山羊Lcn 5的表達(dá)特點(diǎn)及其在繁殖器官中定位

任有蛇，郭麗娜，張春香，張國林，夏龍鋼，喬利英，靳 黎，劉文忠

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

山羊Lcn 5的表達(dá)特點(diǎn)及其在繁殖器官中定位

任有蛇#，郭麗娜#，張春香*，張國林，夏龍鋼，喬利英，靳 黎，劉文忠

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

為探明附睪視黃酸結(jié)合蛋白5(Lcn 5)mRNA在公山羊體組織及不同月齡附睪中的表達(dá)特性，及其在睪丸、附睪和精子中的定位。采用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測18種組織和不同月齡附睪Lcn5 mRNA表達(dá)規(guī)律；利用蛋白印跡技術(shù)對成年公羊睪丸和附睪Lcn 5蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析；利用免疫組化技術(shù)對5月齡公羊睪丸和附睪Lcn 5進(jìn)行定位，利用免疫熒光技術(shù)對精子Lcn 5進(jìn)行定位。Lcn5 mRNA在不同組織中均有表達(dá)，其中在性腺中的表達(dá)量最高，附睪頭>附睪尾>附睪體>睪丸；在5月齡前附睪的Lcn5 mRNA表達(dá)量隨月齡逐漸升高，5月齡時達(dá)到最高，隨后又逐漸降低。Western blotting 結(jié)果顯示，Lcn 5蛋白表達(dá)量：附睪頭>附睪尾>附睪體>睪丸，支持了Lcn5 mRNA定量的結(jié)果。免疫組化結(jié)果顯示，5月齡山羊在附睪管壁的柱狀細(xì)胞、纖毛細(xì)胞檢測到較強(qiáng)Lcn 5蛋白表達(dá)的陽性信號，附睪尾管腔檢測到較強(qiáng)的陽性信號。在睪丸各級生精細(xì)胞中也檢測到了微弱陽性信號。Lcn 5蛋白包裹在精子頭部頂體帽上。Lcn5在山羊附睪中高度表達(dá)，其表達(dá)具有時空特異性，推測其在精子成熟和維持正常生理功能方面發(fā)揮重要作用，其生物學(xué)功能需要進(jìn)一步深入研究。

Lcn5；表達(dá)特性；定位；睪丸；附睪；公山羊

Lipocalin蛋白家族是由一些分泌型小分子蛋白質(zhì)(160～180個氨基酸殘基)組成，其成員遍布于細(xì)菌、植物、脊椎動物和無脊椎動物體中[1]。不同物種之間該家族成員序列相似性低，但卻具有相似的高度對稱的疏水性β-桶型結(jié)構(gòu)[2]，能與疏水性小分子配體結(jié)合[3]，也能與可溶性高分子形成復(fù)合物，還可與相應(yīng)的膜受體結(jié)合[4]。因此，Lipocalins在體內(nèi)參與維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)、前列腺素免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長與代謝調(diào)控等多種生理活動[5-8]，還可能與精子的成熟及貯存有關(guān)[9]。嚙齒動物附睪分泌的Lipocalin 5(Lcn 5)可結(jié)合類維生素A，可能在附睪中通過轉(zhuǎn)運(yùn)視黃酸(VA前體)來維持附睪上皮細(xì)胞完整性，是雄性生殖生理重要調(diào)節(jié)因子[10]，同時有部分抗炎癥功能[7]。小鼠Lcn5 mRNA最初僅在附睪頭中/遠(yuǎn)端的主細(xì)胞中檢測到[11]，后又在附睪上皮細(xì)胞、附睪體和尾管腔中檢測到[12]，由體部到尾部逐漸增加，最后在附睪尾中集聚[13]。B.Guyonnet等[14]用基因芯片和瓊脂糖電泳檢測到在成年公豬附睪頭、體和尾部均有Lcn5 mRNA表達(dá)。張春香等[15]研究結(jié)果顯示，山羊附睪頭中表達(dá)有8種Lipocalins，其中檢測附睪頭中Lcn5表達(dá)量最高，然而目前還未見有關(guān)于山羊Lcn5表達(dá)特點(diǎn)及其蛋白定位研究的報(bào)道。本研究采用qRT-PCR技術(shù)分析了公山羊18種組織中及不同月齡附睪Lcn5表達(dá)特性，用Western blotting、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光等方法對睪丸與附睪中Lcn 5進(jìn)行蛋白表達(dá)量分析及其定位，為探討其對精子成熟的生物學(xué)作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和主要試劑

