn)，粗方框表示N-糖基化位點(diǎn)Small dot is same site as Neovison vison MC1R，o shows outside regions，t shows transmembrane regions，i shows inside regions，square shows special locus in Neovison vison MC1R amino acid and bold square shows N-glycosylation sites圖4 美洲水貂與另外7個(gè)食肉目物種MC1R基因編碼氨基酸序列比較Fig.4 Comparison of the MC1R amino acid sequences between Neovison vison and other 7 Carnivora species

Motif Scan在線工具預(yù)測(cè)表明，美洲水貂MC1R蛋白潛在重要功能基序：1個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體家族信號(hào)(130～146位：SSLCFLGAIAVDRYISI)，2個(gè)N-糖基化(N-glycosylation site)位點(diǎn)：15～18(NSTP)和29～32(NQTG)，3個(gè)酪蛋白激酶-2磷酸化(Casein kinase II phosphorylation site：CK2)位點(diǎn)：39～42(SVPD)、52～55(SVLE)和308～311(TLQE)，5個(gè)N-豆蔻?；?N-myristoylation site)位點(diǎn)：12～17(GSLNST)、43～48(GLFLCL)、78～83(GCLAAS)、126～131(GAVVSS)和172～177(GVLAGA)，1個(gè)蛋白激酶C磷酸化(Protein kinase C phosphorylation site)位點(diǎn)：236～238(SLK)，1個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體家族標(biāo)志位點(diǎn)：55～298位氨基酸，1個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體化學(xué)感受因子：46～86位氨基酸。

2.6 美洲水貂MC1R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

PHD方法預(yù)測(cè)表明，美洲水貂MC1R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由65.93%(209個(gè))的α-螺旋(Helix)、8.83%(28個(gè))的延伸直鏈(Extended strand)和25.24%(80個(gè))的無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)組成，可知α-螺旋為美洲水貂MC1R蛋白主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。對(duì)美洲水貂與歐洲水貂、烏蘇里貉、北極狐、赤狐、家貓、美洲虎和美洲山貓等食肉目物種的MC1R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示(表2)，家貓的MC1R蛋白α-螺旋比例(71.61%)在7個(gè)食肉目物種中最高，美洲水貂無(wú)規(guī)則卷曲含量高于其他物種，而延伸直鏈在赤狐中比例最高(14.83%)。

表2 美洲水貂與其他7個(gè)食肉目物種MC1R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Table 2 Prediction of MC1R protein secondary structure amongMustelavisonand other 7 Carnivore species

物種Speciesα-螺旋Alphahelix無(wú)規(guī)則卷曲Randomcoil延伸直鏈Extendedstrand數(shù)量/個(gè)Number比例/%Percentage數(shù)量/個(gè)Number比例/%Percentage數(shù)量/個(gè)Number比例/%Percentage美洲水貂N.vison20965.938025.24288.83歐洲水貂M.lutreola22570.987022.08226.94烏蘇里貉N.procyonoides22069.407022.08278.52北極狐A.lagopus21467.516420.193912.30赤狐V.vulpes20765.306319.874714.83家貓F(tuán).catus22771.616219.56288.83美洲虎P.onca21768.456219.563811.99美洲山貓H.yaguarondi21266.886721.143811.99

2.7 不同物種MC1R基因序列相似性比較及分子進(jìn)化分析

經(jīng)過(guò)DNAMAN軟件比對(duì)，美洲水貂與歐洲水貂、烏蘇里貉、北極狐、赤狐、家貓、美洲虎和美洲山貓MC1R基因編碼區(qū)序列核苷酸序列相似性在84.38%～94.34%，推導(dǎo)氨基酸序列相似性為80.76%～90.54%，詳見(jiàn)表3。

表3 美洲水貂與其他7個(gè)食肉目物種MC1R基因序列相似性比較

Table 3 Similarity comparison of the coding region sequence inMC1R gene amongMustelavisonand other 7 Carnivora species %

序列Sequence歐洲水貂M.lutreola烏蘇里貉N.procyonoides北極狐A.lagopus赤狐V.vulpes家貓F(tuán).catus美洲虎P.onca美洲山貓H.yaguarondi核苷酸Nucleotide94.3484.9184.5984.3886.6987.2186.90氨基酸Aminoacid90.5482.3381.3980.7683.2883.9183.28

