N2a細胞增殖的癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的致病特性分析

吳曉東，鄒艷麗，劉雨田，李金明，張永強，劉 珊，王志亮*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 國家外來動物疫病研究中心 國家BSE參考實驗室，青島 266032)

N2a細胞增殖的癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的致病特性分析

吳曉東1，2，鄒艷麗2，劉雨田2，李金明2，張永強2，劉 珊2，王志亮2*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 國家外來動物疫病研究中心 國家BSE參考實驗室，青島 266032)

為鑒定細胞體外增殖的癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的致病特性，包括致病性和株系特征等，用RML感染的N2a(Sc-N2a)細胞裂解物接種C57BL/6J小鼠進行研究。結(jié)果顯示：經(jīng)(200±28) d的潛伏期后，C57BL/6J小鼠全部發(fā)病死亡，臨床癥狀均表現(xiàn)為共濟失調(diào)，而接種N2a細胞裂解物的C57BL/6J小鼠與接種Sc-N2a細胞裂解物的PrP基因敲除小鼠均正常存活。Sc-N2a細胞增殖的PrPSc與發(fā)病小鼠腦組織中PrPSc具有同樣的糖基化模式，三種糖基化PrPSc具相同的遷移率，而且均是以單糖基化形式為主。發(fā)病小鼠的病理學(xué)研究結(jié)果顯示：腦部的海綿狀空泡主要分布于腦干、大腦、小腦、丘腦；腦部的PrPSc主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦，在小腦、四迭體、嗅球有少量的分布。小鼠回歸試驗表明：Sc-N2a細胞增殖的PrPSc對小鼠具致病性，并保留RML的株系特征，是TSEs研究的理想細胞模型。

N2a細胞；癢病小鼠適應(yīng)毒株RML；PrPSc；致病性；株系特征

傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathies，TSEs)是動物和人的一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性、退化性、致死性疾病，包括牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)、羊癢病(scrapie)、人的克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)等。TSEs的病原為宿主基因編碼的蛋白質(zhì)(PrPC)的異構(gòu)體(PrPSc)，稱為朊病毒(Prion)[1-2]，變構(gòu)過程在蛋白質(zhì)翻譯后發(fā)生。

TSEs特征性的病理變化是神經(jīng)纖維網(wǎng)空泡化、神經(jīng)元損傷、朊病毒大量積聚等，而且具有明顯的宿主種屬特異性及朊病毒的株系特異性[3-4]，不同株系PrPSc的蛋白酶消化位點及其糖基化模式有所區(qū)別。小鼠是TSEs研究中最常用動物模型，具易操作、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景清晰、發(fā)病潛伏期短等優(yōu)點。目前，用于區(qū)分株系的方法仍主要基于小鼠試驗，即各毒株經(jīng)特定基因型小鼠連續(xù)傳代后的臨床癥狀、潛伏期及其神經(jīng)病理學(xué)等方面特征。體外培養(yǎng)的細胞也可感染并持續(xù)增殖PrPSc，也已廣泛用作TSEs亞細胞水平研究的模型，具傳代周期超短、持續(xù)感染等優(yōu)點。以細胞模型為研究工具，對PrPSc轉(zhuǎn)變的分子機制、亞細胞水平定位、種間障礙決定因子、具診斷學(xué)意義的TSEs標志物、治療藥物做了大量探索[5-9]。

本研究以癢病小鼠適應(yīng)毒株RML成功感染N2a細胞，連續(xù)傳代后仍能穩(wěn)定增殖PrPSc，隨后用感染細胞的裂解物進行小鼠腦內(nèi)接種試驗，證實感染細胞增殖的PrPSc對小鼠具有致病性，并保留了RML的株系特征。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞

癢病小鼠適應(yīng)毒株RML系由R.L.Chandler將綿羊癢病病料接種小鼠后獲得[10]，之后落基山實驗室(Rocky Mountain Laboratory)利用該毒株開展了大量研究工作，因此將毒株命名為RML。本實驗室將RML腦內(nèi)接種C57BL/6J小鼠，連續(xù)傳3代后收獲發(fā)病死亡小鼠腦組織，供細胞感染用。小鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞(N2a)購自中國科學(xué)院細胞資源中心。

1.2 實驗動物

6周齡清潔級雌性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，PrP基因敲除小鼠(PrP0/0mice，ZurichⅠ型)引自瑞士蘇黎世大學(xué)。動物試驗在ABSL-3實驗室進行。

