關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子真核表達載體的構(gòu)建及其在小鼠C2C12細胞中的表達

桓聰聰，許厚強，陳 偉，陳 祥，趙佳福，張 雯，周 迪，夏 丹

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室/貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025)

關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子真核表達載體的構(gòu)建及其在小鼠C2C12細胞中的表達

桓聰聰1，2，許厚強2*，陳 偉1，2，陳 祥2，趙佳福2，張 雯2，周 迪2，夏 丹2

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室/貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025)

本研究旨在探究關(guān)嶺牛4個不同長度的MyoDI啟動子的啟動活性，初步確定該基因核心啟動子位置。采用實時熒光定量PCR技術(shù)對關(guān)嶺牛不同組織中MyoDI基因的相對表達量進行檢測。以關(guān)嶺牛血液DNA為模板，設(shè)計5'端加磷的引物，PCR擴增獲得4個不同長度的關(guān)嶺牛MyoDI啟動子，定向精確替換pEGFP-N3載體的CMV啟動子區(qū)，構(gòu)建重組真核表達載體pEGFP-N3-MyoDI。利用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細胞，依據(jù)小鼠C2C12細胞發(fā)光的強弱判斷MyoDI啟動子的啟動活性。結(jié)果顯示，MyoDI基因在關(guān)嶺牛肌肉組織中表達量較高；目的片段成功替換pEGFP-N3載體的CMV區(qū)；重組質(zhì)粒能在小鼠C2C12細胞中成功表達，細胞在激發(fā)光下發(fā)綠色熒光。本研究成功構(gòu)建了重組真核表達載體pEGFP-N3-MyoDI，4個啟動子均具有啟動活性，其中P3啟動子在小鼠C2C12細胞中表達量最高，初步推斷P3啟動子為該基因的核心啟動子。

MyoDI；真核表達載體；C2C12細胞；啟動子；基因表達量

啟動子是位于基因5′端上游轉(zhuǎn)錄起始位點附近的一段DNA序列，根據(jù)基因表達情況，可分為組成型啟動子和特異性啟動子，前者在各種組織中均能啟動基因表達，后者僅在一定發(fā)育時期的特定組織中啟動基因表達，肌肉特異性啟動子在肌肉組織內(nèi)能夠高效地表達外源基因，但在非肌肉組織內(nèi)的啟動效率很低[1-2]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對肌肉特異性啟動子的轉(zhuǎn)錄活性及其對肌肉細胞增殖和分化的作用進行了深入研究[3]，但是由于肌肉細胞的分化特性和多種肌肉特異性啟動子只在終末分化的肌肉細胞內(nèi)才能啟動基因表達，所以在體外培養(yǎng)的肌源性干細胞內(nèi)的啟動效率很低，給肌肉機理研究帶來困難[4-5]。

生肌調(diào)節(jié)因子家族(Myogenic regulatory factors，MRFs)，也稱生肌決定因子家族(MDFS)，骨骼肌表達的生肌調(diào)節(jié)因子稱為MyoD基因家族[6]。MyoD基因家族包括4種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的基因：MyoDI、MyoG、Myf5和MRF4[7-8]，它們對生肌發(fā)生起重要調(diào)節(jié)作用，可使成纖維細胞、成軟骨細胞和平滑肌細胞向骨骼肌細胞分化，影響家畜肌肉的生長。這些基因編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)蛋白，通過調(diào)節(jié)肌肉分化階段特異性蛋白的表達來參與肌細胞定向和分化。Myf5和MyoDI在成肌細胞增殖過程中表達，Myf5基因所起的作用基本能夠被MyoDI基因替代，二者的功能有許多相似的特征[9-11]。MRFs家族成員的表達時間和功能特點對于骨骼肌的發(fā)生、分化和成熟起著重要作用。MyoDI和Myf5基因主要在骨骼肌發(fā)育早期的肌前體細胞向成肌細胞分化的過程中發(fā)揮作用，而MyoG和MRF4基因主要在骨骼肌發(fā)育晚期的成肌細胞向終末骨骼肌纖維細胞分化的過程中發(fā)揮作用[12-15]。

