細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4增強傳染性法氏囊病病毒VP2質(zhì)粒DNA的免疫效應分析

王永娟，朱善元，李碧春，胡 成，左偉勇*

(1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，揚州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，泰州 225300)

細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4增強傳染性法氏囊病病毒VP2質(zhì)粒DNA的免疫效應分析

王永娟1，2，朱善元2，李碧春1，胡 成2，左偉勇2*

(1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，揚州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，泰州 225300)

為評價分子佐劑細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)對IBDV VP2質(zhì)粒DNA的免疫增強作用，試驗采用重組質(zhì)粒載體表達重組蛋白mLTA-VP2-CTLA-4和mLTA-CTLA-4，家兔毒性試驗確定其安全性，后選擇10日齡非免疫健康雞進行隨機分組試驗，設不同劑量mLTA-CTLA-4加IBD活疫苗免疫組、不同劑量mLTA-VP2-CTLA-4免疫組、IBD活疫苗免疫組及空白對照組，免疫后用ELISA法定期檢測雞血清抗體IgG及小腸黏膜抗體IgA效價；雞在加強免疫后用IBDV野生毒株攻擊，連續(xù)觀察2周并計算保護率。結(jié)果顯示，mLTA-VP2-CTLA-4免疫組、mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫組產(chǎn)生的IgG和IgA抗體水平與活疫苗免疫組無明顯差別，mLTA-CTLA-4加活疫苗共同免疫組產(chǎn)生的IgG和IgA抗體水平略高于mLTA-VP2-CTLA-4免疫組，疫苗對雞的保護率為100%。結(jié)果表明，構(gòu)建的IBDV分子佐劑DNA疫苗載體能表達無毒性的重組蛋白質(zhì)，并能產(chǎn)生很好的免疫保護率，為進一步研究IBD亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

傳染性法氏囊??；分子佐劑；細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4；VP2；DNA疫苗

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的以破壞雞的中樞免疫器官法氏囊為主，能導致雞不同程度的病理變化、死亡和免疫抑制的高度接觸性傳染病[1-2]。目前，免疫接種仍是預防IBD的主要措施，但普遍使用的中等毒力活疫苗存在誘發(fā)法氏囊細胞凋亡和免疫抑制等缺點，加之變異毒株的出現(xiàn)使其預防效果有逐漸下降的趨勢，因此迫切需要開展IBD預防新策略的研究[3]。

當前對流感病毒等易變病原的“通用疫苗”研究所取得的進展為新型IBD疫苗研制提供了借鑒[4-5]。LT是產(chǎn)毒性大腸埃希菌產(chǎn)生的一種不耐熱腸毒素，具有很強的黏膜免疫佐劑活性，經(jīng)過基因定點突變后的LT不僅沒有毒性而且仍然保持了良好的黏膜免疫佐劑活性[6-8]。細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)屬于免疫球蛋白超家族成員，是活化T細胞表面的一種跨膜糖蛋白分子，而CTLA-4胞外區(qū)能與抗原遞呈細胞上的B7配體結(jié)合[9]。因此，用CTLA-4胞外區(qū)融合抗原免疫動物，作為抗原提呈細胞的靶向?qū)敕肿雍托滦兔庖咦魟粌H能誘導體液免疫應答，還能誘導細胞免疫應答[10，11]。VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，攜帶了病毒主要的中和性抗原表位[12]，能誘導宿主產(chǎn)生IBDV的中和性抗體，從而保護易感雞免受IBDV的感染[13]。本研究將IBDV VP2蛋白、大腸桿菌LT去毒突變體(mLT)及雞CTLA-4胞外區(qū)進行重組，制備IBDV分子佐劑DNA疫苗，為IBD的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

載體pET-mLTA-CTLA-4(BL21)、載體pET-mLTA-VP2-CTLA-4(BL21)、雞抗LT血清、雞抗VP2血清由本實驗室保存；純化的腸毒素LT蛋白由揚州大學孫懷昌教授惠贈；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素、卡那霉素、甘油購自美國Sigma公司；尿素購自上海生工生物工程有限公司；雙甲酰丙烯酰胺購自美國Promega公司；過硫酸銨和溶菌酶為AMRESCO產(chǎn)品分裝；抗雞IgG和IgA酶標抗體為英國Abcam公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純級。