1.1.1 試驗(yàn)動物及樣品制備 選用體重相近健康的晉嵐絨山羊公羊，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技試驗(yàn)站提供。分別對7日齡、2、3、4、5、6、9月齡各4只公山羊?qū)嵤╅幐钍中g(shù)，從每只羊的睪丸、附睪頭、附睪體和附睪尾的相同部位采集樣品；4只成年公羊采集精液2次后，采用頸靜脈放血致死，分別采集生殖器官：睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾、前列腺；呼吸器官：氣管、肺；消化器官：皺胃、十二指腸、膽囊；泌尿器官：腎、膀胱、輸尿管；其他器官：脾、腎上腺、甲狀腺、小腦、視網(wǎng)膜等相同部位的樣品。放入DEPC處理過的凍存管中，投入液氮中，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?月齡公羔附睪頭、體、尾和睪丸，切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm組織塊，放入4.0%的多聚甲醛溶液中，處理24 h進(jìn)行固定。用0.01 mol·L-1PBS(pH7.4)洗滌3次，然后用梯度酒精脫水，進(jìn)行包埋，做連續(xù)切片，厚度5 μm，以備免疫組化分析。

1.1.2 主要試劑和儀器 總RNA提取(RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄(SYBR PrimeScript TM RT Reagent Kit)和熒光定量(SYBR Premix Ex TaqTM)試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。Rabbit Anti-Lcn 5一抗由北京天成新脈生物技術(shù)有限公司制備。即用型SABC免疫組織化學(xué)試劑盒、生物素標(biāo)記的鼠抗兔二抗和黃色DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。Real-time PCR儀(Mx 3000)、智能生物包埋機(jī)(EG 1150 H，Leica)、電腦切片機(jī)(M 60，Leica)、展片機(jī)(HI 1210，Leica)、攤片機(jī)(HI 1220，Leica)、熒光顯微鏡(BX 53，Olympus)、核酸蛋白測定儀(NanoDrop-1000，北京)、半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-RAD)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取 按RNAiso Plus試劑盒說明書提供的步驟提取組織總RNA。用核酸蛋白測定儀測定總RNA的濃度和純度，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度。檢測合格的RNA-80 ℃保存。

1.2.2 cDNA合成 按照RT Reagent Kit的說明書建議的10 μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×PrimeScript Master Mix(Perfect Real Time) 2 μL，Total RNA模板500 ng，隨機(jī)引物0.5 μL，加RNase Free ddH2O至10 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用核酸蛋白測定儀測定濃度后，-20 ℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 以18SrRNA作為Real-time PCR的內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI在線網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫中山羊Lcn5(No.KJ508082)序列，利用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)18S rRNA和Lcn 5兩對特異性引物(表1)，應(yīng)用NCBI網(wǎng)站在線Primer-blast程序檢測引物的特異性，送北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名稱Genename引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物長度/bpProductslengthLcn5F:AGAACCAGGCAGTGAAGGG,R:TGACGGCGTAGGTCTTGTAG10718SrRNAF:CAGACAAATCACTCCACCAA,R:GAAGGGCACCACCAGGAGT117