MyoDI(Myogenic differentiation Ⅰ)基因啟動子為組織特異性啟動子[16]，是骨骼肌生長發(fā)育過程中重要的正調(diào)控基因。在形成肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，MyoDI起著總開關(guān)的作用，可以結(jié)合到肌細胞生成素、肌酸激酶CK、肌球蛋白、結(jié)蛋白等基因啟動子區(qū)發(fā)揮重要調(diào)控作用，促進它們的轉(zhuǎn)錄激活[17-18]。肌分化因子MyoD原名MyoDI，1987年被首次克隆[19]?，F(xiàn)已知牛的MyoDI位于15號染色體，為2 648 bp，有3個外顯子。MyoDI基因產(chǎn)物參與多種分化細胞向肌細胞轉(zhuǎn)化，可影響肌肉結(jié)構(gòu)的表達。近年來，MyoDI基因已經(jīng)成為動物肉質(zhì)改良育種的重要研究部分[20-21]。目前在國內(nèi)外，該基因在小鼠、雞和豬肌細胞生成的表達調(diào)控機制方面報道較多；在牛方面主要集中在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的研究，而對MyoDI基因的表達調(diào)控和MyoDI基因啟動子的功能和調(diào)控方面的研究較少[22]。田璐等在3個黃牛品種及4個雜交肉牛群體MyoD基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)其顯著影響肉牛多個肉質(zhì)性狀[23]，由此可見，研究MyoDI基因啟動子有著十分重要的意義。李飛等已經(jīng)證實MyoDI基因啟動子為肌肉組織特異性啟動子[24]，但對MyoDI基因啟動子的活性以及核心啟動子位置并沒有進行詳細的研究。

本研究采用熒光定量PCR技術(shù)(QRT-PCR)對MyoDI基因進行了差異表達分析；克隆關(guān)嶺牛MyoDI基因4段啟動子區(qū)，成功構(gòu)建pEGFP-N3-MyoDI真核表達載體；通過轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細胞，觀察C2C12細胞的熒光強度進一步確定MyoDI基因啟動子的活性及核心啟動子位置，同時為進一步構(gòu)建MyoDI啟動子轉(zhuǎn)基因小鼠模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliDH5α感受態(tài)細胞、TransStart?Green qPCR SuperMix UDG、TransStart?One-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、血液基因組DNA提取試劑盒、柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；真核表達載體pEGFP-N3、限制性內(nèi)切酶SacI、Hind III、T4DNA連接酶、DNA marker均購于TaKaRa公司；高保真DNA聚合酶，dNTP購于鼎國公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司；二甲基亞砜、胰酶購自Sigma公司；C2C12細胞系購自中科院上海細胞庫。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 采集同一頭關(guān)嶺牛背最長肌、小腸、肝、大腿肌、心、脂肪組織，將新鮮的組織置于液氮中，保存于-80 ℃低溫冰箱中。利用Trizol法對不同組織樣品的總RNA進行提取，并用微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。按照TransStart?One-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。RNA模板1 μL，Random Primer 1 μL，gDNA Remove 1 μL，TransScriptTMRT Mix 1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，補加RNase-free水到10 μL。25 ℃孵育10 min后，42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min。-20 ℃保存，進行后續(xù)的熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.2 實時熒光定量PCR 參照NCBI中牛β-actin(AY152693)和MyoDI(NM_001040478)基因序列，結(jié)合Primier5.0和Oligo軟件進行分析設(shè)計特異性qRT-RCR引物(表1)，引物由上海生工合成。

實時熒光定量PCR采用10 μL反應(yīng)體系，采用Bio-rad iQ5 伯樂熒光定量PCR儀進行定量分析。每個樣品不同基因的表達均以β-actin為對照，每個樣品檢測做3個平行試驗。擴增反應(yīng)結(jié)束后由熔解曲線判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)標準曲線以及Ct值計算定量結(jié)果。

表1 熒光定量PCR擴增引物序列及參數(shù)