1日齡非免疫健康雛雞(雌雄隨機)購自江蘇省家禽科學研究所；2月齡健康家兔購自揚州大學比較醫(yī)學中心；IBDV中等毒力活疫苗(NF8 株)購自揚州威克生物工程有限公司；IBDV野生毒株(LYG)由本實驗室分離保存。

1.2 重組蛋白質(zhì)的表達、鑒定與純化

將重組菌pET-mLTA-CTLA-4和pET-mLTA-VP2-CTLA-4按文獻 [14]方法用1 mmol·L-1IPTG誘導培養(yǎng)并收獲細菌，同時設pET-32a空載體為陰性對照。超聲裂解收獲的細菌，上清和沉淀分別于12% SDS-PAGE膠中分析鑒定。分別以雞抗LT血清、雞抗VP2血清為一抗，酶標兔抗雞IgG為二抗，進行Western blotting分析，DAB顯色分析結(jié)果。

1.3 重組蛋白質(zhì)安全性評價

選取3月齡家兔，參考文獻[15]方法進行，家兔禁食24 h后無菌選擇回腸袢，沿回盲部向上4～6 cm處開始結(jié)扎，共結(jié)扎7段，每段5 cm，每兩段之間間隔5 cm，每段腸管均注入0.5 mL樣品，并標記順序，樣品注射量見表1。繼續(xù)禁食24 h后處死，觀察回腸袢外觀，抽取每段腸管內(nèi)的液體，做計量比較。

1.4 動物免疫試驗

將400只1日齡非免疫健康雛雞飼養(yǎng)于清潔環(huán)境中，飼養(yǎng)觀察10 d，隨機分成8組(50只·組-1)，IBD中等毒力活疫苗+ mLTA-CTLA-4免疫組(第1～3組)，mLTA-VP2-CTLA-4免疫組(第4～6組)，IBD中等毒力活疫苗+生理鹽水免疫組(第7組)，生理鹽水免疫組(第8組)。重組蛋白質(zhì)的免疫劑量分別為10、50、100 μg·只-1，免疫途徑為肌肉注射， IBD中等毒力活疫苗的免疫途徑為口服。動物每2周免疫一次，共免疫3次，三免后按首免劑量加強免疫一次。

表1 注入樣品種類及數(shù)量

Table 1 Different sample and content in each loop

編號No.樣品種類Smple蛋白質(zhì)含量/μgContent體積/mLVolume1生理鹽水0.00.52LT0.10.53LT1.00.54LT5.00.55mLTA-CTLA-45.00.56mLTA-CTLA-410.00.57mLTA-CTLA-450.00.5

1.5 檢測樣品準備

在每次免疫后第3天，隨機從各組選取10只，斷食不斷水，24 h后處死，分別采集血液、收集小腸樣品。血液于37 ℃靜置2 h后，3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清制得血清，-20 ℃保存?zhèn)錂z。刮取約15 cm長小腸的黏液，盛放于事先校零過的空指形管，稱重后生理鹽水稀釋，小量分裝，-20 ℃保存?zhèn)錂z。同時設免疫前血清樣及小腸黏膜樣為陰性對照。

1.6 抗原及樣品最佳濃度確定

以橫排作抗原(含IBDV的尿囊液20 μL)倍比稀釋，縱列作血清或小腸黏液樣品倍比稀釋(起始濃度為100倍稀釋的檢測樣品)，分別選擇HRP標記兔抗雞IgG或IgA為二抗，按間接ELISA操作步驟進行方陣試驗。結(jié)果以抗體稀釋倍數(shù)為橫坐標，A450 nm值為縱坐標作曲線，考察不同包被抗原濃度曲線的平滑度。以A450 nm值為1.0左右對應的抗原濃度作為最佳包被濃度，抗體稀釋倍數(shù)為最佳稀釋倍數(shù)。

1.7 抗體的ELISA效價測定及分析

以方陣試驗確定的抗原濃度包被ELISA反應板，1∶10 000稀釋的HRP標記的雞IgG或IgA為二抗，按間接ELISA操作步驟，測定待檢樣品的A450 nm值。以免疫次數(shù)為橫坐標、A450 nm值為縱坐標作折線圖，比較不同免疫組的IgG和IgA變化規(guī)律。

