牦牛和雄性不育犏牛睪丸FABP5和FABP9基因mRNA水平及能量代謝相關(guān)酶活力的比較

付 偉，黃 林，劉文靜，任 亮，李彩霞，金素鈺，林亞秋，鄭玉才*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010)

牦牛和雄性不育犏牛睪丸FABP5和FABP9基因mRNA水平及能量代謝相關(guān)酶活力的比較

付 偉1，黃 林1，劉文靜2，任 亮1，李彩霞1，金素鈺1，林亞秋1，鄭玉才1*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010)

本研究旨在測定牦牛表皮細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP5)和睪丸型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP9)基因序列，比較其在牦牛和雄性不育犏牛睪丸中的表達(dá)，并結(jié)合睪丸中部分能量代謝相關(guān)酶的活力分析，以探索這兩個基因及能量代謝與犏牛雄性不育之間的聯(lián)系。試驗從牦牛睪丸中提取總RNA，采用PCR方法獲得了牦牛FABP5和FABP9基因的cDNA序列，編碼區(qū)長度分別為408和399 bp，與普通牛相比分別有1個和6個堿基差異，后者導(dǎo)致FABP9基因推導(dǎo)的氨基酸序列存在5個氨基酸差異。實時熒光定量PCR分析顯示，F(xiàn)ABP5基因在犏牛睪丸中的表達(dá)量極顯著大于牦牛，而FABP9基因表達(dá)量差異不顯著。犏牛睪丸中異檸檬酸脫氫酶活力極顯著高于牦牛(P<0.01)，而β-羥脂酰CoA脫氫酶和乳酸脫氫酶活力與牦牛接近。犏牛睪丸中FABP5基因表達(dá)上調(diào)以及參與三羧酸循環(huán)的檸檬酸脫氫酶活力提高，可能提示雄性不育犏牛睪丸組織在脂肪酸氧化供能水平上高于成年牦牛。

牦牛；FABP基因；雜交雄性不育；睪丸；能量代謝

脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)廣泛存在于動物組織的多種細(xì)胞內(nèi)，主要參與長鏈脂肪酸的吸收、轉(zhuǎn)運及代謝[1-2]。根據(jù)表達(dá)及功能差異，可將FABPs分為9種類型，包括腦型(B-FABP)、肝型(L-FABP)、心型(H-FABP)、腸型(I-FABP)、脂肪細(xì)胞型(A-FABP)、回腸型(IL-FABP)、髓磷脂型(My-FABP)、表皮細(xì)胞型(E-FABP)和睪丸型(T-FABP)。E-FABP(又稱FABP5)來源于動物上皮細(xì)胞，參與并調(diào)控脂肪酸代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及癌癥發(fā)生等多個過程，對細(xì)胞的正常生長發(fā)育至關(guān)重要[3-4]；T-FABP(又稱FABP9、PERF15)是動物睪丸特異的，在圓形精子和早期長形精子中大量表達(dá)，也是精子頂體的主要組分[5]，參與精子發(fā)生、成熟和受精，在雄性生殖中發(fā)揮重要作用[6-7]。

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原特有的牛種，它與普通牛(Bostaurus)的雜交后代(稱犏牛)在產(chǎn)乳、產(chǎn)肉等方面具有明顯的雜種優(yōu)勢，但表現(xiàn)為回交3代內(nèi)雄性不育，無法產(chǎn)生正常的精子[8]，而雌性雜交后代生殖正常，其機制一直未得到令人信服的解釋。已有的研究表明，與生殖相關(guān)的很多基因在犏牛睪丸中的mRNA水平都低于其親本(牦牛和普通牛)，如SYCP3、PIWIL1、Dmrt7、Bvh等[9-12]。本課題組在研究牦牛睪丸蛋白質(zhì)組學(xué)時發(fā)現(xiàn)，與牦牛相比，犏牛睪丸中大多數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，而FABP5表達(dá)顯著上調(diào)[13]。后續(xù)研究又觀察到犏牛睪丸中參與脂肪酸氧化的中鏈?；o酶A脫氫酶表達(dá)亦上調(diào)(待發(fā)表資料)。另外，成年牦牛睪丸中參與脂肪酸氧化的β-羥脂酰CoA脫氫酶(HAD)活力顯著低于性未成熟的犢牦牛[14]。這些結(jié)果促使人們提出這樣的假設(shè)：雄性不育犏牛睪丸的能量代謝(特別是脂肪酸氧化)可能與成年牦牛有顯著差異。