1.3 抗體和主要試劑

抗PrP單抗1H2由本實驗室研制[11]，辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗鼠IgG抗體購自Sigma公司。高糖型DMEM、胎牛血清購自Gibco公司。細胞裂解液(M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent)購自Pierce公司，蛋白酶K(Proteinase K，PK)、苯甲基磺酰氟(PMSF)購自Amreco公司，免疫組化顯色試劑盒(ChemMateTMAEC/H2O2substrate solution)購自Dako公司，化學(xué)發(fā)光底物(LumiGLO?Chemiluminescent Substrate)購自KPL公司，底片(X-Omat BT film)購自Kodak公司，PVDF膜購自Millipore公司。

1.4 細胞感染

癢病小鼠適應(yīng)毒株RML感染小鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞(N2a)按N.Nishida等的方法進行[12]。N2a細胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為添加10%滅能胎牛血清的高糖型DMEM。待接種的N2a細胞(25 cm2細胞瓶)單層融合長至50%，傾去培養(yǎng)基，DMEM洗滌2次，加入2.5 mL 2%癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的腦勻漿(DMEM稀釋)，37 ℃、5%CO2條件下孵育4 h，再加入2.5 mL的10%DMEM孵育20 h后，置換成10%DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按1∶3的比例分瓶，連續(xù)傳20代。免疫印跡試驗檢測RML感染的N2a(Sc-N2a)細胞PrPSc的增殖情況。

1.5 動物接種

N2a、Sc-N2a細胞采用75 cm2細胞瓶培養(yǎng)，當(dāng)細胞單層長至90%，將細胞刮下，懸浮于1 mL·瓶-1PBS中，凍融4次，臺式高速離心機(SORVALL Pico，Kendro公司)2 000 r·min-1離心5 min后取上清，置-80 ℃?zhèn)溆?，用于動物接種。動物分成3組接種：No.1組10只6周齡C57BL/6J小鼠，腦內(nèi)注射Sc-N2a細胞裂解產(chǎn)物；No.2組10只6周齡C57BL/6J小鼠，腦內(nèi)注射N2a細胞裂解產(chǎn)物，作為正常細胞對照組；No.3組10只6周齡PrP基因敲除小鼠，腦內(nèi)注射Sc-N2a細胞裂解產(chǎn)物，作為感染細胞對照組。接種量均約為25 μL·只-1。接種后的小鼠持續(xù)觀察至其發(fā)病死亡，發(fā)病時間以出現(xiàn)共濟失調(diào)、弓背等明顯臨床癥狀的時間為準。

1.6 病理學(xué)檢查

發(fā)病小鼠頻臨死亡的時候脫椎致死，隨即采集腦組織，用10%的福爾馬林(3.7%～4%甲醛)固定后，按常規(guī)程序制備5～10 μm厚的石蠟切片，采用蘇木素伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)染色；用于免疫印跡試驗的新鮮腦組織樣品用PBS制成相對體積質(zhì)量10%腦勻漿，置-80 ℃保存。對照組小鼠在接種后210 d進行采樣，處理程序同上。腦組織石蠟切片按常規(guī)方法進行HE染色，顯微鏡觀察空泡變化及其分布特征。免疫組化染色程序如下：脫臘至水→PK消化→水化高壓→內(nèi)源酶的滅活→封閉→抗PrP單抗1H2孵育→顯色→蘇木素復(fù)染→封片，顯微鏡觀察特征性的染色顆粒及其分布特征。

1.7 免疫印跡試驗

細胞(75 cm2細胞瓶×1)單層融合長至90%，將細胞刮下，加入200 μL細胞裂解液，冰浴條件輕搖10 min裂解細胞，13 000 r·min-1離心(SORVALL Pico，Kendro公司)20 min，沉淀用40 μL PBS懸浮，取20 μL與5 μL 5×PK buffer(50 mmol·L-1Tris-Cl (pH 7.5)，25 mmol·L-1EDTA，1.25% SDS)混合后，25 μg·mL-1PK在37 ℃水浴條件下消化30 min，終濃度1 mmol·L-1PMSF終止消化反應(yīng)，加入等體積的2×上樣緩沖液(100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 6.8，含10%glycerol，4%SDS，200 mmol·L-1DTT)，煮沸5 min，樣品經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜(Millipore公司)，TBST(10 mmol·L-1Tris，150 mmol·L-1sodium chloride，0.1%Tween-20，pH7.4)配制的2%BSA封閉過夜，工作濃度的抗PrP單抗1H2室溫孵育1 h，TBST洗滌5遍，工作濃度的辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗鼠IgG抗體室溫孵育1 h，TBST洗滌5遍，化學(xué)發(fā)光底物作用1 min后，與底片曝光2 min，洗片。質(zhì)量濃度10%腦勻漿樣品的PK消化、免疫印跡試驗程序同上。