1.2.4 常規(guī)RT-PCR檢測 常規(guī)RT-PCR檢測15 μL體系：dNTP Mixture 1.2 μL，10×PCR Buffer 1.5 μL，正反向引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL，山羊組織 cDNA模板1 μL，ddH2O 10 μL，反應(yīng)條件：94 ℃3 min，94 ℃30 s，59 ℃30 s，72 ℃20 s，35個循環(huán)；72 ℃5 min，用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.5 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和體組織mRNA定量分析 用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。將附睪頭cDNA稀釋2倍，共8個梯度，陰性對照為無模板的空白管。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40 個循環(huán)，軟件自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Lcn5 mRNA定量分析時，每個樣本重復(fù)3 次，收集和導(dǎo)出Ct值。

1.2.6 免疫組化和精子免疫熒光分析 免疫組化的步驟參照文獻(xiàn)[16]。在封閉后，滴加稀釋倍數(shù)1∶50的Rabbit Anti-Lcn 5抗體(陽性)，用PBS代替一抗(陰性對照)，濕盒內(nèi)4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫40 min，PBS沖洗；再用生物素標(biāo)記的鼠抗兔二抗37 ℃孵育(免疫組化)，或加FITC標(biāo)記二抗37 ℃孵育(精子免疫熒光)，30 min后，PBS沖洗；滴加SABC后，37 ℃孵育30 min，然后用黃色DAB顯色(免疫組化)或綠色熒光染色(精子免疫熒光)；蘇木精復(fù)染后，封片，觀察拍照。

1.2.7 Westrn blotting分析 稱取冰凍的睪丸、附睪頭、附睪體和附睪尾各100 mg放入盛有液氮的研缽中磨碎，將粉末狀組織轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，按照說明書加入哺乳動物蛋白裂解液和PMSF，于室溫用polytron勻漿機(jī)高速勻漿30 s，4 ℃過夜，

由表2可知，干預(yù)后全院及各臨床科室日均領(lǐng)藥次數(shù)和領(lǐng)藥時間均較干預(yù)前大幅下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；其中，全院日均領(lǐng)藥次數(shù)降幅為53.4%，全院日均領(lǐng)藥時間降幅為74.5%。這說明干預(yù)措施能夠有效改善領(lǐng)藥過于頻繁、領(lǐng)藥耗時長的現(xiàn)象。由于婦科為新設(shè)立科室，故無干預(yù)前數(shù)據(jù)，但干預(yù)后其日均領(lǐng)藥次數(shù)和領(lǐng)藥時間數(shù)據(jù)表明優(yōu)化后的流程可良好地適用于新增設(shè)科室。

3 000 r·min-1離心10 min，用BCA法測定蛋白的含量。SDS-PAGE制備：4.0%濃縮膠和10%分離膠在98 ℃變性10 min；蛋白上樣量100 μg，濃縮膠穩(wěn)壓80 V 1 h，分離膠120 V 2 h，然后使用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜至NC膜，根據(jù)蛋白Marker條帶將膜分為兩片，分別用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，再滴加1∶1 000稀釋Rabbit Anti-Lcn 5 多克隆抗體和Mouse Antiβ-actin內(nèi)參抗體孵育，4 ℃過夜。再加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗兔(1∶5 000稀釋)和Goat Anti-Mouse(1∶2 000稀釋)二抗室溫孵育2 h。用數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)做條帶密度掃描，并測定灰度值。1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 用EXCEL 7.0 整理數(shù)據(jù)，設(shè)定Lcn5在成年公羊附睪頭中的相對表達(dá)量為1，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA質(zhì)量鑒定和RT-PCR檢測

經(jīng)核酸蛋白測定儀測定山羊各組織總RNA的A260 nm/A280 nm值均為1.8～2.0，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA結(jié)果見圖1。圖1顯示28S、18S和5S條帶清晰，說明RNA無降解，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。圖2是18種組織的Lcn5基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3%電泳檢測結(jié)果，從圖可以看出，附睪頭、附睪尾和睪丸的條帶較粗亮。其余組織的條帶亮度較淺。