在使用DNAStar 7.0軟件包中的MegAign程序?qū)γ乐匏鹾推渌?個(gè)食肉目物種MC1R基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析的基礎(chǔ)上(圖4)，用View中的Phylogenetic Tree可以得到基于該基因氨基酸序列不同物種的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5，分支節(jié)點(diǎn)處數(shù)字為1 000次Bootstrop檢驗(yàn)的支持百分比)。從圖中可以看出，7個(gè)食肉目物種形成3大分支，鼬科、犬科和貓科，其中美洲水貂和歐洲水貂同屬鼬科、鼬屬處在一個(gè)分支，烏蘇里貉、北極狐和赤狐因同屬犬科而聚為一類，第三個(gè)分支為家貓、美洲虎和美洲山貓(貓科)。這與NCBI中物種傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及生化特征分類的進(jìn)化地位基本一致，該結(jié)果暗示MC1R基因可適于物種分子進(jìn)化研究。

Panthera onca.美洲虎；Herpailurus yaguarondi.美洲山貓；Felis catus.家貓；Nyctereutes procyonoides.烏蘇里貉；Vulpes lagopus.北極狐；Vulpes vulpes.赤狐；Mustela vison.美洲水貂；Mustela lutreola.歐洲水貂圖5 8個(gè)食肉目物種MC1R基因編碼氨基酸序列分子進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Molecular phylogenetic tree based on the MC1R amino acid sequence among 8 Carnivora species

3 討 論

3.1 美洲水貂MC1R基因結(jié)構(gòu)特性

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已知哺乳動(dòng)物序列信息，利用與美洲水貂親緣關(guān)系最近的歐洲水貂MC1R基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得美洲水貂MC1R基因完整編碼區(qū)序列。BLAST鑒定結(jié)果表明，該序列與歐洲水貂和白鼬同源序列相似性分別為95%和97%，初步證明，本研究所獲得的序列為美洲水貂MC1R基因序列。進(jìn)一步分析顯示，美洲水貂MC1R基因與烏蘇里貉[13]、北極狐[14]等犬科動(dòng)物結(jié)構(gòu)相似，基因內(nèi)部無(wú)內(nèi)含子，為單外顯子。序列結(jié)構(gòu)特征分析顯示，美洲水貂MC1R基因長(zhǎng)954 bp，共編碼317個(gè)氨基酸，具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，4個(gè)細(xì)胞外區(qū)和4個(gè)細(xì)胞內(nèi)區(qū)，呈典型的細(xì)胞表面受體樣結(jié)構(gòu)。同時(shí)，Softberry 服務(wù)器也預(yù)測(cè)MC1R蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜。在其他哺乳動(dòng)物中的研究表明，MC1R基因?yàn)榧?xì)胞膜表面受體，與α-黑色素細(xì)胞刺激素(α-MSH)結(jié)合，通過(guò)G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP含量上升，cAMP活化色素生成中的酪氨酸激酶，誘導(dǎo)真黑色素的合成，形成黑色被毛[15]。這與本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)美洲水貂MC1R蛋白為定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的受體結(jié)果一致。由此也再一次從氨基酸序列角度證明本研究獲得的核苷酸序列就是美洲水貂MC1R基因序列。