Table 1 Primer sequences and parameters used for real-time quantitative PCR

名稱Name引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature片段長度/bpFragmentsizeMyoDIS:GCTACTTCGCGACCAGGACA:CGCTGTAGTCCATCATGCCGT50.7158β-actinS:GCAGGTCATCACCATCGGA:GCTGTCACCTTCACCGTTC58.3564

S.上游引物；A．下游引物

S．Sense；A．Antisense

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 SPSS18.0計算重復(fù)樣品間Ct均值及標準偏差，采用2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)，分析MyoDI基因在不同組織中的差異表達量[25]。首先計算各組織樣的目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，即△Ct= Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，然后計算各組織樣△Ct平均值，選取小腸做對照，用其他組織樣減去小腸組織樣的△Ct，即為比較的Ct(△△Ct)；2-△△Ct表示試驗?zāi)康幕虻谋磉_相對于對照組變化的倍數(shù)[26]。

1.2.4 PCR擴增MyoDI啟動子區(qū) 根據(jù)GenBank中公布的牛MyoDI(GenBank No.：281938)基因序列，用FIRSTEF程序(http：//rμlai.cshl.org/tools/FirstEF/)進行啟動子預(yù)測，另外結(jié)合實驗室前期的工作結(jié)果，用Primer5.0設(shè)計4對5′端加磷的引物(表2)，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。以關(guān)嶺牛血液DNA為模板擴增MyoDI啟動子P1～P4片段，擴增體系20 μL。PCR條件(表2)：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，退火30 s；72 ℃延伸；循環(huán)35次；72 ℃延伸2 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 PCR擴增不含CMV區(qū)的pEGFP-N3載體片段 以pEGFP-N3質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。上游引物：5′-GCTAGCGCTACCGGACTCA-GAT-3′，下游引物：5′-ATTAATAACTAATGCA-TGGCGG-3′，總反應(yīng)體系為20 μL。擴增條件：98 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性10 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，10個循環(huán)； 98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表2 用于PCR擴增的引物信息

Table 2 Information of primers for PCR

名稱Name引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature延伸時間/sExtensiontime片段長度/bpFragmentssizeP1(-1895～+557bp)S:ACCTCCCGACATCATACATTA:GGTTTGGGTTGCTAGACG55802452P2(-976～+17bp)S:GTGGAGTTCCGCTTGTTGA:CTCCCCACCCCTACTTTC6035993P3(-420～+17bp)S:CTCCCTGATTCGGTAGATCA:CTCCCCACCCCTACTTTC5116437P4(-108～+17bp)S:CTCCCTGCTCTGTTCCTATTA:CTCCCCACCCCTACTTTC567125

S．上游引物；A．下游引物

S．Sense；A．Antisense

1.2.6MyoDI啟動子與pEGFP-N3片段的連接及轉(zhuǎn)化 將PCR獲得的不同DNA片段分別用膠回收試劑盒回收純化。將4段不同長度的MyoDI啟動子片段分別與不含CMV區(qū)的pEGFP-N3片段平末端連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至預(yù)先用CaCl2法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，均勻涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，靜置1 h，再倒置培養(yǎng)16～24 h。

1.2.7 菌落PCR鑒定和重組質(zhì)粒PCR鑒定 將含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上長出的陽性克隆菌落編號，再選取這些陽性菌落進行菌落PCR。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

選取電泳中和陽性對照有一致條帶的陽性菌落接種到含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。用提取的重組質(zhì)粒作為模板，進行重組質(zhì)粒PCR。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.2.8 重組質(zhì)粒的酶切及測序鑒定 選取只能擴增出和陽性對照有一致條帶的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Hind III酶切驗證片段連接的順序。酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將同一陽性克隆的質(zhì)粒送至上海英駿公司測序。