2 結(jié) 果

2.1 Sc-N2a細胞增殖PrPSc的免疫印跡鑒定

免疫印跡試驗結(jié)果顯示：癢病小鼠適應(yīng)毒株RML成功感染N2a，連續(xù)傳代后仍能穩(wěn)定增殖PrPSc，獲得持續(xù)感染RML的Sc-N2a細胞。N2a細胞的PrP可被PK完全消化，而Sc-N2a細胞裂解物中檢測到可抗PK消化的PrP27-30(圖1)，呈現(xiàn)3條帶，自上往下依次是雙糖基化、單糖基化、無糖基化3種類型，三種糖基化形式所占比例不同，單糖基化形式的含量最高。

圖1 癢病小鼠適應(yīng)毒株RML感染的N2a細胞中PrPSc的免疫印跡鑒定Fig.1 Immunodetection of PK-resistant PrP in N2a lysates infected with Scrapie strain RML

Sc-N2a細胞與N2a細胞在形態(tài)上存在差異，N2a細胞形態(tài)均一，而Sc-N2a細胞具多形性且多數(shù)具有突觸(圖2)。

2.2 小鼠發(fā)病情況

No.1組腦內(nèi)接種Sc-N2a細胞裂解產(chǎn)物的C57BL/6J小鼠全部發(fā)病死亡，接種小鼠的潛伏期為(200±28)d；最初癥狀表現(xiàn)為運動減少、精神萎靡，隨之呈現(xiàn)特征性的“共濟失調(diào)”，最后后肢麻痹，直至死亡(圖3)；整個病程中，體重持續(xù)下降，有的伴有單側(cè)性失明、大小便失禁等癥狀。No.2組腦內(nèi)注射正常細胞裂解產(chǎn)物，所有注射C57BL/6J小鼠無任何異常。No.3組腦內(nèi)接種Sc-N2a細胞裂解產(chǎn)物，所有接種PrP基因敲除小鼠無任何異常。

小鼠腦內(nèi)接種試驗證實：Sc-N2a細胞增殖PrPSc對野生型小鼠具致病性，可致接種野生型小鼠100%發(fā)病死亡；PrP基因敲除小鼠可完全抵抗PrPSc的感染[13]。

2.3 小鼠腦組織PrPSc的免疫印跡鑒定

No.2組小鼠的腦勻漿經(jīng)PK消化后沒有任何條帶，而No.1組小鼠的腦勻漿中檢出具PK抗性的PrPSc(圖4)。

發(fā)病小鼠腦勻漿中PrPSc的免疫印跡圖譜展示了與細胞型PrPSc相同的糖基化模式(圖1)，三種糖基化形式PrPSc具相同的遷移率，而且都是以單糖基化形式為主。

A.N2a細胞；B.Sc-N2a細胞A.N2a cell lines；B.Sc-N2a cell lines圖2 N2a及Sc-N2a細胞形態(tài)(200×)Fig.2 The morphology of N2a cell lines and Sc-N2a cell lines (200×)

A.發(fā)病小鼠后肢無法支撐；B.發(fā)病小鼠前肢無法支撐A.Mouse does not support itself with rear legs；B.Front limb extends below grid圖3 發(fā)病小鼠的臨床癥狀Fig.3 Clinically positive scrapie-injected mice on grid

1.No.2組小鼠腦勻漿(PK消化前)；2.No.2組小鼠腦勻漿(PK消化后)；3.No.1組發(fā)病小鼠腦勻漿(PK消化前)；4.No.1組發(fā)病小鼠腦勻漿(PK消化后)1.Brain homogenates from No.2 non-infected C57BL/6J mice without PK digested；2.Brain homogenates from No.2 non-infected C57BL/6J mice with PK digested；3.Brain homogenates from No.1 infected C57BL/6J mice without PK digested；4.Brain homogenates from No.1 infected C57BL/6J mice with PK digested圖4 小鼠腦勻漿中PrPSc的免疫印跡鑒定Fig.4 Immunodetection of PK-resistant PrP in brain homogenates infected with prion strain RML from N2a

上述結(jié)果說明：Sc-N2a細胞增殖PrPSc保留癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的糖基化模式。

