山羊產(chǎn)羔數(shù)全基因組關(guān)聯(lián)分析

蘭 蓉，朱 蘭，姚新榮，王 鵬，邵慶勇，洪瓊花*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224； 2.云南省種羊繁育推廣中心，尋甸 650000)

山羊產(chǎn)羔數(shù)全基因組關(guān)聯(lián)分析

蘭 蓉1，朱 蘭1，姚新榮2，王 鵬2，邵慶勇1，洪瓊花1*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224； 2.云南省種羊繁育推廣中心，尋甸 650000)

本研究旨在通過(guò)對(duì)山羊產(chǎn)羔性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)，尋找和定位與山羊產(chǎn)羔性狀密切關(guān)聯(lián)的新基因。以云南黑山羊6個(gè)公羊家系的302只山羊?yàn)樵囼?yàn)材料，用Illumina 公司Iselect Goat60k芯片技術(shù)進(jìn)行SNP分型，分型結(jié)果利用plink V1.07的線性回歸模型對(duì)山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。研究結(jié)果表明：在2號(hào)染色體上有2個(gè)SNPs位點(diǎn)與山羊產(chǎn)羔數(shù)達(dá)到5%基因組水平顯著相關(guān)(P<1.48E-6)，分別位于SLC4A10基因的下游和TBR1基因的上游；5個(gè)SNPs位點(diǎn)與山羊產(chǎn)羔數(shù)達(dá)潛在關(guān)聯(lián)(P<2.97E-5)，分別位于1號(hào)染色體SENP7基因上游，21號(hào)染色體Hypothetical Protein基因的上游，以及28號(hào)染色體WDFY4基因和TMEM26基因的上游、BICC1基因的下游。這些基因可作為山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的相關(guān)候選基因，也可為山羊產(chǎn)羔性狀的分子機(jī)制研究和今后標(biāo)記輔助選擇的開(kāi)展提供理論基礎(chǔ)及新的研究線索。

云南黑山羊；產(chǎn)羔數(shù)；全基因組關(guān)聯(lián)分析

山羊產(chǎn)羔數(shù)的不斷提高一直是山羊生產(chǎn)的重要目標(biāo)，它關(guān)系到生產(chǎn)效率的提高和生產(chǎn)成本的降低。增加山羊的胎產(chǎn)羔數(shù)，提高生產(chǎn)效益，促進(jìn)養(yǎng)羊業(yè)向持續(xù)環(huán)保發(fā)展道路的轉(zhuǎn)變，作為一個(gè)畜牧大國(guó)和人口大國(guó)的中國(guó)顯得尤為重要。但是山羊的產(chǎn)羔性狀遺傳力較低，是一個(gè)受微效多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，同時(shí)也受一個(gè)或多個(gè)主基因控制，常規(guī)育種手段的運(yùn)用不能在較短時(shí)期內(nèi)取得明顯進(jìn)展，這在很大程度上阻礙了山羊業(yè)的快速發(fā)展。準(zhǔn)確篩選、鑒定產(chǎn)羔性狀主效基因，進(jìn)而進(jìn)行分子育種，成為快速改良和提高山羊產(chǎn)羔數(shù)的前提條件。

目前已有很多學(xué)者對(duì)山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)基因做了研究，包括FSHR[1]、gdf-9[2]和NPY-Y1R等基因[3]，而利用目前較為先進(jìn)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)技術(shù)，開(kāi)展山羊產(chǎn)羔性狀的基因挖掘和定位的研究還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本研究擬采用GWAS技術(shù)對(duì)山羊產(chǎn)羔數(shù)的分子基礎(chǔ)進(jìn)行研究，以期挖掘和定位與山羊產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)的新基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究試驗(yàn)羊只來(lái)自云南省種羊繁育推廣中心云南黑山羊核心群，由6個(gè)公羊家系的302只母羊組成，采集頸靜脈EDTA抗凝血2 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?，記錄試?yàn)羊只第二胎產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測(cè) 按blood genome DNA Extraction kit試劑盒操作流程提取血樣DNA，1×TE緩沖液溶解，用NANO核酸蛋白分析儀檢測(cè)DAN的濃度和質(zhì)量。使DNA 的吸光度OD260 nm/OD280 nm為1.7～2.0，濃度大于50 ng·μL-1、體積大于20 μL的樣品作為基因分型樣品，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SNP基因分型及質(zhì)量控制 將質(zhì)量達(dá)標(biāo)的DNA樣品送至北京斯克爾基因生物技術(shù)有限公司，用美國(guó)Illumina 公司的山羊Iselect Goat60k芯片進(jìn)行SNP分型。