1.8 動物保護性試驗

雞加強免疫后第3天，用100LD50的IBDV野生毒株分別感染第1、4、7、8組中剩余的10只雞，單獨飼養(yǎng)觀察2周后全部撲殺。以觀察到雞精神抑郁、反應遲鈍、羽毛雜亂、腹瀉、顫抖、極度虛弱，剖解見法氏囊及腎病變、腿肌和胸肌出血、腺胃和肌胃交界處條狀出血為標準判斷發(fā)病情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白質(zhì)的表達及鑒定

重組菌pET-mLTA-CTLA-4和pET-mLTA-VP2-CTLA-4在不同溫度、不同時間及不同誘導劑濃度培養(yǎng)后，確定以37 ℃、1 mmol·L-1IPTG、誘導4 h為最佳誘導條件。誘導產(chǎn)物SDS-PAGE分析顯示，與空載體相比，在42.5、92 ku處出現(xiàn)了預期大小的融合蛋白質(zhì)，并以包涵體形式存在(圖1、2)。

Western blotting檢測結(jié)果顯示(圖3)，在42.5、92 ku處有特異性雜交信號存在，證明表達的蛋白質(zhì)確為mLTA-CTLA-4和mLTA-VP2-CTLA-4，且具有反應原性。

2.2 重組蛋白質(zhì)安全性評價

家兔安全性評價試驗顯示，第1段腸腔外觀無異常，腸腔內(nèi)幾乎無液體，第2、3、4段腸腔均充血水腫，腸腔內(nèi)有8～9 mL積液；第5、6、7段腸腔外觀無異常，腸腔內(nèi)幾乎無液體；對照組和試驗組動物在試驗期內(nèi)，均未觀察到精神、行為、采食和生產(chǎn)性能的變化，亦未發(fā)生傳染性法氏囊病。表明表達的重組蛋白質(zhì)安全無毒性。

2.3 抗原及樣品的最佳濃度確定

通過觀察以間接ELISA的A450 nm值為縱坐標、抗體稀釋倍數(shù)為橫坐標制作的曲線，考察不同包被抗原濃度曲線的平滑度，確定A450 nm值為1.0左右時對應的IBDV尿囊液進行1∶128倍稀釋為最佳包被濃度，血清樣品進行200倍稀釋，小腸黏膜樣品進行400倍稀釋。

2.4 血清中IgG的檢測及其變化規(guī)律

以免疫次數(shù)為橫坐標、各免疫組IgG 的A450 nm值為縱坐標作折線圖，試驗數(shù)據(jù)如圖4所示， mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫組、mLTA-VP2-CTLA-4免疫組，分別與單獨使用IBD疫苗免疫組相比，產(chǎn)生的血清IgG水平相當；而mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫組與mLTA-VP2-CTLA-4免疫組相比，產(chǎn)生的特異性抗體IgG水平略占優(yōu)勢；不同劑量的重組蛋白質(zhì)免疫時，以10 μg·只-1的效果為最佳，且免疫效果在短期內(nèi)有逐漸增強的趨勢。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.pET30a 30 ℃誘導裂解物；2.pET-mLTA-CTLA-4 30 ℃誘導裂解物；3.pET-mLTA-CTLA-4 37 ℃誘導裂解物；4.pET30a 30 ℃誘導表達產(chǎn)物上清；5.pET-mLTA-CTLA-4 30 ℃誘導表達產(chǎn)物上清；6.pET-mLTA-CTLA-4 37 ℃誘導表達產(chǎn)物上清M. Protein molecular weight marker (Broad); 1. Lysate of pET30a induced expression products at 30 ℃; 2. Lysate of pET-mLTA-CTLA-4 induced expression products at 30 ℃; 3. Lysate of pET-mLTA-CTLA-4 induced expression products at 37 ℃; 4. Supernatant of IPTG-induced pET30a transformant at 30 ℃; 5. Supernatant of IPTG-induced pET-mLTA-CTLA-4 transformant at 30 ℃;6. Supernatant of IPTG-induced pET-mLTA-CTLA-4 transformant at 37 ℃圖1 重組菌pET-mLTA-CTLA-4的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant pET-mLTA-CTLA-4