本研究通過PCR產(chǎn)物直接測序的方法，比較牦牛與犏牛FABP5和FABP9基因序列，并利用實時熒光定量PCR分析其在牦牛和犏牛睪丸中的mRNA水平；另外測定睪丸中分別參與脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)和糖酵解的3種酶活力，包括β-羥脂酰CoA脫氫酶(HAD)、異檸檬酸脫氫酶(ICDH)和乳酸脫氫酶(LDH)，以探索FABP5和FABP9表達(dá)水平及能量代謝與犏牛雄性不育的可能關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

麥洼牦牛(Bosgrunniens)和犏牛(公黃牛與母麥洼牦牛的雜交后代)的睪丸組織均采自成都市青白江區(qū)屠宰場。健康的成年公牦牛(n=13)和公犏牛(n=7)在屠宰后立刻取其睪丸，縱切面剖開后用干冰帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Scientific公司；Trizol Reagent購自美國Ambion公司；Cycle-pure Kit 購自美國OMEGA公司； QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國QIAGEN公司；SuperTaqDNA Polymerase購自美國GeneCopoeia公司；丙酮酸鈉、異檸檬酸、乙酰乙酰-CoA、NADH和NADP均購自美國Sigma公司；DL2000 marker購自天根生化科技(北京)有限公司。

C1000 Thermal Cycler梯度PCR儀、C1000 Touch Thermal Cycler熒光定量PCR儀、Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；DR 2800分光光度計為美國HACH公司產(chǎn)品；CR21G高速冷凍離心機為日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按試劑盒說明書用Trizol法提取牦牛睪丸總RNA。用紫外分光光度法測定核酸濃度。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以2 μg總RNA為模板，利用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈。

1.4 引物設(shè)計與PCR擴增

參照GenBank中野牦牛FABP5預(yù)測序列(XM_005897263.1)和普通牛FABP5序列(NM_174315.3)，以及野牦牛FABP9預(yù)測序列(XM_005897261.1)和普通牛FABP9序列(NM_001192410.1)，用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計PCR引物(表1)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本試驗所用引物序列

Table 1 Primers for the present experiment

目的基因Targetgene引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature產(chǎn)物長度/bpFragmentsizeFABP5F:AGCTCACCTGTCACGCCTGTR:TTTCTGTGCAAAATGATGAGGG62470FABP9F:CACCTCTTCTCTGCAAGCTTTCR:CACATCTTCTTCAAGTCCCAGC60489FABP5(Q-PCR)F:ACTGGGAGAGAAGTTTGAAGAGACCR:GACCCGAGTACAGGTAACATTGTTC62187FABP9(Q-PCR)F:GAACTGGGAGTGAGTGTTGCACTCR:TGCCGGTTATCTATGGTGGTTTC62173GAPDHF:CGACTTCAACAGCGACACTCAR:GGTCCAGGGACCTTACTCCTT6016918SRNAF:CTGAGAAACGGCTACCACATCR:CAGACTTGCCCTCCAATGG60168

牦牛睪丸總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再進行PCR擴增，反應(yīng)體系(25 μL)：10×Reaction Buffer 2.5 μL，SuperTaqDNA Polymerase 0.2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，加超純水至25 μL。PCR程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60～62 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 基因的測序及序列分析

以3頭牦牛睪丸cDNA為模板，用PCR分別擴增FABP5和FABP9基因序列，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行直接測序。用DNAMAN4.0軟件分析測序結(jié)果。