圖1 總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA

2.2 體組織Lcn5 mRNA定量分析結(jié)果

2.2.1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 圖3 A是Lcn5和18SqRT-PCR的擴(kuò)增動力學(xué)曲線，其重復(fù)性好，平行性較好，拐點(diǎn)清楚。圖3 B為軟件自動繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從圖3B可看出，Lcn5和18SmRNA有良好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)分別為0.999和0.998，擴(kuò)增效率100 %以上；圖3 C為熔解曲線，從圖3 C可看出基線平穩(wěn)，呈單一峰值，沒有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。說明本研究的定量檢測方法有效。

1～18.附睪頭、附睪體、附睪尾、睪丸、輸尿管、甲狀腺、前列腺、脾、氣管、腎、皺胃、十二指腸、肺、視網(wǎng)膜、膀胱、小腦、腎上腺和膽囊，下同。M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5001-18.Epididymidis head，epididymidis body，epididymidis tail，testis，ureter，thyroid gland，prostate，spleen，trachea，kidney，abomasum，duodenum，lung，retina，urinary，cerebellum，adrenal gland，gall bladder，the same as Fig.4；M.DL500 marker圖2 公山羊各組織Lcn5的PCR產(chǎn)物電泳Fig.2 PCR results of Lcn5 mRNA from different tissues in bucks

A.18S rRNA 和Lcn 5擴(kuò)增動力學(xué)曲線；B.標(biāo)準(zhǔn)曲線； C.擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線A.PCR amplification plots for 18S rRNA and Lcn5；B.Their standard curves；C.Their dissociation curves圖3 18S rRNA及 Lcn 5擴(kuò)增的動力學(xué)曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線Fig.3 PCR amplification plots，standard and dissociation curves for 18S rRNA and Lcn 5

2.2.2 公山羊不同組織Lcn5 mRNA的表達(dá)差異 用內(nèi)參18SrRNA對公山羊不同組織中Lcn5 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行校正，其熒光定量分析結(jié)果見圖4。從圖4可看出，Lcn5 mRNA在公山羊附睪中的表達(dá)量顯著高于睪丸中的表達(dá)量(P<0.05)，極顯著高于氣管、消化道、腺體和小腦等其他組織中的Lcn5 mRNA表達(dá)量(P<0.01)。睪丸中Lcn5 mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)。而其他各組織之間Lcn5 mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

2.2.3 不同月齡公山羊附睪中Lcn5 mRNA的表達(dá)差異 采用RT-PCR技術(shù)對不同月齡的公山羊睪丸和附睪中Lcn5 mRNA表達(dá)進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如圖5所示。在5月齡前附睪頭部、體部和尾部的Lcn5 mRNA表達(dá)量隨月齡逐漸升高，5月齡時達(dá)到最高，隨后又逐漸降低，5月齡附睪頭部、體部和尾部的Lcn5 mRNA表達(dá)量顯著高于7日齡和18月齡(P<0.05)。同時縱向比較發(fā)現(xiàn)在附睪中Lcn5 mRNA的表達(dá)量次序：附睪頭>附睪尾>附睪體，除18月齡時附睪頭與附睪體Lcn5 mRNA的表達(dá)量不顯著(P>0.05)，其余各年齡點(diǎn)附睪頭Lcn5 mRNA表達(dá)量顯著高于附睪體(P<0.05)。

2.3 睪丸和附睪中的Lcn 5蛋白表達(dá)差異

2.4 Lcn 5在睪丸、附睪和精子中的定位

2.4.1 Lcn 5在睪丸和附睪的表達(dá)定位 Lcn 5在睪丸及附睪頭、體、尾部的免疫組化定位結(jié)果見圖7。從圖7 A可以看出山羊睪丸的各級生精細(xì)胞中均檢測到弱陽性信號。從圖7 C和圖7 E看附睪頭和附睪體假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞中高柱狀纖毛上皮細(xì)胞和游離緣的纖毛中均檢測到強(qiáng)陽性信號，而且附睪體管腔中也檢測到強(qiáng)陽性信號。從圖7 G看附睪尾的柱狀上皮細(xì)胞中Lcn 5蛋白信號很弱，而在游離緣的纖毛和管腔中信號非常強(qiáng)。這表明Lcn 5可能是分泌型蛋白，在附睪尾管腔中聚集。