3.2MC1R基因分子進(jìn)化及其氨基酸變異位點(diǎn)與水貂毛色相關(guān)性分析

本研究獲得的美洲水貂MC1R基因編碼區(qū)核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中已報(bào)道的歐洲水貂、家貓等貓科及烏蘇里貉等犬科動(dòng)物分別比對(duì)后，結(jié)果表明，其與歐洲水貂的相似性最高，核苷酸相似性為94.34%，氨基酸序列相似性達(dá)到90.54%；其次與貓科動(dòng)物核苷酸相似性為86.69%～87.21%，氨基酸序列相似性為83.28%～83.91%；與犬科動(dòng)物相似性最低。由此說(shuō)明美洲水貂與歐洲水貂的親緣關(guān)系最近，這與利用MC1R基因編碼氨基酸序列構(gòu)建的UPGMA進(jìn)化樹(shù)[14]得到的聚類結(jié)果一致，美洲水貂和歐洲水貂均屬鼬科、鼬屬動(dòng)物，它們聚為一類與其本身的生理特性及NCBI中經(jīng)典動(dòng)物系統(tǒng)分類是相吻合的。另外，從氨基酸序列比對(duì)水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，美洲水貂存在13個(gè)特異性變異位點(diǎn)，分別為第9、47、82、99、118、128、168、172、178、189、200、281和291位氨基酸，其中第9和99位突變位點(diǎn)存在于細(xì)胞外區(qū)，其余11個(gè)位點(diǎn)分別位于不同的跨膜區(qū)內(nèi)。118位點(diǎn)由酸性的天冬氨酸(Asp：D)突變?yōu)榉菢O性的甘氨酸(Gly：G)，128位點(diǎn)由極性的蛋氨酸(Met：M)突變?yōu)榉菢O性的纈氨酸(Val：V)，這2處突變發(fā)生在MC1R受體蛋白的第3跨膜區(qū)外端，其突變可能會(huì)改變?cè)撌荏w的等電點(diǎn)(PI)或親、疏水平衡值，進(jìn)而影響該受體與α-MSH等配體的結(jié)合能力，進(jìn)一步導(dǎo)致真黑色素合成含量下降，影響黑色素的沉積，形成稀釋毛色。172位點(diǎn)由極性的絲氨酸(Ser：S)突變?yōu)榉菢O性的甘氨酸(Gly：G)，位于第4跨膜區(qū)；而281位點(diǎn)由極性的天冬酰胺(Asn：N) 突變?yōu)閴A性的組氨酸(His：H)，位于第7跨膜區(qū)。同樣，這些突變位點(diǎn)僅存在于美洲水貂中，推測(cè)可能會(huì)影響MC1R蛋白的空間構(gòu)象，也可能作為下游信號(hào)分子的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。其余特異性位點(diǎn)僅僅是同性質(zhì)氨基酸的改變，或者是美洲水貂MC1R基因特有的位點(diǎn)。今后應(yīng)重點(diǎn)對(duì)這些可能影響MC1R蛋白功能的突變位點(diǎn)與水貂不同毛色的相關(guān)性進(jìn)行深入分析，為從分子水平闡明水貂皮毛顏色的遺傳學(xué)機(jī)制以及加快毛皮動(dòng)物育種進(jìn)展奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序獲得了美洲水貂MC1R基因1 324 bp的核苷酸序列，該序列僅有1個(gè)外顯子，編碼序列長(zhǎng)954 bp，共編碼317個(gè)氨基酸。美洲水貂MC1R蛋白多肽鏈存在1個(gè)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域和7個(gè)典型的跨膜區(qū)，具有典型的細(xì)胞膜受體結(jié)構(gòu)。編碼區(qū)核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的相似性比對(duì)及分子進(jìn)化均顯示，美洲水貂與歐洲水貂具有較近的親緣關(guān)系。美洲水貂MC1R基因的鑒定及序列分析為進(jìn)一步揭示其皮毛顏色多樣性的分子遺傳學(xué)機(jī)制奠定了詳細(xì)的生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

[1] 國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì).中國(guó)畜禽遺傳資源志-特種畜禽志[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012：220-255. National Livestock Genetic Resources Commission .Animal Genetic Resources in China Other Animals[M].Beijing：China Agriculture Press，2012：220-255.(in Chinese)

[2] 佟煜仁，張志明.圖說(shuō)毛皮動(dòng)物毛色遺傳及繁育新技術(shù)[M].北京：金盾出版社，2009：18-27. TONG Y R，ZHANG Z M.Figure for coat color genetics and new reproductive technology of fur animals[M].Beijing：Jindun Publishing House，2009：18-27.(in Chinese)

[3] 華 盛，華樹(shù)芳.毛皮動(dòng)物高效健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：2-8. HUA S，HUA S F.The key technologies for efficient and healthy farming in fur animal[M].Beijing：Chemical Industry Press，2009：2-8.(in Chinese)

[4] 任玉紅，楊 剛，范瑞文，等.黑素皮質(zhì)激素受體1(MC1R)在不同毛色羊駝皮膚組織中的表達(dá)與定位研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43(7)：1049-1055. REN Y H，YANG G，F(xiàn)AN R W，et al.Expression and immunolocalization of melanocortin receptor 1(MC1R) in alpaca skin with different coat color[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2012，43(7)：1049-1055.(in Chinese)

[5] ROBBINS L S，NADEAU J H，JOHNSON K R，et al.Pigmentation phenotypes of variant extension locus alleles result from point mutations that alter MSH receptor function[J].Cell，1993，72(6)：827-834.

[6] MARKLUND L，JOHANSSON MOLLER M，SANDBERG K，et al.A missense mutation in the gene for melanocyte-stimulating hormone receptor(MC1R) is associated with the chestnut coat color in horses[J].MammGenome， 1996，7(12)：895-899.