1.2.9 C2C12細胞的培養(yǎng)和重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)C2C12細胞。待C2C12細胞貼壁后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化更換新的培養(yǎng)基。取處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI和對照空質(zhì)粒pEGFP-N3，每個樣品重復(fù)3孔。轉(zhuǎn)染具體步驟：轉(zhuǎn)染前1 d將小鼠C2C12細胞接種至24孔板中，1×105個·孔-1，使細胞達到90%～95%。用50 μL Opti-MEM稀釋重組質(zhì)粒DNA，輕輕混合，取2 μL LipofectamineTM2000用50 μL Opti-MEM稀釋，輕輕混合，室溫孵育5 min；將50 μL LipofectamineTM2000混合物加入重組質(zhì)?；旌衔镏?，總體積為100 μL，輕輕混合，室溫孵育20 min；將100 μL DNA-LipofectamineTM2000混合物加入24孔板中，輕輕混勻，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24 h，將培養(yǎng)板置于尼康熒光倒置顯微鏡下，在藍色濾鏡下用445～490 nm的激發(fā)光光源觀察C2C12細胞有無表達的發(fā)綠色熒光的GFP物質(zhì)[27]。

2 結(jié) 果

2.1 實時熒光定量PCR產(chǎn)物特異性分析

由圖1可見，β-actin和MyoDI基因擴增曲線均呈現(xiàn)“S”形，說明β-actin和MyoDI基因的動力學(xué)曲線整體平行性較好，曲線拐點清晰，基線平而無明顯上揚趨勢。由圖2可見，熔解曲線圖顯示梯度模板熔解曲線集中。熔解曲線上只有一個明顯的峰，表明在實時熒光定量PCR過程中，熒光強度均來自于特異性的擴增產(chǎn)物，目的基因及內(nèi)參基因沒有產(chǎn)生非特異性擴增及引物二聚體，引物特異性好。

2.2MyoDI基因在關(guān)嶺牛不同組織中的qRT-PCR分析

結(jié)果顯示，MyoDImRNA在所檢測的6個組織樣中均有表達，且以小腸為對照，背最長肌中表達量最高，小腸中表達量最低(圖3)。

圖1 β-actin和MyoD I基因的擴增曲線Fig.1 The amplification curve of β-actin and MyoD I genes

圖2 β-actin和MyoD I基因的熔解曲線Fig.2 The melting curve of β-actin and MyoD I genes

1.小腸；2.脂肪；3.肝；4.大腿??；5.心；6.背最長肌1.Small intestine；2.Fat；3.Liver；4.Muscle of thigh；5.Heart；6.Longissimus dorsi圖3 MyoD I mRNA 在關(guān)嶺牛不同組織中的表達Fig.3 The expressing level of MyoD I gene in different tissues in Guanling cattle

2.3MyoDI基因啟動子片段的擴增

以提取的血液DNA為模板，將PCR擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，分別在2 452、993、437和125 bp處出現(xiàn)條帶，與目的條帶大小一致(圖4)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1、2、3、4.P1、P2、P3、P4 PCR產(chǎn)物M.Marker 15000；1，2，3，4.The PCR products of P1，P2，P3，P4圖4 不同長度MyoD I啟動子片段PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR product of MyoD I promoters with different length

2.4 擴增不含CMV區(qū)的pEGFP-N3載體片段

以搖菌提質(zhì)粒獲得的pEGFP-N3質(zhì)粒為模板進行PCR擴增獲得不含啟動子區(qū)的pEGFP-N3載體片段，獲得的凝膠條帶與目的條帶一致(圖5)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1、2.pEGFP-N3載體目的條帶M.Marker15000；1，2.The target fragments of pEGFP-N3圖5 不含啟動子區(qū)的pEGFP-N3載體片段PCR產(chǎn)物Fig.5 PCR product of pEGFP-N3 vector without promoter region

2.5 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI的PCR鑒定

選取陽性重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增出2 452、993、437和125 bp片段與陽性對照獲得的P1、P2、P3、P4片段一致，而陰性對照則沒有目的片段出現(xiàn)。試驗結(jié)果(圖6)和預(yù)期的一致。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1、2、3、4.P1～P4重組質(zhì)粒PCR鑒定M.Marker5000；1，2，3，4.PCR identification of P1-P4 reconstructed plasmid圖6 重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.6 Identification of PCR product of reconstructed plasmid