1.6 睪丸組織FABP5和FABP9基因的定量分析

以本研究獲得的牦牛睪丸FABP5和FABP9基因序列為模板設(shè)計定量PCR引物，以普通牛GAPDH(NM_001034034)和18SRNA(NR_036642)為內(nèi)參基因。以反轉(zhuǎn)錄獲得的牦牛(n=13)和犏牛(n=7)睪丸組織cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR方法檢測FABP5和FABP9基因的相對表達(dá)量。PCR體系(25 μL)：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，RNase-free water 9.5 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60～62 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)，65～95 ℃制作熔解曲線。

1.7 睪丸組織中酶活力測定

在冰上解凍牦牛(n=13)和犏牛(n=7)睪丸組織，分別準(zhǔn)確稱取0.1 g于裝有1.4 mL勻漿液(10 mmol·L-1Tris，pH 8.0，0.25 mol·L-1蔗糖，2 mmol·L-1EDTA)的EP管中，參照C.Jurie等的方法[15]，在冰上勻漿20 s，-80 ℃凍融2次，超聲波2 min(每9 s停止3 s，輸出功率250 W)。取0.5 mL勻漿液以1 700 g于4 ℃離心15 min，上清液用于HAD活力測定；剩余部分10 000 g于4 ℃離心10 min，上清液分裝用于測定ICDH和LDH活力。所有樣品于-80 ℃保存。

HAD和ICDH活力測定參照C.Jurie等的方法[15]，LDH活力測定參照L.Marchat等的方法[16]。酶活力的定義為在25 ℃條件下，每克新鮮組織每分鐘催化1 μmol底物轉(zhuǎn)化為1個單位。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用2-△△Ct法計算FABP5和FABP9基因在睪丸中的相對表達(dá)水平。數(shù)據(jù)以Bio-Rad公司的CFX manager 3.0用GAPDH和18SRNA為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)化，以牦牛睪丸的表達(dá)量為對照。試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS18.0軟件對熒光定量數(shù)據(jù)和酶活力數(shù)據(jù)進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛FABP5和FABP9基因測序

試驗設(shè)計的PCR引物從牦牛睪丸總RNA中均擴增出了與預(yù)期長度相符的產(chǎn)物(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序證實為FABP5和FABP9基因，長度分別為470和489 bp。

牦牛FABP5基因(GenBank登錄號：KM659856)的編碼區(qū)(CDS)長度為408 bp，與野牦牛預(yù)測序列(XM_005897263.1)完全相同；與普通牛序列(NM_174315.3)相比存在1個堿基差異(第372位堿基，牦牛為T而普通牛為C)，相似性為99.75%。牦牛FABP5基因推導(dǎo)的氨基酸序列包含135個氨基酸，與野牦牛預(yù)測序列(XP_005897325.1)和普通牛序列(NP_776740.1)相同，理論分子量為15.039 ku，預(yù)測等電點為7.82。

牦牛FABP9基因(GenBank登錄號：KM659857)的編碼區(qū)與野牦牛預(yù)測序列(XM_005897261.1)和普通牛序列(NM_001192410.1)的長度均為399 bp，但與后者存在6個堿基差異，相似性98.50%。牦牛FABP9基因推導(dǎo)的氨基酸序列含有132個氨基酸，理論分子量為14.854 ku，預(yù)測等電點為5.96，與野牦牛預(yù)測氨基酸序列(XP_005897323.1)相同，但與普通牛FABP9(NP_001179339.1)在預(yù)測等電點(8.46)上存在明顯差異，這是由于二者序列存在5個氨基酸差異(表2)，且普通牛中第25和80位分別為甘氨酸(中性氨基酸)、賴氨酸(堿性氨基酸)，而牦牛中相應(yīng)位置分別為谷氨酸(酸性氨基酸)、谷氨酰胺(中性氨基酸)，氨基酸序列相似性為96.21%。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1、2.FABP5和FABP9基因PCR產(chǎn)物M.DL2000 marker；1，2.PCR products of FABP5 and FABP9 genes，respectively圖1 牦牛FABP5和FABP9基因的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of FABP5 and FABP9 genes of yak