1.2.3 芯片分型流程 包括DNA定量、擴(kuò)增、片段化、片段化DNA沉淀及回收、芯片雜交、芯片清洗、單堿基延伸及染色、芯片掃描、數(shù)據(jù)分析、得出SNP分型結(jié)果。

1.2.4 質(zhì)量控制 使用Plink(1.07) 進(jìn)行質(zhì)量控制[4]，將MAF小于0.05，檢出頻率小于0.9，哈迪-溫伯格平衡卡方檢驗(yàn)將P<1 E-06的SNP位點(diǎn)排除，同時(shí)還排除檢出率<0.9的樣本。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 表型性狀統(tǒng)計(jì)分析 用SAS(8.01)中的CORR過(guò)程對(duì)試驗(yàn)羊只第二胎產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)及羊只出生年度與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析。

1.3.2 群體結(jié)構(gòu)分析 為了消除連鎖不平衡對(duì)個(gè)體間遺傳相關(guān)估計(jì)的偏差，選用常染色體上獨(dú)立的SNPs，應(yīng)用Plink(1.07)全基因組IBS(Identity-by-state)多維度分析[4]，進(jìn)行MDS分析。SNPs篩選時(shí)以25個(gè)位點(diǎn)為一個(gè)窗口，以5 個(gè)位點(diǎn)為步長(zhǎng)，r2設(shè)為0.2，基于得到的獨(dú)立SNP點(diǎn)計(jì)算個(gè)體之間的IBS 距離，應(yīng)用R(V2.13.1)作圖[5]，進(jìn)而進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。

1.3.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析 運(yùn)用PLINK(V1.07)線性回歸模型進(jìn)行產(chǎn)羔性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析。為減少重復(fù)檢驗(yàn)的假陽(yáng)性，使用連鎖不平衡修正的Bonferroni 修正，以25個(gè)位點(diǎn)為一個(gè)窗口，5個(gè)位點(diǎn)為步長(zhǎng)，r2為0.4，得到獨(dú)立的LD 塊和SNP，并據(jù)此進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析值校正。

1.3.4 生物信息分析 應(yīng)用軟件BLAST(2.28+)將潛在關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)上下60 bp序列比對(duì)到參考基因組中[6-7]，得到SNP所在的染色體位置坐標(biāo)， 結(jié)合山羊參考基因組Annotation-GFF文件，查找SNP位置前后500 K的基因，獲得Gene-ID，根據(jù)Gene-ID獲取基因的編碼區(qū)(CDS)序列和pep序列，再用基因的pep序列進(jìn)行Nr庫(kù)注釋，獲取基因的注釋信息。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)羔數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

云南黑山羊二胎產(chǎn)羔數(shù)平均為2.04只，變異系數(shù)為0.75，通過(guò)相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，產(chǎn)羔數(shù)與母羊的出生年齡相關(guān)系數(shù)為0.15，相關(guān)不顯著(P>0.05)，說(shuō)明母羊年齡對(duì)其產(chǎn)羔數(shù)無(wú)影響，因而在后面GWAS分析中采用了線性回歸模型。

2.2 基因分型數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果

經(jīng)質(zhì)控后MAF小于0.05的位點(diǎn)有6 162個(gè)，檢出頻率<0.9的位點(diǎn)有337 個(gè)，哈迪-溫伯格平衡卡方P<0.000 001的位點(diǎn)有327 個(gè)，檢出率<0.9的樣本、排除染色體位置信息不確定點(diǎn)474個(gè)，最終獲得295 個(gè)樣本在45 608 個(gè)位點(diǎn)上的分型結(jié)果(表1)。

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

通過(guò)MDS分析，在常染色體可篩選出15 309個(gè)獨(dú)立的SNPs位點(diǎn)，以計(jì)算的MDS組分1 和組分2 為坐標(biāo)，應(yīng)用R(V2.13.1)繪制群體結(jié)構(gòu)散點(diǎn)圖(圖1)，6個(gè)公羊家系分別用一種顏色表示，由圖1可見(jiàn)同一個(gè)家系個(gè)體幾乎聚集在一起，并未均勻分布，表明存在群體分層，同一家系個(gè)體間的遺傳相關(guān)程度較高。

表1 每條染色體上SNP數(shù)及對(duì)應(yīng)的Bonferroni校正的5%染色體水平顯著閾值

Table 1 Bonferroni-corrected 5% chromosome-wise significance threshold after quality control