2.6 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI酶切和測序鑒定

目的片段和質(zhì)粒片段是平末端連接，酶切可以驗證目的片段插入的順序。重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P1和pEGFP-N3-P2分別在目的片段和質(zhì)粒片段上有兩個Hind III酶切位點，重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P1經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III酶切，可以獲得大小約1.4 和5.3 kb的條帶(圖7)；重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P2經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III酶切可以獲得大小約776 bp和4.3 kb的條帶。重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P3、pEGFP-N3-P4只在質(zhì)粒片段有一個Hind III酶切位點，重組質(zhì)粒pEGFP-N3-P3、pEGFP-N3-P4經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III酶切可分別得到大小約4.6和4.2 kb的條帶。結(jié)果證明，P1、P2片段已經(jīng)以正確的順序成功替換真核表達載體pEGFP-N3的CMV區(qū)；P3、P4片段成功替換真核表達載體pEGFP-N3的CMV區(qū)(圖8)，但插入順序還需要通過測序進一步驗證。將英駿公司測序結(jié)果與NCBI中的序列進行比對，吻合度達到99%以上，表明4個不同的重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI構(gòu)建成功。

M.Marker5000；1.pEGFP-N3-P1；2.pEGFP-N3-P2；3.pEGFP-N3-P3；4.pEGFP-N3-P4圖7 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.7 Identification of restriction analysis of reconstructed plasmid

2.7 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI在小鼠C2C12細胞中的表達

重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI和質(zhì)粒pEGFP-N3轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細胞30 h后熒光達到最大值，用熒光倒置顯微鏡觀察重組質(zhì)粒在小鼠C2C12細胞中的表達情況。可見重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoDI和質(zhì)粒pEGFP-N3轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細胞，細胞熒光的表達量為pEGFP-N3>pEGFP-N3-P3>pEGFP-N3-P2>pEGFP-N3-P4>pEGFP-N3-P1，且綠色熒光蛋白在部分小鼠C2C12細胞的細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，表現(xiàn)為強綠色熒光(圖9)，推測P3可能為MyoDI基因的核心啟動子區(qū)。

3 討 論

生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族是控制骨骼肌生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。生肌分化因子(MyoDⅠ)是骨骼肌生長發(fā)育過程中重要的正調(diào)控基因，在肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著決定性的作用[28]。

本試驗采用qRT-PCR方法對MyoDI基因在關(guān)嶺牛大腿肌、背最長肌、小腸、心、肝、脂肪6個組織中mRNA的表達量進行了測定。研究結(jié)果表明，MyoDI基因在背最長肌中表達量最高，在心中表達量其次，在小腸中表達量最低。MyoDI基因在肌肉中表達量相對較高，與李飛等[24]證實的MyoDI基因為肌肉組織特異性基因的結(jié)論相一致。本研究選取了小鼠的成肌細胞(C2C12)為研究對象，在細胞水平上驗證MyoDI基因啟動子的功能和活性，為后續(xù)在小鼠體內(nèi)驗證啟動子的功能和活性提供基礎(chǔ)。

圖8 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MyoD I(B)與pEGFP-N3載體(A)Fig.8 pEGFP-N3-MyoD I recombinant plasmid(B) and pEGFP-N3 vectors(A)

A.pEGFP-N3-P1重組載體；B.pEGFP-N3-P2重組載體；C.pEGFP-N3-P3重組載體；D.pEGFP-N3-P4重組載體；E.pEGFP-N3載體；F.未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組A.pEGFP-N3-P1 reconstruction vector；B.pEGFP-N3-P2 reconstruction vector；C.pEGFP-N3-P3 reconstruction vector；D.pEGFP-N3-P4 reconstruction vector；E.pEGFP-N3 vector；F.Plasmid untransfected圖9 重組表達載體pEGFP-N3-MyoD I轉(zhuǎn)染30 h后小鼠C2C12細胞綠色熒光情況 200×Fig.9 The green fluorescence of pEGFP-N3-MyoD transfected into C2C12 cell 200×