2.4 小鼠腦組織的病理學(xué)變化

腦組織的海綿狀空泡變化、神經(jīng)元減少、神經(jīng)膠質(zhì)增生是Prion疾病的普遍特征，腦部病理學(xué)變化的分布及其嚴重程度具有明顯的株系特異性。No.1組發(fā)病小鼠的腦組織中出現(xiàn)典型的空泡病變，No.2、3組小鼠的腦組織沒有空泡變化。空泡的分布特點如下：腦干、大腦、小腦、丘腦的空泡較多(圖5)，海馬、基底前腦、四迭體的空泡較少，空泡的大小不一。腦干、大腦、丘腦的空泡呈現(xiàn)彌散性分布，小腦的空泡集中分布在白質(zhì)，在顆粒層有零星的分布。

2.5 小鼠腦組織的免疫組化染色

No.1組發(fā)病小鼠腦組織中PrPSc主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦，四迭體、小腦有少量分布，大腦的白質(zhì)、海馬的顆粒細胞層、小腦的髓質(zhì)未見有PrPSc。大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦中的PrPSc呈彌散性分布，丘腦中可觀察到較多的斑塊狀染色(圖6)。

A.腦干；B.大腦皮質(zhì)；C.小腦；D.丘腦；標尺=200 μmA.Brain stem；B.Cortex；C.Cerebellum；D.Thalamus；Scale bar=200 μm圖5 發(fā)病小鼠腦組織中空泡樣病理變化(HE)Fig.5 Histological features of brain tissues infected with RML (HE)

A.大腦皮質(zhì)；B.海馬；C.丘腦；D.小腦；標尺=200 μmA.Cortex；B.Hippocampus；C.Thalamus；D.Cerebellum；Scale bar=200 μm圖6 發(fā)病小鼠腦組織中PrPSc的分布(IHC)Fig.6 PrPSc immunohistochemistry features of brain tissues infected with RML (IHC)

3 討 論

來自動物及人類的TSEs病料初次接種小鼠，往往采用10%的腦勻漿作為接種體，腹膜內(nèi)和腦內(nèi)聯(lián)合接種的方法。成功感染小鼠的毒株，在同一基因型的小鼠連續(xù)傳代后，所表現(xiàn)出來的特征可定義為該小鼠適應(yīng)毒株的株系特征。R.L.Chandler將癢病病料接種CD-1小鼠連續(xù)傳代，獲得癢病小鼠適應(yīng)毒株RML。通過本研究，作者成功獲得持續(xù)感染癢病小鼠適應(yīng)毒株RML的N2a細胞(Sc-N2a)，經(jīng)連續(xù)傳代后，仍然能穩(wěn)定的增殖PrPSc，Sc-N2a細胞的形態(tài)明顯有別于N2a細胞，具明顯的多形性。Sc-N2a細胞裂解產(chǎn)物腦內(nèi)接種C57BL/6J小鼠，經(jīng)200 d左右的潛伏期后，小鼠全部發(fā)病死亡，證實了Sc-N2a細胞增殖的PrPSc對野生型小鼠具有致病性，構(gòu)建成功癢病細胞模型。在細胞水平進行抗Prion藥物以及檢測標志物篩選，不僅具有周期超短、操作簡單以及結(jié)果確實等優(yōu)點，而且可以進行大規(guī)模篩選。此外，在細胞水平進行改造，遠比在小鼠等實驗動物層面進行操作簡單、經(jīng)濟，例如改變PrPC表達水平、敲除相關(guān)基因、插入外源基因等，為PrPC生理功能、PrPSc轉(zhuǎn)變機制等探索性研究提供了高效細胞平臺。