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1. pET-mLTA-VP2-CTLA-4 37 ℃誘導裂解物；2. pET-mLTA-VP2-CTLA-4誘導表達產(chǎn)物上清；3. pET30a 37 ℃誘導表達產(chǎn)物上清；4. pET30a 37 ℃誘導裂解物；5. pET-mLTA-CTLA-4 37 ℃誘導表達產(chǎn)物上清； 6. pET-mLTA-CTLA-4誘導裂解物M.Protein molecular weight marker(Broad); 1. Lysate of pET-mLTA-VP2-CTLA-4 induced expression products at 37 ℃; 2. Supernatant of IPTG-induced pET-mLTA-VP2-CTLA-4 transformant at 37 ℃; 3. Supernatant of IPTG-induced pET30a transformant at 37 ℃; 4. Lysate of pET30a induced expression products at 37 ℃; 5: Supernatant of IPTG-induced pET-mLTA-CTLA-4 transformant at 37 ℃; 6. Lysate of pET-mLTA-CTLA-4 induced expression products at 37 ℃圖2 重組菌pET-mLTA-VP2-CTLA-4的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant pET-mLTA-VP2-CTLA-4

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準; 1.純化的mLTA-VP2-CTLA-4;2.純化的mLTA-CTLA-4M.Protein molecular weight marker(Broad);1.Purified mLTA-VP2-CTLA-4;2.Purified mLTA-CTLA-4圖3 融合蛋白質(zhì)的Western blotting檢測Fig.3 Western blotting of purified fusion proteins

圖4 免疫對血清IgG的影響Fig.4 Immune effect on IgG levels

2.5 腸黏膜抗體IgA檢測及其變化規(guī)律

以免疫次數(shù)為橫坐標、各免疫組IgA 的A450 nm值為縱坐標作折線圖，數(shù)據(jù)如圖5所示， mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫組、mLTA-VP2-CTLA-4免疫組，分別與單獨使用IBD疫苗免疫組相比，產(chǎn)生的特異性抗體IgA水平相當；而mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫組與mLTA-VP2-CTLA-4免疫組相比，產(chǎn)生的特異性抗體IgA水平略占優(yōu)勢；同時發(fā)現(xiàn)，不同劑量的重組蛋白質(zhì)免疫時，以10 μg·只-1的效果為最佳，且免疫效果在短期內(nèi)有逐漸增強的趨勢。

2.6 動物攻毒保護效果

動物攻毒保護試驗結(jié)果如表2，mLTA-CTLA-4+IBD疫苗免疫組、疫苗單獨免疫組、mLTA-VP2-CTLA-4免疫組均未見發(fā)病及死亡情況，空白對照組發(fā)病10例、死亡1例。

表2 攻毒后試驗雞發(fā)病及死亡情況

Table 2 Incidence and mortality of chickens challenge with IBDV

免疫組Immunegroup發(fā)病數(shù)/總數(shù)No.ofonset/Total死亡數(shù)/總數(shù)No.ofdeaths/Total保護率/%Protectionrate10/100/1010040/100/1010070/100/10100810/101/100

圖5 免疫對小腸黏膜IgA的影響Fig.5 Immune effect on intestinal mucosal IgA levels

3 討 論

CTLA-4作為抗原遞呈細胞上B7配體的結(jié)合位點，能夠特異性地提呈免疫原，發(fā)揮抗原濃縮和靶向?qū)氲淖饔谩Ｒ虼?，以CTLA-4作為免疫佐劑時，B細胞僅需很小劑量的抗原刺激就能完成識別、活化、增殖、分化的過程，最后產(chǎn)生并分泌特異性抗體IgG，IgG可以有效中和體液中游離的病毒，從而減少對細胞的損傷，發(fā)揮抗病毒的作用[16]。從動物試驗結(jié)果看，以低劑量10 μg·只-1免疫組的免疫效果為最佳，表明了CTLA-4抗原提呈的有效性與高效性。