染色體Chromosome標(biāo)記數(shù)No.ofSNPs獨(dú)立的標(biāo)記數(shù)No.ofindependentSNPs5%染色體水平顯著閾值5%chromosome-widesignificantthresholdch1293222332.24E-05ch2255019462.57E-05ch3206215023.33E-05ch4216715533.22E-05ch5197013523.70E-05ch6201014333.49E-05ch7194814413.47E-05ch8207015293.27E-05ch9169213313.76E-05ch10189314623.42E-05ch11180912663.95E-05ch12157311684.28E-05ch13147811344.41E-05ch14166512593.97E-05ch1514539885.06E-05ch16143810644.70E-05ch1712709915.05E-05ch1810968535.86E-05ch1911228166.13E-05ch2012959985.01E-05ch2113199565.23E-05ch2210437996.26E-05ch239306487.72E-05ch2411918555.85E-05ch257695658.85E-05ch269487226.93E-05ch278346527.67E-05ch288016467.74E-05ch298676887.27E-05ChX14138266.05E-05Total4560833674

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

使用連鎖不平衡修正的Bonferroni 進(jìn)行修正，得到獨(dú)立的LD 塊和33 674個(gè)獨(dú)立的SNPs用于GWAS分析，據(jù)此得到Bonferroni 修正的達(dá)5%基因組顯著水平的P值為1.48E-6(0.05/33674)，基因組潛在關(guān)聯(lián)閾值為2.97E-5(1/33674)。同時(shí)根據(jù)每條染色體上的獨(dú)立SNPs 數(shù)目，得到每條染色體水平的顯著性閾值(表1)，通過(guò)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)達(dá)到潛在基因組水平顯著差異的SNPs位點(diǎn)共7個(gè)(圖2，表2)。圖2和表2顯示：2個(gè)SNPs位點(diǎn)與山羊產(chǎn)仔數(shù)達(dá)到5%基因組水平顯著相關(guān)(P<1.48E-6)，分別位于SLC4A10基因的下游和TBR1基因的上游；5個(gè)位點(diǎn)達(dá)潛在關(guān)聯(lián)(P<2.97E-5)，分別位于1號(hào)染色體SENP7基因上游，21號(hào)染色體Hypothetical Protein基因的上游，以及28號(hào)染色體WDFY4和TMEM26基因的上游、BICC1基因的下游。

圖1 群體結(jié)構(gòu)多維度分析圖Fig.1 Population structure identification with multidimensional scaling analysis

橫坐標(biāo)為染色體號(hào)，30 代表X 染色體?？v坐標(biāo)為關(guān)聯(lián)分析P 值的-log10 結(jié)果。黑色實(shí)線為達(dá)基因組水平5%顯著閾值線，黑色虛線為達(dá)基因組潛在關(guān)聯(lián)閾值線The scale on the X-axis represents ID of chromosomes.X chromosome is represented by 30.The scale on the Y-axis is the -log10(P-value) score of association analysis.The black solid line is drawn at -log10(1.48E-6) to show those significant at the genome-wide 5% threshold，and the black dashed line indicates genome-wide significance of suggestive association圖2 產(chǎn)羔數(shù)全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖Fig.2 Manhattan plot of genome-wide association analysis for lambing number

3 討 論

全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)是一種利用遍布于生物體基因組中數(shù)以百萬(wàn)的分子標(biāo)記(主要是單核苷酸突變，即SNP)，并借助統(tǒng)計(jì)學(xué)工具對(duì)影響某些復(fù)雜性狀如疾病易感性或重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳變異進(jìn)行鑒定和分析的一種新策略，其基本思想是直接檢測(cè)基因本身或基因附近微小區(qū)域的SNP 標(biāo)記與性狀表型信息的關(guān)聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)基因的精細(xì)定位。目前，GWAS技術(shù)已在奶牛、綿羊、豬、雞等畜種中得以應(yīng)用[8-12]，挖掘出許多與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的新基因，包括繁殖、遺傳抗性、產(chǎn)乳性狀、生長(zhǎng)性狀等重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的新基因，而有關(guān)山羊產(chǎn)羔性狀的GWAS研究則未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

表2 產(chǎn)羔數(shù)Bonferroni 校正的5%染色體水平顯著的SNPs位點(diǎn)信息

Table 2 Bonferroni-corrected 5% chromosome-wide significant SNPs for lambing number

標(biāo)記SNPs染色體Chromosome物理位置BP基因型Allele最近基因NearestgeneP值P-valuesnp20467-scaffold202-4458644234235387T/CSLC4A10(D)8.57E-07snp20468-scaffold202-4490513234267256T/GTBR1(U)8.57E-07snp11435-scaffold1416-3795782840521920T/CWDFY4(U)4.07E-06snp45731-scaffold627-4874627144576529A/GSENP7(U)4.49E-06snp54840-scaffold838-31946002814948614T/CTMEM26(U)1.50E-05snp25958-scaffold2688-2609162165919086T/CHypotheticalProtein(U)1.86E-05snp54781-scaffold838-7287692812482783A/CBICC1(D)1.92E-05