癢病感染小鼠的腦部病理學(xué)特征非常明顯，不同的癢病毒株的腦部神經(jīng)病理學(xué)分布有其獨特的模式，稱為“l(fā)esion profiles”[14-15]，是癢病“株系特征”最為重要的表型，通常認為病理特征與首次接種的劑量無相關(guān)性。癢病小鼠適應(yīng)毒株RML雖已廣泛用于朊病毒研究[16-20]，但對該毒株神經(jīng)病理學(xué)特征的研究仍不全面。本研究對細胞增殖RML的神經(jīng)病理學(xué)變化進行了詳盡的研究，獲得了RML最為詳盡的“l(fā)esion profiles”，包括腦部空泡分布特點以及PrPSc的沉積特點，可為其基于該毒株的相關(guān)研究提供參考依據(jù)。有學(xué)者稱神經(jīng)纖維網(wǎng)中的空泡分布與PrPSc的分布應(yīng)是一致的[21]，與作者的試驗結(jié)果相左，其中原因有待進一步考證。株系特征還體現(xiàn)在糖基化程度、潛伏期、臨床癥狀等方面。不同株系的PrPSc糖基化差異與TSEs的表型密切相關(guān)[22-23]，而且由于其PK消化位點的差異，所以不同株系PrPSc酶切后片段的電泳圖譜也相應(yīng)地具其株系特征[24]。BSE株系的PrPSc具高水平的雙糖基化，低水平的單糖基化，多數(shù)癢病株系則以單糖基化為主。作者對細胞及腦組織來源的PrPSc的糖基化模式也做了鑒定，結(jié)果顯示兩種來源的PrPSc的電泳圖譜完全一致，PK消化位點沒有發(fā)生改變，且都是以單糖基化為主，說明癢病小鼠毒株RML的株系特征在傳代細胞系上得以保留。癢病小鼠適應(yīng)毒株的潛伏期決定于下面幾個相互影響的因素：接種劑量、接種途徑、小鼠PRNP基因。本研究中攻毒的小鼠全部發(fā)病，并均表現(xiàn)出癢病特征性的“共濟失調(diào)”癥狀。盡管采用了腦內(nèi)接種途徑，但由于Sc-N2a細胞裂解產(chǎn)物中PrPSc的含量偏低，且為初次傳代，所以導(dǎo)致潛伏期有所延長，這并非是RML毒株的株系特征發(fā)生變化。

TSEs株系的分子基礎(chǔ)至今仍在探索中，單一的PrP序列可轉(zhuǎn)變成多種類型的PrPSc，每種都可導(dǎo)致不同的病理表型[3-4]，但目前多數(shù)學(xué)者傾向于認同“株系特征”信息隱含于PrPSc特殊結(jié)構(gòu)中，究竟TSEs毒株以何種方式攜帶并復(fù)制“株系特征”信息仍不清楚。本研究獲得的癢病毒株感染細胞，可繼續(xù)用于下一步TSEs株系的相關(guān)研究。

4 結(jié) 論

成功用癢病小鼠適應(yīng)毒株RML持續(xù)感染N2a細胞，小鼠回歸試驗表明Sc-N2a增殖的PrPSc具致病性，并保留了該毒株的株系特征，是TSEs研究的理想細胞模型。

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(編輯 白永平)

Pathogenic Characteristics of Mouse-adapted Scrapie Strain RML Propagated in N2a Cell Line

WU Xiao-dong1，2，ZOU Yan-li2，LIU Yu-tian2，LI Jin-ming2，ZHANG Yong-qiang2， LIU Shan2，WANG Zhi-liang2*

(1.SchoolofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China； 2.NationalBSEReferenceLab，NationalResearchCenterforExoticAnimalDiseases，ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032，China)

To identify the pathogenic characteristics of mouse-adapted Scrapie Strain RML propagated in N2a cell line，we intracerebrally inoculated mice with the lysate of Sc-N2a cell culture.After 200±28 days’ incubation period，all inoculated C57BL/6J mice appeared typical ataxia symptoms of TSEs.The PrPScfrom both brain tissues and Sc-N2a cells shared the same biochemical aspects.Western blotting result confirmed that they had the same glycosylation patterns，the same size distribution of PK digestion fragments，with higher levels of monoglycosylated.The pathological changes of brain sections from inoculated mice at the terminal stage were analyzed by HE stain and IHC assay.Vacuoles were mainly found in brain stem，cortex，cerebellum and thalamus，while PrPScdeposits mainly in cortex，hippocampus，thalamus，cerebellum.The results of mouse regression test showed that the PrPScpropagated in N2a cell line had pathogenicity，and kept the the stain characteristics of mouse-adapted scrapie strain RML.The Sc-N2a cell line is an ideal model for the study of TSEs.

N2a cell line；mouse-adapted scrapie strain RML；PrPSc；pathogenicity；strain characteristics

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.012

2014-10-28

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX08008-001B)

吳曉東(1975-)，男，江蘇宿遷人，副研究員，主要從事重大外來動物疫病的綜合防控技術(shù)研究，E-mail：wuxiaodong@cahec.cn

*通信作者：王志亮，研究員，Tel：0532-85639166，E-mail：wangzhiliang@cahec.cn

S852.659.7

A

0366-6964(2015)02-0257-07