豬RIG-I真核表達載體的構(gòu)建及其抗口蹄疫病毒作用研究

王國慶，朱紫祥，曹偉軍，楊 帆，毛箬青， 李 丹，劉 磊*，鄭海學(xué)*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

豬RIG-I真核表達載體的構(gòu)建及其抗口蹄疫病毒作用研究

王國慶1，朱紫祥2，曹偉軍2，楊 帆2，毛箬青2， 李 丹2，劉 磊1*，鄭海學(xué)2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

為研究模式識別受體分子RIG-I是否具有抑制口蹄疫病毒(FMDV)復(fù)制的作用，本研究從豬的PK15細(xì)胞中提取RNA，通過分段擴增與融合PCR的方法，擴增豬的RIG-I的完整CDS序列，進一步構(gòu)建豬RIG-I的真核表達質(zhì)粒。通過Western blotting和間接免疫熒光試驗對構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒進行表達驗證，證明其成功表達，同時證明豬RIG-I蛋白定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。感染試驗發(fā)現(xiàn)FMDV能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RIG-I的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，這表明兩者間存在著重要聯(lián)系。過表達試驗證實RIG-I具有抑制FMDV復(fù)制的作用，而下調(diào)表達RIG-I可以促進FMDV的復(fù)制，這表明RIG-I在機體抗口蹄疫病毒感染過程中發(fā)揮著重要作用。本研究的開展，為進一步探索RIG-I抗口蹄疫病毒的分子機制提供了理論支持；為口蹄疫病毒感染過程中，天然免疫系統(tǒng)抗病毒機制研究奠定了基礎(chǔ)。

口蹄疫病毒；RIG-I；天然免疫；抗病毒作用

口蹄疫(foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus， FMDV)引起的一種高度傳染性疫病[1]。FMDV屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，為單鏈正股RNA病毒，包含七個血清型。FMDV主要感染豬、牛和羊等偶蹄類動物[2-3]。FMD曾被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為A類烈性動物傳染病，在我國被列為一類動物傳染病[4-6]。撲殺是FMD防控的主要手段，因此一旦發(fā)生疫情，會導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失。這嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。作為一個養(yǎng)殖業(yè)大國，如何有效地控制、預(yù)防和治療FMD是當(dāng)前科研工作者的一個重要使命和責(zé)任。由于FMDV血清型較多，型間無交叉保護反應(yīng)，這給以疫苗免疫為主的控制措施帶來了巨大的挑戰(zhàn)[4]。為了更好地控制口蹄疫的流行和傳播，除了深入探索FMDV遺傳變異與血清型分布的規(guī)律外，同時還需要研究宿主細(xì)胞先天性免疫抗口蹄疫機制，因為宿主細(xì)胞的先天性免疫反應(yīng)不僅是抗擊病毒感染的第一道防線，而且在啟動機體后來的獲得性免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用。

模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)是機體抵抗病原微生物感染，啟動機體先天性免疫應(yīng)答的重要組成部分，在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著極其重要的作用[7]。病原微生物感染細(xì)胞后，PRRs通過識別病原的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，促進下游干擾素與細(xì)胞因子的分泌，然后激活一些抗菌或抗病毒蛋白的表達，最終促進細(xì)胞對病原微生物的清除[8]。 RIG-I樣模式識別受體(retinoic acid-inducible gene I-like helicases receptors，RLRs)為模式識別受體中極為重要的一類分子，其通過RLR級聯(lián)信號誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和炎癥因子的產(chǎn)生，在抗病毒天然免疫中起著非常重要的作用[9]。RLRs家族至今已發(fā)現(xiàn)有RIG-I、MDA5和LGP2三個成員[10]。RIG-I已經(jīng)被報道在多種RNA病毒的復(fù)制過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。但至今關(guān)于RIG-I是否在FMDV感染過程中發(fā)揮作用沒有報道。因此，本研究通過構(gòu)建FMDV感染的本體動物豬的RIG-I真核表達質(zhì)粒，對其表達情況進行了驗證，對其在細(xì)胞內(nèi)的定位進行了研究，進一步通過過表達試驗以及siRNA干擾試驗，對RIG-I是否抗FMDV感染進行了研究，探討RIG-I在FMDV感染過程中是否發(fā)揮抗病毒作用。本研究為深入研究RIG-I的抗病毒功能奠定了基礎(chǔ)，為控制FMDV的蔓延和擴散提供了新的視角。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞、菌株和載體