2.2FABP5和FABP9基因在牦牛和犏牛睪丸中的表達(dá)

以GAPDH和18SRNA為內(nèi)參基因，對牦牛和犏牛睪丸中FABP5和FABP9基因mRNA表達(dá)水平進行了熒光定量PCR檢測，擴增效率為98.6%～99.8%，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好(R2>0.99)。犏牛睪丸中FABP5基因的表達(dá)量極顯著高于牦牛(P<0.01)，相差約兩倍；而FABP9基因表達(dá)量差異不顯著(圖2)。

表2 牦牛與普通牛FABP9基因推導(dǎo)的氨基酸序列對比

Table 2 Comparison of deduced amino acid sequences ofFABP9 gene between yak and cattle

牛種Species氨基酸位置Aminoacidposition253080129132牦牛YakGluLeuGlnTyrVal普通牛CattleGlyValLysCysLeu

2.3 牦牛和犏牛睪丸中酶活力分析

睪丸組織酶活力測定顯示，犏牛睪丸中參與三羧酸循環(huán)的ICDH活力極顯著高于牦牛(P<0.01)，而參與脂肪酸氧化的HAD和參與糖酵解的LDH活力未見顯著改變(表3)。另外，睪丸FABP5和FABP9的mRNA水平與酶活力之間未見顯著相關(guān)性。

**.P<0.01圖2 FABP5(A)和FABP9基因(B)在牦牛和犏牛睪丸中的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of FABP5 (A) and FAPB9 (B) genes in the testes of yak and F1 hybrids

表3 牦牛和犏牛睪丸中的酶活力

Table 3 Enzyme activities in the testes of yak and F1 hybrids

酶Enzyme犏牛F1hybrids(n=7)牦牛Yak(n=13)β-羥脂酰CoA脫氫酶β-hydroxyacylCoAdehydrogenase(HAD)3.58±0.243.62±0.27異檸檬酸脫氫酶Isocitratedehydrogenase(ICDH)1.44±0.11**0.96±0.09乳酸脫氫酶Lactatedehydrogenase(LDH)31.92±1.8327.94±1.01

**.P<0.01

3 討 論

本研究從牦牛睪丸中成功獲得了FABP5和FABP9基因的cDNA序列。牦牛FABP5基因編碼的氨基酸序列與普通牛完全相同，說明該基因具有高度的保守性；而牦牛FABP9基因編碼的氨基酸序列與普通牛相比存在較大差異，相似性為96.21%，稍低于已報道的其他一些蛋白質(zhì)[17-18]，提示牦牛FABP9基因進化相對較快。FABP9氨基酸序列的差異是否會影響其功能尚需進一步研究。

實時熒光定量PCR分析顯示，F(xiàn)ABP5基因在犏牛睪丸中的表達(dá)量極顯著高于牦牛，表達(dá)量相差約兩倍，這與本實驗室近期發(fā)現(xiàn)的FABP5蛋白在犏牛睪丸中的表達(dá)量比牦牛高2.6倍的結(jié)果吻合[13]。有研究表明，F(xiàn)ABP5在牛睪丸支持細(xì)胞中表達(dá)[19]，也存在于脂肪細(xì)胞、肝、心等細(xì)胞或組織中[20]。M.Furuhashi等發(fā)現(xiàn)，敲除FABP5基因可提高小鼠對胰島素的敏感性，而在脂肪細(xì)胞中過量表達(dá)該基因則產(chǎn)生相反的效果[21]，提示FABP5基因表達(dá)直接影響機體的能量代謝。犏牛睪丸中參與脂肪酸氧化的中鏈?；o酶A脫氫酶表達(dá)上調(diào)(本課題組待發(fā)表資料)，以及犢牦牛睪丸中HAD活力顯著高于成年牦牛的結(jié)果[14]，提示睪丸脂肪酸代謝(也可能包括糖代謝)與睪丸精子發(fā)生可能有一定關(guān)系。犏牛睪丸中FABP5基因mRNA水平和中鏈?；o酶A脫氫酶蛋白水平的上調(diào)，均提示其脂肪酸β-氧化代謝的加強，但本研究未檢測到參與脂肪酸β-氧化的HAD活力的顯著改變，可能與HAD基礎(chǔ)水平高，不屬于限速酶有關(guān)。