腸道黏膜表面是機體與外界接觸最多的部位，亦是大量病原微生物入侵機體的重要門戶。LT是產(chǎn)毒性大腸埃希菌產(chǎn)生的一種不耐熱腸毒素，具有很強的免疫原性和黏膜免疫佐劑活性。經(jīng)過基因定點突變后的LT失去了毒性作用，但仍然保持了良好的黏膜佐劑活性[17-18]。在進行安全性評價時，mLTA-CTLA-4的注射量換算成mLTA單體后亦遠遠大于LT的注射量，但仍未表現(xiàn)出毒性作用，這說明LT的無毒突變?nèi)〉贸晒?，且安全范圍較廣，即使mLTA-CTLA-4劑量增加數(shù)倍，也對機體沒有損害。從動物試驗結(jié)果看，mLTA-CTLA-4作為免疫佐劑對IBD活疫苗起到了免疫增強作用，表明載體pET-mLTA-CTLA-4可作為其他雞相關(guān)病毒抗原表達的通用載體，與預期結(jié)果相吻合。

動物試驗結(jié)果顯示，重組蛋白mLTA-VP2-CTLA-4可誘導免疫雞產(chǎn)生特異性IgG和IgA，但產(chǎn)生的IgA和IgG抗體水平低于mLTA-CTLA-4+IBD活疫苗免疫組，推測是由于活疫苗接種動物類似于機體產(chǎn)生一次輕型的自然發(fā)病過程，病毒在體內(nèi)的作用時間長于DNA疫苗造成的。從保護力看，相同劑量mLTA-CTLA-4+IBD活疫苗免疫組與mLTA-VP2-CTLA-4免疫組對雞的保護力均為100%，這將為用重組亞單位疫苗替代傳統(tǒng)活疫苗，以“不變應萬變”的免疫方案奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了具有免疫佐劑作用的通用載體pET-mLTA-CTLA-4，制備了基于IBDV VP2蛋白的分子佐劑DNA疫苗載體，證實了CTLA-4對IBDV VP2質(zhì)粒DNA的免疫增強作用，為進一步研究IBD亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

Analysis of Immune Enhancement of Molecular Adjuvant CTLA-4 on IBDV VP2 Plasmid DNA

WANG Yong-juan1，2，ZHU Shan-yuan2，LI Bi-chun1，HU Cheng2，ZUO Wei-yong2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China； 2.JiangsuProvincialKeyLaboratoryofVeterinaryBio-pharmaceuticalHigh-techResearch，JiangsuAnimalHusbandryandVeterinaryCollege，Taizhou225300，China)

The study was conducted to evaluate the immune enhancement of molecular adjuvant CTLA-4 on IBDV VP2 plasmid DNA.Fusion protein mLTA-CTLA-4 and mLTA-VP2-CTLA-4 were expressed and purified based on vector pET-mLTA-CTLA-4 and pET-mLTA-VP2-CTLA-4.Protein toxicity tests were carried out on rabbits.10-day-old chickens were randomly divided into four groups，including different doses of mLTA-CTLA-4 plus IBD vaccine groups，different doses of mLTA-VP2-CTLA-4 groups，IBD live vaccine groups and control groups.Serum and mucosal samples were regularly collected for neutralization titer of IgG and IgA.After booster immunization，chickens were attacked by wild IBDV strain，and two weeks later protection rate were calculated.The results showed that levels of IgG and IgA in mLTA-VP2-CTLA-4 groups，mLTA-CTLA-4 with IBDV vaccine groups and conventional IBDV vaccine groups had no significant difference.IgG and IgA levels in mLTA-CTLA-4 with IBDV vaccine groups were slightly higher than that of mLTA-VP2-CTLA-4 groups.The protection rate was 100%.The results indicate that constructed IBDV molecular adjuvant DNA vaccine vector can express non-toxic recombinant protein，which can produce a good immune efficiency in chickens.It lays a foundation for further study on IBD subunit vaccine.

infectious bursal disease；molecular adjuvant；cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4；VP2；DNA vaccine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.019

2014-08-27

江蘇省博士后科研資助計劃(1401077B)；博士后日常資助項目；江蘇農(nóng)牧科技學院“鳳凰人才工程”項目；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院重點支持項目(NSFZD1405；NSFZD1305)；揚州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司橫向合作課題(00010114012)；江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室開放課題(JSKLKF1403)

王永娟(1980-)，女，江蘇海門人，博士，副教授，主要從事生物工程技術(shù)研究，E-mail：43088591@qq.com

*通信作者：左偉勇(1978-)，男，山東泰安人，博士，教授，主要從事生物工程技術(shù)研究，E-mail:979490023@qq.com

S852.52

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0366-6964(2015)05-0824-06