由于在擴增不含CMV區(qū)的pEGFP-N3載體片段時對克隆位置要求精確，因此本研究采用高保真DNA聚合酶進行擴增，與P1、P2、P3、P4片段進行平末端連接，通過采用加磷的引物可以增加平末端連接的機率。試驗通過菌液PCR、酶切、測序的方法驗證陽性克隆子，結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的雙酶切方法相比，本方法具有不受酶切位點限制的優(yōu)勢，同時也避免引入新的酶切位點，克服了目的片段上有雙酶切位點而導(dǎo)致在內(nèi)切酶選擇上的困難。通過此種方法可以實現(xiàn)在載體的任意位置連接需要的目的片段而無需考慮酶切位點。

真核生物啟動子屬于mRNA基因啟動子，位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游，主要包括TATA-box、起始子、CAAT-box和GC-box等。TATA-box和起始子被稱為核心啟動子[29-30]，其中TATA-box是轉(zhuǎn)錄因子TFIID的TBP亞基的結(jié)合位點。本研究通過替換pEGFP-N3載體的CMV區(qū)，觀察轉(zhuǎn)染前后C2C12細胞的熒光強度，判定目的啟動子的啟動活性。結(jié)果顯示，MyoDI片段的P2、P3、P4片段均可啟動pEGFP-N3載體的EGFP熒光蛋白表達區(qū)，啟動活性為P3>P2>P4>P1。因此，推測P3可能為MyoDI基因核心啟動子區(qū)，P1和P2片段啟動活性較低可能由于含有抑制啟動子活性的區(qū)域，P4片段由于長度較短可能缺失具有啟動活性的核心區(qū)域，影響表達量。通過構(gòu)建啟動子pEGFP-N3-MyoDI真核表達載體，可為后續(xù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型提供分子學(xué)依據(jù)，為進一步驗證MyoDI基因啟動子活性與功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究分析了關(guān)嶺牛MyoDI基因在大腿肌、背最長肌、肝、脂肪、心、小腸6個組織中的表達量，克隆了4個關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)，精確替換pEGFP-N3的CMV區(qū)，構(gòu)建了重組表達載體pEGFP-N3-MyoDI，轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細胞。結(jié)果顯示，MyoDI基因在關(guān)嶺牛肌肉組織中表達量較高，推測出P3片段為MyoDI基因核心啟動子區(qū)。

[1] SALVA M Z.Design of tissue-specific regulatory cassettes for high-level rAAV-mediated expression in skeletal and cardiac muscle[J].GeneTherapy，2007，2：320-329.

[2] DU X H，GAN Q F，YUAN Z R，et al.Polymorphism ofMyoD1 andMyf6 genes and associations with carcass and meat quality traits in beef cattle[J].GenetMolRes，2013，12(4)：6708-6717.

[4] 李 碩，郝 斐，梁 浩，等.牛肌細胞生成素基因(MyoG)啟動子的活性及組織特異性分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2014，22(1)：87-93. LI S，HAO P，LIANG H，et al.Activity and tissue- specific analysis of bovine(Bos) myogenin gene(MyoG) promoter[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2014，22(1)：87-93.(in Chinese)

[6] STEFANON B，SGORLON S，GUIATTI D，et al.Association analysis between single nucleotide polymorphisms in the promoter region ofLEP，MYF6，MYOD1，OPN，SCDgenes and carcass traits in heavy pigs[J].ItaJAnimSci，2013，12(1)：13.

[7] STUPKA R，CITEK J，SPRYSL M，et al.The impact ofMYOG，MYF6 andMYOD1 genes on meat quality traits in crossbred pigs[J].AfrJBiotechnol，2012，11(88)：15405-15409.

[8] BLUM R，VETHANTHAM V，BOWMAN C，et al.Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle：the role ofMyoD1[J].GenesDev，2012，26(24)：2763-2779.

[9] HALL J K，BANKS G B，CHAMBERLAIN J S，et al.Prevention of muscle aging by myofiber-assdciated satellite cell transplantation[J].SciTranslMed，2010，2(57)：57.