口蹄疫A型毒株A/WH/CHA/09由國家口蹄疫參考實驗室保存。PK15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，克隆菌株大腸桿菌DH5α 與克隆載體pMD20-T 均購自寶生物(大連)有限公司。真核表達載體pcDNATM3.1/myc-His(-) A購自Invitrogen公司。

1.2 主要試劑

LATaqPolymerase、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DNA A-Tailing Kit、DNA Marker、Random Primer(6mer)、Oligo dT寡聚核苷酸、SYBR Green試劑、T4 DNA連接酶及相關(guān)限制性內(nèi)切酶均購自寶生物(大連)有限公司；低分子量蛋白Marker購自賽默飛世爾科技公司(中國)；c-Myc單克隆抗體及羊抗鼠IgG二抗均購自Santa Cruz Biotechnology公司；β-actin單克隆抗體購自Cell signaling technology公司；RNA Trizol、LipofectamineTM2000和Alexa FluorH 546 conjugated anti-mouse IgG secondary antibodies購自Invitrogen公司；DAPI購自羅氏公司。

1.3 RNA提取及基因克隆

用Trizol裂解法提取總RNA：將35 mm培養(yǎng)皿中生長狀態(tài)好的PK15細(xì)胞用PBS洗滌兩次后，加入1 mL Trizol反復(fù)吹打裂解，移入1.5 mL無RNase eppendorf離心管內(nèi)，室溫裂解5 min，加入250 μL氯仿振蕩混勻后4 ℃放置15 min，4 ℃12 000 r·min-1離心15 min，小心吸取上清到新的無RNase的1.5 mL eppendorf離心管中，并加入等體積的異丙醇沉淀RNA，-20 ℃放置30 min后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，棄去上清，用75% DEPC處理水配制的乙醇洗滌離心管，4 ℃10 000 r·min-1離心5 min，小心棄去上清，晾干，加入20 μL無RNase 水溶解RNA，測定RNA濃度。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(20 μL體系)：首先取1 μg RNA，1 μL 100 μmol·L-16 bp random primer，1 μL 10 mmol·L-1dNTPs，補無RNase水至12 μL，65 ℃反應(yīng)5 min，冰上2 min。離心至管底后，加入4 μL 5×First buffer，2 μL 0.1 mol·L-1DTT，1 μL RNA酶抑制劑RRI，1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，75 ℃ 15 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增反應(yīng)(20 μL體系)：取10×LA buffer 1 μL，cDNA 2 μL，20 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL，LATaq酶0.5 μL，加水補足至20 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性 95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 1 min，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。退火溫度及延伸時間根據(jù)引物片段和擴增長度確定。使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase擴增時，取其相應(yīng)的Buffer，方法與上述步驟相同。擴增引物見表1。

表1 本試驗中應(yīng)用到的引物序列

Table 1 The primers used in this study

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建

利用提取好的PK15細(xì)胞RNA作為模板進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。利用LATaq酶、兩對引物(表1)通過RT-PCR分別擴增出豬RIG-I基因的前半部分(RIG-I-1)和后半部分(RIG-I-2)，中間重疊約150 bp。將擴增獲得的兩個片段分別與pMD20-T載體連接，構(gòu)建至T載體中，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，提取質(zhì)粒送樣測序。

測序驗證正確后，利用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase分別從T載體中擴增兩個片段，然后進行融合PCR，獲得含有豬RIG-I完整編碼區(qū)(CDS)的基因序列。然后對擴增的序列進行DNA加A反應(yīng)，在擴增序列兩端引入A尾以用于TA連接。將加A完成的全長序列連接至T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，提取質(zhì)粒。以得到的T載體質(zhì)粒為模板，用含有限制性內(nèi)切酶位點(XhoⅠ與BamHⅠ)的一對引物(RIG-I-complete)(表1)擴增完整的RIG-I CDS序列。電泳純化回收擴增產(chǎn)物，再用XhoⅠ與BamHⅠ雙酶切，電泳純化回收。將純化回收片段與利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ與BamHⅠ酶切得到的pcDNATM3.1/myc-His(-) A線性載體進行連接。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，提取質(zhì)粒送樣測序。經(jīng)測序分析證實，成功構(gòu)建表達豬RIG-I基因的真核表達質(zhì)粒，命名為p-RIG-I-myc。