有研究證實，男性不育患者睪丸中某些酶的活力存在異常[22]。睪丸組織的間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞中存在豐富的參與脂肪酸β-氧化的酶[23]，部分酶也存在于精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中[24]。支持細(xì)胞可以通過β-氧化為精子發(fā)生提供能量[25]。對精子尾部蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，約1/4的蛋白質(zhì)與脂肪代謝有關(guān)，抑制脂肪酸氧化相關(guān)酶的活性可顯著降低精子活力[26]。這些說明脂肪酸代謝對精子發(fā)生十分關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，犏牛睪丸中參與三羧酸循環(huán)的ICDH活力極顯著高于牦牛，而HAD和LDH活力則未見顯著差異。大鼠精子中三羧酸循環(huán)相關(guān)酶活力顯著低于精母細(xì)胞、精子細(xì)胞等生殖細(xì)胞[27]，表明精子發(fā)生不同階段能量代謝情況存在差異。牦牛與犏牛睪丸組織在細(xì)胞組成方面有顯著差異[28]，犏牛睪丸中無正常精子，這很可能與犏牛睪丸ICDH活力高有直接關(guān)系。筆者推測，犏牛睪丸ICDH活力的提高可能與脂肪酸代謝的改變相關(guān)。

FABP9特異表達(dá)于動物睪丸組織，是精子頂體的結(jié)構(gòu)蛋白，與精子發(fā)生、獲能等過程關(guān)系密切[6-7]。本研究表明，F(xiàn)ABP9基因在牦牛和犏牛睪丸中均表達(dá)，但表達(dá)量差異不顯著。J.Jamshidi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，精子發(fā)生障礙患者睪丸中FABP9基因無突變體存在；另有研究表明，缺乏FABP9的小鼠精子頭部發(fā)育異常，但小鼠仍具有生殖能力，說明FABP9雖然是精子形成的重要蛋白，但該蛋白的單獨缺失并不能完全阻斷整個生殖過程[30]。本研究結(jié)果初步表明，牦牛與普通牛FABP9存在較多的氨基酸差異，但可能不是導(dǎo)致犏牛雄性不育的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。

[1] CHMURZYN＇SKA A.The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs)：function，structure and polymorphism[J].JApplGenet，2006，47(1)：39-48.

[2] ZIMMERMAN A W，VEERKAMP J H.New insights into the structure and function of fatty acid-binding proteins[J].CellMolLifeSci，2002，59(7)：1096-1116.

[3] SANSON B，WANG T，SUN J，et al.Crystallographic study of FABP5 as an intracellular endocannabinoid transporter[J].ActaCrystallogrDBiolCrystallogr，2014，70(Pt 2):290-298.

[4] ZHANG Y，SUN Y，RAO E，et al.Fatty acid binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFNβ responses in tumor-associated macrophages [J].CancerRes，2014，74(11):2986-2998.

[5] KORLEY R，POURESMAEILI F，OKO R.Analysis of the protein composition of the mouse sperm perinuclear theca and characterization of its major protein constituent[J].BiolReprod，1997，57(6)：1426-1432.

[6] KIDO T，ARATA S，SUZUKI R，et al.The testicular fatty acid binding protein PERF15 regulates the fate of germ cells in PERF15 transgenic mice[J].DevGrowthDiffer，2005，47(1)：15-24.

[7] OKO R，MORALES C R.A novel testicular protein，with sequence similarities to a family of lipid binding proteins，is a major component of the rat sperm perinuclear theca[J].DevBiol，1994，166(1)：235-245.