2.4.2 Lcn 5在精子中的定位 Lcn 5蛋白在精子中的定位見圖8。從圖8可以看出，Lcn 5蛋白包裹在精子頭部頂體上，尤其是頂體帽上Lcn 5蛋白信號較強(qiáng)。精子頭部下段、精子體部、尾部的主段和末端均沒有Lcn 5蛋白信號。

3 討 論

附睪和精子中均富含視黃酸[17]，Lcn 5是視黃酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，因此在維持附睪和精子的正常生理功能中發(fā)揮重要作用。與小鼠Lcn 5分布于同一染色體上的Lipocalin蛋白家族均表現(xiàn)出分布區(qū)域的特異性，例如，Lcn 8在附睪起始端和附睪頭部遠(yuǎn)端表達(dá)[18]；PTGDS蛋白主要在睪丸輸出小管和頭部遠(yuǎn)端表達(dá)[19]。另外，張春香等[15]對附睪頭的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在山羊附睪頭中表達(dá)有7種Lipocalins，其中Lcn5 mRNA表達(dá)量最高。因此，進(jìn)一步深入研究了Lcn5 表達(dá)特性及其定位情況。

3.1 公山羊體組織Lcn5 mRNA和蛋白表達(dá)特點(diǎn)

3.1.1 公山羊體組織Lcn5 mRNA表達(dá)特點(diǎn) J.J.Lareyre等[12]研究結(jié)果顯示，家鼠Lcn5 mRNA的表達(dá)具有附睪特異性，且僅在中/遠(yuǎn)端附睪頭表達(dá)，由近遠(yuǎn)端附睪頭分泌到管腔液中。而M.Silvbana等[11]研究結(jié)果表明，小鼠Lcn5 mRNA在附睪頭部末端表達(dá)，尾部聚集。B.Guyonnet等[14]用基因芯片和瓊脂糖電泳檢測到在成年公豬附睪頭、體和尾部均有Lcn5 mRNA表達(dá)，基因芯片檢測結(jié)果顯示附睪頭部遠(yuǎn)端Lcn5 mRNA表達(dá)量最高；而瓊脂糖檢測結(jié)果顯示，在附睪尾部表達(dá)量最高，睪丸中沒有檢測到Lcn5 mRNA表達(dá)。而本研究結(jié)果顯示，在晉嵐絨山羊公羊18種體組織中均有Lcn5 mRNA表達(dá)，且具有明顯的組織差異性，其中在附睪中的表達(dá)量最高，其他組織僅有微弱表達(dá)，附睪頭中Lcn5 mRNA表達(dá)量是皺胃等消化器官、膀胱等泌尿系統(tǒng)器官及甲狀腺等腺體組織的20～30倍。而在成年公羊附睪中以附睪頭Lcn5 mRNA表達(dá)量為最高。因此，進(jìn)一步研究了不同年齡階段公羊附睪中Lcn5 mRNA表達(dá)的特點(diǎn)。