1.5 實時熒光定量PCR(qPCR)(SYBR?Green 法)

收取細(xì)胞樣品，按照方法1.3提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，按照SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa) 試劑盒說明書操作配制反應(yīng)體系，利用stratagene_Mx3005 (Agilent) 進行實時定量PCR反應(yīng)，利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH作為內(nèi)參基因進行不同基因mRNA的相對定量。利用MxPro-Mx3005P 軟件進行數(shù)據(jù)分析。擴增引物見表1。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blotting)

細(xì)胞蛋白樣品的制備：預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次后，收取細(xì)胞沉淀。根據(jù)收集細(xì)胞沉淀的多少加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上反復(fù)吹打重懸細(xì)胞樣品，裂解10 min，超聲波瞬時破碎(冰上操作，超聲2～3次)，4 ℃ 14 000 r·min-1離心10 min，收取上清于另一預(yù)冷離心管中保存。另取2 μL收取的上清用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。剩余樣品上清加入5×SDS PAGE buffer，沸水煮沸變性5 min，4 ℃ 14 000 r·min-1離心10 min，取適量上清進行蛋白質(zhì)電泳。

SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳及轉(zhuǎn)?。号渲?0%聚丙烯酰胺蛋白膠。80 V電壓跑膠，待蛋白質(zhì)樣品進入分離膠后，調(diào)取電壓至120 V，直至電泳結(jié)束。通過濕轉(zhuǎn)方法進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)。待轉(zhuǎn)印結(jié)束后，利用5%的TBST脫脂乳室溫封閉2～3 h。隨后進行一抗孵育，4 ℃過夜。TBST輕輕漂洗3 次后，HRP標(biāo)記的二抗孵育，室溫作用2 h，作用完畢用TBST輕輕漂洗3次。利用ECL顯色試劑盒進行顯色反應(yīng)，曝光X片，掃描膠片保存結(jié)果。

1.7 間接免疫熒光(indirect fluorescence assay，IFA)

共聚焦專用培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞快長滿單層后，進行轉(zhuǎn)染，選取合適時間點進行細(xì)胞固定。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次，加入配制好的等體積甲醇丙酮混合液，-20 ℃固定20 min。吸去固定液，PBS洗滌3次，每次約10 min。用1% BSA 37 ℃封閉30 min。PBS漂洗3次，每次約5 min。然后進行一抗孵育，37 ℃作用1 h。PBS漂洗5次，每次5 min。避光滴加稀釋的熒光二抗，37 ℃作用30 min。TBS潤洗5次，每次5 min。然后進行細(xì)胞核染色。配制DAPI細(xì)胞核染色液，避光染色，室溫作用10 min，TBS漂洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.8 病毒感染及病毒滴度測定

病毒感染：35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)PK15細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%～90%時，轉(zhuǎn)染p-RIG-I-myc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，棄去細(xì)胞上清，用PBS洗滌3次，接種1 MOI病毒，37 ℃孵育1 h后，去除未吸附的病毒，PBS洗滌一次，加入細(xì)胞維持液(1%FBS培養(yǎng)液)。感染12 h后，收集上清及細(xì)胞，測定細(xì)胞內(nèi)病毒RNA含量及上清中病毒滴度。

病毒滴度的測定(TCID50)：提前18～24 h將BHK-21細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。用DMEM 10倍稀釋病毒液；用PBS洗3遍細(xì)胞后，接種病毒，另設(shè)兩列陰性對照孔。加入病毒液后，37 ℃吸附1 h，每15 min輕輕搖晃一次，保證病毒吸附均勻。吸附1 h后，棄去上清，用PBS 輕輕洗板 1 次。加入病毒維持液，感染36～48 h觀察，記錄每個稀釋度產(chǎn)生CPE的細(xì)胞孔的數(shù)目，根據(jù)Reed-Muench法計算TCID50。重復(fù)三次測定，取平均值為最終病毒滴度。