[10] VAN DER MEER S F，JASPERS R T，JONES D A，et al.Time-course of changes in the myonuclear domain during denervation in young-adult and old rat gastrocnemius muscle[J].MuscleNerve，2011，43(2)：212-222.

[11] MALATESTA M，MEOLA G.Structral and function alterations of the cell nucleus in skeletal muscle wasing：the evidence in situ[J].EurJHistochem，2010，54(4)：44.

[12] ZHANG B T，YEUNG S S，LIU Y，et al.The effects of low frequency electrical stimulation on statellite on statellite cell activity in rat skeletal muscle during hindlimb suspension[J].BMCCellBiol，2010，18(11)：87.

[13] LI H，ZHU C，TAO Z，et al.MyoDandMyf6 gene expression patterns in skeletal muscle during embryonic and posthatch development in the domestic duck(Anasplatyrhynchosdomestica)[J].JAnimBreedGenet，2014，131(3)：194-201.

[14] SOUMILLION A，ERKENS J H F.Genetic variation in the porcine myogenin gene locus[J].MammGenome，1997，8：564-568.

[15] SZUHAI K，DE JONG D，LEUNG W Y，et al.Transactivating mutation of theMYOD1 gene is a frequent event in adult spindle cell rhabdomyosarcoma[J].JPathol，2014，232(3)：300-307.

[16] BOWLIN K M，EMBREE L J，GARRY M G，et al.Kbtbd5 is regulated byMyoDand restricted to the myogenic lineage[J].Differentiation，2013，86(4-5)：184-191.

[17] KOHSAKA S，SHUKLA N，AMEUR N，et al.Acetyltransferase association and histone acetylation at the MyoD1 locus during myogenic differentiation[J].FASEBJ，2014，28(1)：946.

[18] AKIZAWA Y，KANNO H，KAWAMICHI Y，et al.Enhanced expression of myogenic differentiation factors and skeletal muscle proteins in human amnion-derived cells via the forced expression ofMYOD1[J].BrainDev，2013，35(4)：349-355.

[19] BLUM R，DYNLACHT B D.The role ofMyoD1 and histone modifications in the activation of muscle enhancers[J].Epigenetics，2013，8(8)：778-784.

[20] 黃 萌，許尚忠，昝林森，等.牛MyoD1基因遺傳變異及其對胴體性狀的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34(9)：40-43. HUANG M，XU S Z，ZAN L S，et al.Polymorphism with exon 3 of the cattle MyoD1 gene and their frequencies in carcass traits[J].ChineseAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，2007，34(9)：40- 43.(in Chinese)

[21] YAO Z Z，F(xiàn)ONG A P，CAO Y，et al.Comparison of endogenous and overexpressedMyoDshows enhanced binding of physiologically bound sites[J].SkeletalMuscle，2013，3(1)：1-9.

[22] 王秋華，曹允考，李樹峰.牛MyoG基因啟動子的克隆及功能的初步分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012，43(1)：37-43. WANG Q H，CAO Y K，LI S F.Cloning and preliminary functional analysis of bovineMyoGpromoter[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2012，43(1)：37-43.(in Chinese)

[23] 田 璐，許尚忠，岳文斌，等.MyoD基因?qū)θ馀Ｍw性狀影響的分析[J].遺傳，2007，29(3)：313-318. TIAN L，XU S Z，YUE W B，et al.Relationship between genotypes at MyoD locus and carcass traits in cattle[J].Hereditas，2007，29(3)：313-318.(in Chinese)[24] 李 飛，許厚強，陳 偉，等.關(guān)嶺牛MyoD基因啟動子報告質(zhì)粒的構(gòu)建及活性驗證[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013，(4)：459-466. LI F，XU H Q，CHEN W，et al.Verification of activity and construction of the report plasmid ofMyoDI gene promoter in Guanling cattle[J].GenomicsandAppliedBiology，2013，(4)：459-466.(in Chinese)

[25] 楊麗華，白東義，高雅罕，等.蒙古馬運動相關(guān)基因的表達量差異研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2013，44(12)：1900-1906. YANG L H，BAI D Y，GAO Y H，et al.Characterization of exercise relevant genes in Mongolian horses[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(12)：1900-1906.(in Chinese)