D.SNP位于基因的下游； U.SNP位于基因的上游

D.SNP located in the downstream of the gene；U.SNP located in the upstream of the gene

本研究MDS分析發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)樣本存在群體分層。已有的人類疾病的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，由于祖先的遺傳差異引起疾病和對(duì)照間等位基因頻率的差異造成的群體分層現(xiàn)象，導(dǎo)致標(biāo)記和性狀間的偽關(guān)聯(lián)[13]，利用全基因組標(biāo)記的遺傳信息對(duì)樣本遺傳相關(guān)進(jìn)行估計(jì)，比系譜信息可更真實(shí)的反映個(gè)體間的相關(guān)度，因此本研究GWAS分析時(shí)使用了MDS分析產(chǎn)生的組分1作為協(xié)變量，以校正群體結(jié)構(gòu)對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響[14]，對(duì)應(yīng)的全基因組膨脹系數(shù)由1.14～2.15減小為1～1.05，可以認(rèn)為修正后得到的結(jié)果沒(méi)有受到群體分層等混雜因素的影響。

本研究在生物信息學(xué)分析中均是用差異位點(diǎn)與附近基因的編碼區(qū)進(jìn)行比對(duì)才確認(rèn)SNP位點(diǎn)是位于該基因的上游或下游，因此本研究發(fā)現(xiàn)的與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的基因均是位于功能基因上。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在28號(hào)染色體上有3個(gè)SNPs位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)存在潛在關(guān)聯(lián)，分布在12～40 Mb，這個(gè)區(qū)域內(nèi)有WDFY4、TMEM26及BICC3個(gè)候選基因，但對(duì)這3個(gè)基因的相關(guān)功能研究極少，在山羊中更是未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，所以本研究發(fā)現(xiàn)，它們與山羊的產(chǎn)羔數(shù)存在潛在的關(guān)聯(lián)還需要做大樣本、更為深入的研究，以確保得到的結(jié)論真實(shí)可靠。

本研究結(jié)果可作為山羊產(chǎn)羔性狀的相關(guān)候選區(qū)域和候選基因，也可為山羊產(chǎn)羔性狀的分子機(jī)制研究和今后的標(biāo)記輔助選擇的開(kāi)展提供新的研究線索和理論基礎(chǔ)。但本研究由于經(jīng)費(fèi)及時(shí)間所限，只采用了302只云南黑山羊作為試驗(yàn)樣本，因此所獲候選區(qū)域及基因仍然需要進(jìn)行更大樣本的重復(fù)驗(yàn)證，以確保今后在分子育種中應(yīng)用的準(zhǔn)確性和效率。

4 結(jié) 論

本研究鑒定出位于2號(hào)染色體上的SLC4A10和TBR1基因?yàn)橛绊懮窖虍a(chǎn)羔性狀的重要候選基因；28號(hào)染色體12～40 Mb的區(qū)域內(nèi)分布的WDFY4、TMEM26和BICC1基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔數(shù)有潛在的影響。

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(編輯 郭云雁)

Genome-wide Association Study of Lambing Number in Goat

LAN Rong1，ZHU Lan1，YAO Xin-rong2，WANG Peng2，SHAO Qing-yong1，HONG Qiong-hua1*

(1.YunnanInstituteofAnimalScienceandVeterinary，Kunming650224，China；2.SheepBreedingPromotionCenterinYunnanProvince，Xundian650000，China)

The aim of this study was to find and map novel genes related to lambing number in goat by genome-wide association study(GWAS).A total of 302 Yunnan Black goats from 6 families were genotyped by Illumina Goat60K iSelect array.The GWAS on goat lambing number was performed.The Results showed that 2 SNPs located at the downstream ofSLC4A10 and upstream ofTBR1 on chromosome 2 were significantly associated with lambing number (P<1.48E-6) at 5% genome-wide level.Five SNPs were suggestive associated with lambing number (P<2.97E-5).These 5 SNPs were located on chromosome 1，21，28，respectively，includingSENP7，Hypothetical Protein，WDFY4，TMEM26 andBICC1 genes.These genes and SNPs offer essential information for understanding the molecular mechanisms of lambing number and provide foundation for the application of marker-assisted selection in breeding program of goat.

Yunnan Black goat；lambing number；genome-wide association study

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.006

2014-07-02

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-39)；云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014BB014)

蘭 蓉(1969-)，女，云南人，副研究員，碩士，主要從事家畜分子遺傳育種研究，E-mail:rtlankitty@163.com

*通信作者：洪瓊花，研究員，E-mail:yxh7168@126.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2015)04-0549-06