1.9 siRNA干擾試驗

待35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中PK15細(xì)胞快長滿單層后，分別轉(zhuǎn)染對照組(negative control，NC)和針對RIG-I的siRNA，轉(zhuǎn)染36 h后，利用qPCR方法檢測干擾效率。在證實了合成的siRNA可以下調(diào)RIG-I的表達后，將NC siRNA和RIG-I siRNA分別轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后，以等量FMDV(0.5 MOI)分別感染兩組細(xì)胞，感染18 h后，收集細(xì)胞，提取RNA，利用實時熒光定量PCR進行檢測，比較分析RIG-I和FMDV mRNA差異。

2 結(jié) 果

2.1 豬RIG-I CDS序列擴增

利用兩對引物對豬RIG-I基因進行分段擴增后，1%瓊脂糖凝膠跑電泳，分別檢測到約1 564和1 417 bp大小的片段(圖1)，與預(yù)期大小相符。兩片段分別與pMD20-T連接，提取質(zhì)粒后，測序結(jié)果表明測序完全正確。利用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase分別從T載體中擴增兩個片段，然后進行融合PCR擴增，結(jié)果獲得了約2 832 bp大小的片段，與預(yù)期大小相符(圖2)。該片段為豬RIG-I基因完整CDS序列。

2.2 豬RIG-I真核表達載體的構(gòu)建

將2.1中獲得的完整CDS序列片段進行加A，連接T載體后，利用含有酶切位點的引物和PrimeSTAR?HS DNA Polymerase進行PCR擴增，獲得了約2 850 bp的片段(圖3A)。XhoⅠ與BamHⅠ雙酶切后、連入pcDNATM3.1/myc-His(-)A載體，轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒。對獲得的質(zhì)粒進行XhoⅠ與BamHⅠ雙酶切鑒定，證實質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3B)。送樣測序，結(jié)果表明成功構(gòu)建表達豬RIG-I基因的真核表達質(zhì)粒p-RIG-I-myc。

圖1 RIG-I-1與RIG-I-2 片段RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of RIG-I-1 and RIG-I-2 fragments by RT-PCR

圖2 RIG-I-1與RIG-I-2 片段融合PCR擴增RIG-I-CDS全長Fig.2 Amplification of RIG-I-CDS complete sequence by overlap PCR

A.RIG-I CDS PCR擴增結(jié)果；B.RIG-I 真核表達質(zhì)粒p-RIG-I-myc XhoⅠ與BamHⅠ雙酶切鑒定A.Amplification of RIG-I-CDS sequence by PCR；B.XhoⅠ and BamHⅠ enzymatic digestion of p-RIG-I-myc plasmid圖3 RIG-I 真核表達質(zhì)粒p-RIG-I-myc的構(gòu)建與鑒定Fig.3 Construction and identification of RIG-I eukaryotic expression plasmid (p-RIG-I-myc)

2.3 豬RIG-I真核表達質(zhì)粒的表達驗證

分別將pcDNATM3.1/myc-His(-)A空載體和p-RIG-I-myc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞48 h后，收取樣品利用c-myc單抗進行Western blotting檢測，結(jié)果檢測到相對分子質(zhì)量約為110 ku大小的帶(圖4)，與預(yù)期大小相符合。這表明p-RIG-I-myc在PK15細(xì)胞內(nèi)成功表達。同樣，利用間接免疫熒光試驗進行表達檢測，結(jié)果表明RIG-I成功表達，并確定RIG-I定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖5)。

2.4 FMDV感染上調(diào)RIG-I轉(zhuǎn)錄

利用35 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)PK15細(xì)胞，待長至80%～90%后，按照1MOI接種FMDV，分別在0、6、12、24 h收取細(xì)胞樣品，進行實時定量PCR檢測。選取GAPDH為內(nèi)參基因。結(jié)果表明，隨著感染時

圖4 蛋白質(zhì)印跡法驗證p-RIG-I-myc質(zhì)粒的表達Fig.4 The confirmation of expression of p-RIG-I-myc plasmid by Western blotting