3.1.2 不同發(fā)育階段附睪中Lcn5 mRNA表達(dá)特點(diǎn) 附睪中表達(dá)的有些基因在生長發(fā)育過程中往往呈現(xiàn)出時空特異性表達(dá)模式。本研究結(jié)果顯示，山羊附睪Lcn5 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)時間特異性。在5月齡前，Lcn5 mRNA表達(dá)量隨著羔羊月齡的增加而逐漸增加，到5月齡時表達(dá)量達(dá)到最高，5月齡后，隨著月齡增加Lcn5 mRNA表達(dá)量又逐漸減少。山羊一般5月齡左右進(jìn)入初情期，也就是在性活躍期Lcn5 mRNA表達(dá)量達(dá)到最高。迄今為止還未見關(guān)于附睪Lcn5 mRNA發(fā)育性表達(dá)的研究。然而有與精子成熟相關(guān)的Lcn6的發(fā)育性變化的研究，Lcn6 mRNA出生3周后的小鼠體內(nèi)開始出現(xiàn)，并在性活躍期和成年期保持較高的水平，老年以后隨時間增長而逐步下降[21]。從本研究結(jié)果和Lcn6的研究結(jié)果看，這兩個基因有可能受雄激素調(diào)控，并且與精子的成熟有關(guān)。

3.1.3 公山羊體組織Lcn 5 蛋白表達(dá)特點(diǎn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)特性，用Wester blotting技術(shù)對山羊睪丸和附睪中Lcn 5蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示其蛋白表達(dá)量為附睪頭>附睪尾>附睪體>睪丸，證實(shí)在山羊睪丸和附睪中Lcn 5蛋白表達(dá)的規(guī)律與Lcn5 mRNA表達(dá)規(guī)律基本一致。

不同小寫字母差異顯著(P<0.05)。圖6同The different small letters were significantly different.The same as Fig.6圖4 公山羊不同組織中Lcn 5 mRNA的表達(dá)量Fig.4 Lcn 5 mRNA relative expression in different tissues of bucks

Cap.附睪頭；Cor.附睪體；Cau.附睪尾。不同大寫字母差異顯著(P < 0.05)；不同小寫字母差異顯著(P<0.05)Cap.Epididymidal caput；Cor.Epididymidal corpus；Cau.Epididymidal cauda.The different captical letters were significantly different in the same line；the different small letters were significantly different in the same row圖5 不同年齡公山羊附睪中Lcn5相對表達(dá)量Fig.5 Lcn 5 mRNA relative expression levels in epididymidis of bucks at different ages

1.睪丸(T)；2.附睪尾(Cau)；3.附睪體(Cor)；4.附睪頭(Cap).A.Lcn 5蛋白和β-actin蛋白ECL顯色結(jié)果；B.Lcn 5蛋白的相對灰度值1.Testes；2.Epididymal cauda；3.Epididymal corpus；4.Epididymal caput.A .Results of Lcn 5 protein and β-actin protein expression in testes and epididymidis of bucks，respectively；B.The relative gray-scale value of Lcn 5 protein圖6 山羊睪丸和附睪Lcn 5蛋白的ECL顯色結(jié)果Fig.6 Results of Lcn 5 protein colored with ECL in testes and epididymidis of bucks

A～H.5月齡公山羊睪丸、附睪頭、體和尾免疫組化結(jié)果，A、C、E和G為陽性(黃色DAB染色)結(jié)果，B、D、F和H為陰性對照。▲.陽性信號；△.無陽性信號A-H .The results of immunohistochemistry in epididymidis head，epididymidis body，epididymidis tail，testes of 5-month-old buck.A，C，E and G.Positive results(They were stained by yellow DAB )，B，D，F(xiàn) and H.Negative control results.▲.The positive signals；△.No positive signals圖7 睪丸及附睪Lcn 5免疫組化 400×Fig.7 Immunohistochemistry of Lcn 5 in testes and epididymis 400×