[7] KLUNGLAND H，VAGE D I，GOMEZ-RAYA L，et al.The role of melanocyte-stimulating hormone(MSH) receptor in bovine coat color determination[J].MammGenome，1995，6：636-639.

[8] FONTANESI L，TAZZOLI M，BERETTI F，et al.Mutations in the melanocortin 1 receptor(MC1R) gene are associated with coat colours in the rabbit(Oryctolaguscuniculus)[J].AnimGenet，2006，37(5)：489-493.

[9] NEWTON J M，WILKIE A L，HE L，et al.Melanocortin 1 receptor variation in the domestic dog[J].MammGenome，2000，6：24-30.

[10] KERJE S，LIND J，SCHUTZ K，et al.Melanocortin 1-receptor(MC1R) mutations are associated with plumage colour in chicken[J].AnimGenet，2003，34(4)：241-248.

[11] NADEAU N J，MINVIELLE F，MUNDY N I.Association of a Glu92Lys substitution in MC1R with extended brown in Japanese quail(Coturnixjaponica)[J].AnimGenet，2006，37(3)：287-289.

[12] SAMBROOK J，F(xiàn)RITSCH E F，MANIATIS T.Molecular Cloning(Second edition)[M].New York，Cold Spring Habor Laboratory Press，1989：264-468.

[13] HAN J，YANG H，JEUNG E B，et al.Altered expression of melanocortin-1receptor(MC1R) in a yellow-coloured wild racoon dog(Nyctereutesprocyonoides)[J].VetDermatol，2012，23：187-191.

[14] LIU Z Z，GONG Y F，F(xiàn)ENG M S，et al.Bioinformatics analysis of Melanocortin-1 receptor gene for silver fox and other species[J].JAnimVetAdv，2012，11(7)：1000-1006.

[15] SANCHEZ M J，OLIVARES S C，GHANEM G，et al.Loss-of-function variants of the human melanocortin-1 receptor gene in melanoma cells define structural determinants of receptor function[J].Biochem，2002，269：6133-6141.

(編輯 郭云雁)

Identification and Bioinformatic Analysis on Melanocortin-1 Receptor Gene(MC1R)of American Mink(Neovisonvison)

SONG Xing-chao，XU Chao，YUE Zhi-gang，WANG Lei，CONG Bo，LIU Lin-ling，YANG Fu-he*

(StateKeyLaboratoryofSpecialEconomicAnimalMolecularBiology，InstituteofSpecialAnimalandPlantSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China)

In order to explore the sequence structure ofMC1R gene and its regulating mechanism on coat color of American mink.One pair special primer was designed according to theMC1R gene ofMustelalutreola(Accession No.：AB189820) published in GenBank.The complete coding sequence(1 324 bp) ofMC1R gene were obtained by PCR and cloning technique from the blood total DNA ofNeovisonvison，then the structural characteristics of nucleotide and amino acid sequence were predicted and analyzed by bioinformatics method.The results showed that the sequence of American minkMC1R gene consisted of one single exon，partial of 5′UTR(188 bp) and 3′UTR(182 bp)，and it contained an open reading frame of 954 bp，which encoded 317 amino acids.The estimated molecular weight ofMC1R protein was 34.49 ku，with a isoelectric point of 8.97 and 36.63 in instability index，belonging to the weakly stable basic protein.Further structure prediction indicated that theMC1R protein had one simple domain，7 transmembrane domains and no signal peptide at N-terminal，it was located on plasma membrane.The similarity comparison and phylogenetic tree indicated that the evolution distance of American minkMC1R was the most homogeneous toMustelalutreola(95%) belong to Mustelidae family.Identification and sequence analysis of American minkMC1R gene would lay the bioinformatics foundation for further investigating correlations between polymorphisms ofMC1R gene and coat color phenotype in mink.

American mink；MC1R gene；coat color；transmembrane domain；bioinformatics

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.010

2014-07-11

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃-973項(xiàng)目(2012CB722907)；水貂優(yōu)良種質(zhì)資源及選育技術(shù)引進(jìn)-948項(xiàng)目(2014-Z8)

宋興超(1982-)，男，河北保定人，博士生，助理研究員，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：songxingchao@caas.cn

*通信作者：楊福合，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種質(zhì)資源收集、評(píng)價(jià)及遺傳育種研究，E-mail：yangfh@126.com

S865.22

A

0366-6964(2015)05-0752-08