間的推移，F(xiàn)MDV RNA復(fù)制量顯著上升，而RIG-I的mRNA水平也明顯上升(圖6)。這表明FMDV感染可以上調(diào)RIG-I的轉(zhuǎn)錄。

2.5 過表達RIG-I可以抑制FMDV的復(fù)制

在PK15細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染0、1、2和3 μg p-RIG-I-myc質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后接種1MOI FMDV，感染12 h后，通過實時定量PCR方法和TCID50試驗比較4個組間病毒復(fù)制的差異。結(jié)果表明，過表達RIG-I能夠顯著抑制FMDV的復(fù)制(圖7)。

2.6 下調(diào)表達RIG-I能夠促進FMDV的復(fù)制

在PK15細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染對照組(negative control，NC)和針對RIG-I的siRNA，轉(zhuǎn)染36 h后，利用qPCR方法檢測干擾效率。結(jié)果表明，合成的針對豬RIG-I的干擾RNA可以顯著下調(diào)PK細(xì)胞中RIG-I mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，干擾效率可以達到60%～65%(圖8A)。在證實了合成的siRNA可以下調(diào)RIG-I的轉(zhuǎn)錄后，將NC siRNA和RIG-I siRNA分別轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后，以等量FMDV(0.5MOI)分別感染兩組細(xì)胞，感染18 h后，收集細(xì)胞比較分析RIG-I和FMDV mRNA轉(zhuǎn)錄差異。結(jié)果顯示，RIG-I下調(diào)表達后，F(xiàn)MDV的復(fù)制水平顯著上升(圖8B)。這表明下調(diào)表達RIG-I可以顯著促進FMDV的復(fù)制。

3 討 論

豬是FMDV感染的主要宿主，在我國分布的FMDV血清型主要為O、A和亞洲Ⅰ型[13-14]。由于FMDV各型間無交叉保護反應(yīng)，而且FMDV變異突變較快，這是以疫苗免疫作為主要防控策略的我國面臨的一個難題。宿主細(xì)胞的先天性免疫反應(yīng)是

圖5 間接免疫熒光試驗驗證RIG-I質(zhì)粒的表達及其細(xì)胞定位Fig.5 The identification of expression and subcellular localization of the RIG-I plasmid by indirect fluorescence assay

A.口蹄疫病毒 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化；B.RIG-I mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化A.FMDV mRNA expression levels are detected by qPCR；B.RIG-I mRNA expression levels are detected by qPCR圖6 口蹄疫病毒感染誘導(dǎo)RIG-I mRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)Fig.6 FMDV infection induces RIG-I mRNA transcription

A.RIG-I過表達檢測；B.FMDV mRNA檢測；C.口蹄疫病毒感染TCID50測定A.Detection of RIG-I mRNA expression；B.Detection of FMDV mRNA expression；C.Detection of viral titers by TCID50 assay 圖7 RIG-I過表達抑制FMDV復(fù)制Fig.7 Overexpression of RIG-I suppresses FMDV replication

A.RIG-I siRNA干擾效率檢測；B.下調(diào)表達RIG-I對FMDV復(fù)制的影響檢測A.Detection of silence ratio of RIG-I siRNA；B.Detection of FMDV replication level after downregulation of RIG-I expression圖8 下調(diào)表達RIG-I可以促進FMDV復(fù)制Fig.8 Downregulation of RIG-I expression promotes FMDV replication

機體抵抗病毒感染的第一道防線，在機體誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。RIG-I作為RLRs家族中一個重要的分子，其在機體發(fā)揮抗病毒作用過程中起著不可或缺的作用。