圖8 精子Lcn 5蛋白免疫熒光 400×Fig.8 Immunofluorescence of Lcn 5 in sperm 400×

3.2 睪丸及附睪中 Lcn 5 表達(dá)定位分析

P.Chaurand等[13]利用質(zhì)譜成像技術(shù)首先在附睪頭中段發(fā)現(xiàn)鼠Lcn 5蛋白，從附睪頭中段到附睪尾Lcn 5蛋白表達(dá)量逐步增加，最后在附睪尾中聚集。這一結(jié)果與J.J.Lareyre等[12]用原位雜交方法檢測的結(jié)果和T.L.Rankin等[11]用免疫組化方法檢測的結(jié)果基本一致。而S.L.Costa等研究表明Lcn 5蛋白在近端附睪頭表達(dá)最高，在體部表達(dá)低，在尾部表達(dá)也較高[22]。在性成熟的大鼠中，附睪上皮細(xì)胞表達(dá)豐富的Lcn 5蛋白[23]，由明細(xì)胞分泌[24]。本研究免疫組化定位結(jié)果顯示，Lcn 5在附睪中主要表達(dá)于假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞的柱狀上皮細(xì)胞和游離緣的微絨毛細(xì)胞中，在附睪體和附睪尾部管腔中有聚集。該定位結(jié)果與其前人的基本一致。然而本研究還在睪丸生精細(xì)胞檢測Lcn 5蛋白有微量表達(dá)。Lcn 5蛋白包裹在山羊精子頭部頂體表面。也就是說，Lcn 5蛋白除了具有視黃酸運(yùn)載功能外，還可能具有保護(hù)精子頂體的作用，需深入研究。

4 結(jié) 論

在所采集的公山羊體組織中，附睪頭Lcn5 mRNA表達(dá)量最高，且其表達(dá)具有時間特異性。Lcn5 mRNA和蛋白表達(dá)具有空間特異性。Lcn 5蛋白定位在附睪假復(fù)層上皮細(xì)胞中，可分泌到管腔中，最終在附睪尾管腔中聚集。Lcn 5蛋白包裹在山羊精子頭部頂體表面，推測其在精子成熟和維持其正常生理功能方面發(fā)揮著重要作用，其生物學(xué)功能需要進(jìn)一步深入研究。

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(編輯 程金華)

Expression Characteristics of Lcn 5 and Its Localization in Reproduction Organ of Bucks

REN You-she#，GUO Li-na#，ZHANG Chun-xiang*，ZHANG Guo-lin，XIA Long-gang，QIAO Li-ying，JIN Li，LIU Wen-zhong

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

This study was conducted to investigate the expression characteristics ofLcn5 mRNA and its protein localization in testes，epididymis in 5-month-old bucks and spermatozoa in adult bucks.Relative expressions ofLcn5 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR in 18 different tissues and epididymis at different ages.The expression of Lcn 5 protein was detected by Western blotting.The localization of Lcn 5 protein in testis and epididymidis were examined by immunohistochemistry，and in spermatozoa by immunofluorescence assay.The results of qRT-PCR showed thatLcn5 mRNA was expressed in all tissues detected，which had higher levels in reproductive tissues than in other tissues.The order of expression levels in reproductive tissues：caput>cauda>corpus>testis.The expression ofLcn5 mRNA in epididymis was increased with the increase of age before 5 months old，which was the highest at age of 5 months and was decreased subsequently.The results of Western blotting analysis showed order of the protein of Lcn 5 caput >cauda>corpus> testis，which verified the results of qRT-PCR.Immunohistochemistry results showed that there were strong positive signal in columnar epithelium of epididymis，and weak positive signal in testis.Lcn 5 protein was located on the sperm acrosome surface.Lcn5 mRNA was highly expressed in epididymis，while was time-special and region-special expression.Lcn 5 was coated on sperm acrosome surface，which maybe play an important role in sperm maturation and capacitation process.Therefore，the functions need further research.

Lcn5；expression characteristics；localization；testis；epididymis；bucks

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.005

2014-11-17

山西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20110311029；20130311025-2)

任有蛇(1970-)，男，山西岢嵐人，副教授，博士，主要從事動物繁殖調(diào)控研究，E-mail：rys925@126.com；郭麗娜(1987-)，女，河南安陽人，碩士生，主要從事動物繁殖調(diào)控研究，E-mail：guolina5188@163.com。任有蛇和郭麗娜為共同第一作者

*通信作者：張春香，副教授，E-mail：zhchx66@126.com

S827.2

A

0366-6964(2015)05-0711-08