[8] 張旭靜.牦牛和普通牛種間雜種公牛睪丸的組織學(xué)觀測與研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2001，32(4)：314-318. ZHANG X J.An observation and study of testicular histology in hybrid bull copulated by yak and cattle[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2001，32(4)：314-318.(in Chinese)

[9] 屈旭光，李齊發(fā)，劉振山，等.牦牛、犏牛睪丸組織中SYCP3基因mRNA表達(dá)水平研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39(8)：1132-1136. QU X G，LI Q F，LIU Z S，et al.The study on the expression level ofSYCP3 mRNA in yak and cattle-yak testis[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2008，39(8)：1132-1136.(in Chinese)

[10] GU Y，LI Q，PAN Z，et al.Molecular cloning，gene expression and methylation status analysis of PIWIL1 in cattle-yaks and the parental generation[J].AnimReprodSci，2013，140(3-4)：131-137.

[11] 金 帥，郭 憲，包鵬甲，等.牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其在睪丸組織中的表達(dá)水平[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46(5)：1036-1043. JIN S，GUO X，BAO P J，et al.Sequence analysis and study on the expression level of Dmrt7 gene in yak and cattle-yak testis[J].ScientiaAgriculturaSinica，2013，46(5)：1036-1043.(in Chinese)

[12] LUO H，ZHOU Y，LI Y，et al.Splice variants and promoter methylation status of the bovine vasa homology (Bvh) gene may be involved in bull spermatogenesis[J].BMCGenet，2013，14(1):58.doi:10.1186/1471-2156-14-58.

[13] 付 偉，李彩霞，劉文靜，等.利用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)鑒定牦牛和犏牛摹丸中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)[J].西南民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2014，40(1)：11-15. FU W，LI C X，LIU W J，et al.Identification of the differentially expressed testis proteins between yaks and cattle-yaks by two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry[J].JournalofSouthwestUniversityforNationalities，NaturalScienceEdition，2014，40(1)：11-15.(in Chinese)

[14] 邱 翔，林亞秋，王國生，等.牦牛睪丸組織能量代謝相關(guān)酶活力的分析[J].四川動物，2010，29(5)：590-592. QU X，LIN Y Q，WANG G S，et al.Analysis of energy metabolism-related enzyme activities in yak testis tissue[J].SichuanJournalofZoology，2010，29(5)：590-592.(in Chinese)

[15] JURIE C，ORTIGUES-MARTY I，PICARD B，et a1.The separate effects of the nature of diet and grazing mobility on metabolic potential of muscles from Charolais steers[J].LivestSci，2006，104(1-2)：182-192.

[16] MARCHAT L，LOISEAU P M，PETEK F.Purification and characterization of lactate dehydrogenase isoenzyines 1 and 2 fromMolinemadessetae(Nematoda：Filarioidea)[J].ParasitolRes，1996，82(8)：672-680.[17] BAI W L，YIN R H，ZHENG Y C，et al.Cloning and molecular characterization of a yak α-lactalbumin cDNA from mammary tissue[J].LivestSci，2010，129(1-3)：122-128.

[18] DING Y，XU Y O，LIN Y Q，et al.Cloning and expression profiles of yak lipoprotein lipase gene[J].JAppliedAnimRes，2012，40(4)：311-315.

[19] KINGMA P B，BOK D，ONG D E.Bovine epidermal fatty acid-binding protein：determination of ligand specificity and cellular localization in retina and testis[J].Biochemistry，1998，37(10)：3250-3257.

[20] MAEDA K，UYSAL K T，MAKOWSKI L，et al.Role of the fatty acid binding protein mall in obesity and insulin resistance[J].Diabetes，2003，52(2)：300-307.

[21] FURUHASHI M，HOTAMISLIGIL G S.Fatty acid-binding proteins：role in metabolic diseases and potential as drug targets[J].NatRevDrugDiscov，2008，7(6)：489-503.

[22] AMORY J K，ARNOLD S，LARDONE M C，et al.Levels of the retinoic acid synthesizing enzyme aldehyde dehydrogenase-1A2 are lower in testicular tissue from men with infertility[J].FertilSteril，2014，101(4):960-966.