關(guān)于RIG-I與FMDV之間關(guān)系的研究至今仍然未有報道，本研究通過擴增豬的RIG-I基因，對FMDV與RIG-I之間的關(guān)系進行了研究。由于豬RIG-I基因的CDS序列起始密碼子附近GC含量過高，而且豬RIG-I CDS序列全長較長，因此擴增具有一定的難度。本試驗通過分段擴增，將豬的RIG-I基因分為前后兩部分分別進行擴增，然后進行融合PCR擴增，最終獲得了豬RIG-I基因全長CDS序列，并構(gòu)建了豬RIG-I基因的真核表達質(zhì)粒，這為研究FMDV與豬RLRs信號通路間的相互作用機制奠定了基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV感染PK15細(xì)胞后，可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RIG-I的轉(zhuǎn)錄，這表明FMDV與RIG-I之間存在著必然的聯(lián)系。而進一步進行過表達試驗以及siRNA干擾試驗研究發(fā)現(xiàn)，RIG-I的上調(diào)表達可以抑制FMDV的復(fù)制，而下調(diào)表達RIG-I可以促進FMDV的復(fù)制，這證明了RIG-I在FMDV感染后發(fā)揮著重要的抗病毒作用。以往研究報道RIG-I可以通過其C端RD區(qū)識別病原RNA，然后通過其CARD區(qū)與IPS1結(jié)合而激活RLR信號通路，誘導(dǎo)下游炎癥因子和抗病毒蛋白的表達發(fā)揮抗病毒作用[15-16]。但是關(guān)于FMDV感染后，其病毒RNA是否能夠被RIG-I識別至今仍然不清楚。而本研究發(fā)現(xiàn)豬RIG-I蛋白定位于PK15細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這為進一步研究FMDV病原RNA與RIG-I之間的關(guān)系提供了一定的理論支持。雖然關(guān)于RIG-I抑制FMDV復(fù)制的機制仍然不清楚，但本試驗初步證實RIG-I具有抑制FMDV復(fù)制的作用。這為深入開展RIG-I抗FMDV機制研究奠定了理論基礎(chǔ)，為FMDV的防控提供了新的視角。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建豬RIG-I的真核表達質(zhì)粒，并驗證了質(zhì)粒的表達，證實豬RIG-I蛋白定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。感染試驗發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RIG-I的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，過表達試驗證實RIG-I的上調(diào)表達具有抑制FMDV復(fù)制的作用，siRNA干擾試驗表明下調(diào)表達RIG-I可以促進FMDV的復(fù)制。這表明RIG-I在機體抗口蹄疫病毒感染過程中發(fā)揮著重要的抗病毒作用。

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(編輯 白永平)

Construction of Porcine RIG-I Eukaryotic Expressing Plasmid and Its Antiviral Effects Research against Foot and mouth Disease Virus

WANG Guo-qing1，ZHU Zi-xiang2，CAO Wei-jun2，YANG Fan2，MAO Ruo-qing2，LI Dan2，LIU Lei1*，ZHENG Hai-xue2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.NationalFootandMouthDiseaseReferenceLaboratory，StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology，LanzhouVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730046，China)

To investigate whether pattern recognition receptor RIG-I has antiviral role against foot-and-mouth disease virus (FMDV)，we extracted porcine cellular RNA from PK15 cells，and the complete CDS region ofRIG-I was obtained by using two-segmental amplification and fusion PCR methods.Subsequently，the eukaryotic expressing plasmid was constructed.The expression of the plasmid was confirmed by Western blotting and indirect fluorescence assay (IFA)，which showed RIG-I was successfully expressed.The IFA result indicated porcine RIG-I protein was located in the cellular cytoplasm.The results of infection assay suggested that FMDV infection induced the upregulation of RIG-I expression，which implied the potential connection between RIG-I and FMDV.Over-expression assay confirmed that RIG-I inhibited FMDV replication，and downregulation of RIG-I significantly promoted FMDV replication.These results indicated that RIG-I had antiviral effect against FMDV.In conclusion，this study provided references for further research on antiviral mechanism of RIG-I against FMDV.It also paves ways for the research of antiviral mechanism of innate immune system after FMDV infection.

foot and mouth disease virus；RIG-I；innate immunity；antiviral effect

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.013

2014-07-28

國家自然科學(xué)基金項目(31302118；31402179)；甘肅省杰出青年基金項目(145RJDA328)；甘肅省科技重大專項項目(1302NKDA027)；國際原子能項目(16025/R0)

王國慶(1986-)，男，河南商丘人，碩士生，主要從事分子病毒學(xué)研究，E-mail：1986guoqing@163.com

*通信作者：劉 磊(1960-)，男，教授，E-mail：liuleigs@163.com；鄭海學(xué)(1979-)，男，研究員，Tel：0931-8342086，E-mail：zhenghaixue@caas.cn

S582.659.6

A

0366-6964(2015)04-0600-08