[26] 李 蓓，何小龍，芒 來.蒙古馬突觸融合蛋白17(STX17)基因多態(tài)性及在不同毛色皮膚組織中的表達分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42(11)：1632-1637. LI B，HE X L，MANG L.Analysis on polymorphism and expression in different coat color skin of syntaxin-17(SKX17) gene in Mongolian horse[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2011，42(11)：1632-1637.(in Chinese)

[27] 黎 靜，周 軍，鐘 梅，等.真核綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-N1-ZNF217的構(gòu)建及表達[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30(2)：391-393. LI J，ZHOU J，ZHONG M，et al.Construction and expression of the eukaryotic green fluorescent protein expression vector pEGFP-NI-ZNF217[J].JournalofFirstMilitaryMedicalUniversity，2010，30(2)：391-393.(in Chinese)

[28] VORONOVA A，COYNE E，AL MADHOUN A，et al.Hedgehog signaling regulatesMyoDexpression and activity[J].BiolChem，2013，288(6)：4389-4404.[29] KOHSAKA S，SHUKLA N，AMEUR N，et al.Acetyl transferase association and histone acetylation at the Myod1 locus during myogenic differentiation[J].FASEBJ，2014，28(1)：946.

[30] 趙廣珍，賈 青，張翠翠，等.豬MyoD1基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35(4)：90-99. ZHAO G Z，JIA Q，ZHANG C C，et al.Relationship between polymorphism ofMyoD1 and meat quality traits in pig[J].JournalofAgticulturalUniversityofHebei，2012，35(4)：90-99.(in Chinese)

(編輯 郭云雁)

Construction ofMyoDIPromoter Eukaryotic Expression Vector in Guanling Cattle and Its Expression in Mouse C2C12 Cells

HUAN Cong-cong1，2，XU Hou-qiang2*，CHEN Wei1，2，CHEN Xiang2，ZHAO Jia-fu2，ZHANG Wen2，ZHOU Di2，XIA Dan2

(1.CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegionofMinistryofEducation，CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity/GuizhouKeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，Guiyang550025，China)

The aim of this study was to analyze promoter activity of 4 different lengthsMyoDIpromoters in Guanling cattle and determine preliminarily the position of the core gene promoter.The relative expression quantity was detected in different tissues of Guanling cattle by real-time quantitative PCR.The DNA extracted from Guanling cattle blood was as a template and the phosphorylated 5'end PCR primers was designed to amplify 4 different lengthsMyoDIpromoters in Guanling cattle，ultimately accurately replaced the CMV region of pEGFP-N3 vector and got eukaryotic expression vector pEGFP-N3-MyoDI.Then the recombinant plasmid was transiently transfected into mouse C2C12 cells by liposome method.The aim was to verify promoter activity ofMyoDIpromoter by Luminous intensity of mouse C2C12 cells.The expression level ofMyoDIgene was the highest in muscle，the fragment was inserted into an expression vector，the recombinant plasmid could be successfully expressed in mouse C2C12 cells with green fluorescence under the excitation light.In this study,eukaryotic expression vector pEGFP-N3-MyoDIis successfully constructed，4 promoters constructed show promoter activity，expression quantity of P3promoter is the highest，so P3promoter is regarded as the core promoter ofMyoDIgene.

MyoDI；eukaryotic expression vector；C2C12 cell；promoter；relative expression quantity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.006

2014-07-28

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項 (2013ZX08009-004)；黔科合重大專項(字[2013]6008號)；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(黔科合NY字[2012]3008號)；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(研農(nóng)2014021)

桓聰聰(1989-)，女，河南許昌人，碩士生，主要從事細胞分子生物學(xué)研究，E-mail: huancongcong@126.com

*通信作者：許厚強，博士，教授，主要從事細胞分子生物學(xué)研究，E-mail：houqiang0524@yahoo.com

S823；S813.3

A

0366-6964(2015)05-0719-09