[23] FUKASAWA M，ATSUZAWA K，MIZUTANI K，et al．Immunohistochemical localization of mitoehondrial fatty acid β-oxidation enzymes in rat testis[J].JHistochemCytochem，2010，58(2)：195-206.

[24] BAJPAI M，GUPTA G，JAIN S K.Lipid metabolising enzymes in isolated rat testicular germ cells and changes associated with meiosis[J].Andrologia，1998，30(6)：311-315.

[25] XIONG W，WANG H，WU H，et al.Apoptotic spermatogenic cells can be energy sources for Sertoli cells[J].Reproduction， 2009，137(3)：469-479.

[26] AMARAL A，CASTILLO J，ESTANYOL J M，et al.Human sperm tail proteome suggests new endogenous metabolic pathways[J].MolCellProteomics，2013，12(2)：330-342.

[27] BAJPAI M，GUPTA G，SETTY B S.Changes in carbohydrate metabolism of testicular germ cells during meiosis in the rat[J].EurJEndocrinol，1998，38(3)：322-327.

[28] LOU Y N，LIU W J，WANG C L，et al.Histological evaluation and Prdm9 expression level in the testis of sterile male cattle-yaks[J].LivestSci，2014，160：208-213.

[29] JAMSHIDI J，POURESMAEILI F，DARVISH H，et al.FABP9 mutations are not detected in cases of infertility due to sperm morphological defects in Iranian men[J].IntJFertilSteril，2014，7(4)：275-280.

[30] SELVARAJ V，ASANO A，PAGE J L，et al.Mice lacking FABP9/PERF15 develop sperm head abnormalities but are fertile[J].DevBiol，2010，348(2)：177-189.

(編輯 郭云雁)

Comparison of the mRNA Levels ofFABP5 andFABP9 Genes and Activities of Some Enzymes Related to Energy Metabolism in the Testes of Yak and Sterile F1 Male Hybrids between Male Cattle and Female Yak

FU Wei1，HUANG Lin1，LIU Wen-jing2，REN Liang1，LI Cai-xia1，JIN Su-yu1，LIN Ya-qiu1，ZHENG Yu-cai1*

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China；2.SchoolofLifeScienceandEngineering，SouthwestUniversityofScienceandTechnology，Mianyang621010，China)

The epidermal type fatty acid binding protein (FABP5) and testicular fatty acid binding protein (FABP9) genes of yak were sequenced，and their expressions as well as activities of some enzymes related to energy metabolism in the testes were compared between yak and sterile F1 males (male cattle × female yak)，aiming to explore the association between the two genes and energy metabolism with the sterility of F1 males.Total RNA was extracted from yak testes and the cDNA sequences ofFABP5 andFABP9 genes were obtained using conventional PCR methods.The coding region of yakFABP5 andFABP9 genes were 408 and 399 bp，respectively，and showed 1 and 6 nucleotide differences compared with those of cattle，respectively，the latter caused 5 amino acid substitutions in the deduced amino acid sequences.Real-time quantitative PCR analysis showed that the expression ofFABP5 gene in the sterile F1 testes was significantly greater than yak，but not forFABP9 gene.Isocitrate dehydrogenase activity in sterile F1 testes was significantly higher than yak (P<0.01)，while β-hydroxyacyl CoA dehydrogenase and lactate dehydrogenase activities were similar in the testes of yak and sterile F1 males.The up-regulated expression ofFABP5 gene and the increased activity of isocitrate dehydrogenase involved in citric acid cycle in the sterile F1 testes may indicate that the level of fatty acid oxidation for energy is higher in the testes of sterile F1 males than adult yak.

yak；FABPgene；hybrid male sterility；testes；energy metabolism

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.008

2014-07-02

國家自然科學(xué)基金(31240053)

付 偉(1989-)，男，四川資陽人，研究生，主要從事動物生化與分子遺傳學(xué)研究，E-mail：fuwei11223344@163.com

*通信作者：鄭玉才，教授，博士，E-mail：yucaizheng65@hotmail.com

S823.8

A

0366-6964(2015)04-0561-07