豬SOCS4基因的克隆、生物信息學(xué)分析及熱應(yīng)激條件下的表達(dá)

王 萍，巨向紅，雍艷紅，賈汝敏，馬銘龍，趙云濤，廖 明

(1.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，湛江 524088； 2.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湛江 524088；3.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642； 4.廣東海洋大學(xué)現(xiàn)代生化中心，湛江 524088；

5.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

豬SOCS4基因的克隆、生物信息學(xué)分析及熱應(yīng)激條件下的表達(dá)

王 萍1，巨向紅2,3，5*，雍艷紅2，賈汝敏1，馬銘龍1，趙云濤4，廖 明3，5

(1.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，湛江 524088； 2.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湛江 524088；3.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642； 4.廣東海洋大學(xué)現(xiàn)代生化中心，湛江 524088；

5.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

旨在研究和系統(tǒng)闡述熱應(yīng)激誘發(fā)豬免疫抑制及炎性因子紊亂的發(fā)生機(jī)理。本研究克隆了土雜(陸川豬×長白豬)豬SOCS4基因，發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框(ORF)長1 326 bp，編碼441個(gè)氨基酸，N端包含285個(gè)氨基酸，與長白豬、牛、山羊、貓、馬、犬、人和小鼠的氨基酸序列同源性分別為100.0%、96.1%、96.1%、95.2%、94.6%、94.3%、93.0%和88.1%；蛋白分子量為50.5 ku，等電點(diǎn)(PI)為6.60。熒光定量PCR結(jié)果顯示，高溫條件下，第3和第9天胸腺組織上SOCS4 mRNA顯著上調(diào)表達(dá)(P≤0.05)，而在第1和第6天的腸系膜淋巴結(jié)中極顯著上調(diào)表達(dá)(P≤0.01)。與上述組織不同，SOCS4 mRNA在小腸和脾組織中卻顯著下調(diào)表達(dá)(P≤0.05)。本研究成功克隆了土雜豬SOCS4基因，發(fā)現(xiàn)其在高溫條件下的表達(dá)量發(fā)生明顯改變，并呈組織和時(shí)間依賴性。

豬;SOCS4;克隆;熒光定量;熱應(yīng)激

熱應(yīng)激已成為我國南方地區(qū)應(yīng)激性致病因素中危害最大的一種，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。其使豬的生長速度下降、料耗增加和免疫能力降低[2-3]，從而對(duì)各類傳染性疫病的敏感性增高[4]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激破壞豬T淋巴細(xì)胞亞群平衡、上調(diào)Toll樣受體(TLR)2、TLR4和TLR4選擇性剪切體的表達(dá)，而炎性因子IL-2、IFN-γ和IL-12的表達(dá)也發(fā)生改變，出現(xiàn)明顯的炎性因子紊亂現(xiàn)象[3，5-9]。系統(tǒng)闡述這些現(xiàn)象發(fā)生的分子機(jī)理是熱應(yīng)激防控的關(guān)鍵。

細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)是一類胞內(nèi)受體信號(hào)調(diào)節(jié)因子，參與信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控，是炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中重要的調(diào)控蛋白[10-11]。目前已發(fā)現(xiàn)的SOCS家族成員有8種，分別為SOCS1-7和CIS[12]。該家族成員之間結(jié)構(gòu)相似，均具有中央SH2區(qū)和C末端的SOCS box區(qū)，因N末端的長度不一而功能各異[13]。研究發(fā)現(xiàn)，在SOCS家族中，僅SOCS1和SOCS3的N末端具有特異的保守KIR區(qū)，該結(jié)構(gòu)具有阻斷JAKs催化位點(diǎn)從而抑制其活性的功能[14-15]。另外，盡管同家族中的SOCS4、SOCS5、SOCS6和SOCS7均具有較長的N末端，但僅SOCS4和SOCS5的N末端存在一段保守區(qū)(N-terminal conserved region，NTCR4-5)[16]。

據(jù)報(bào)道，SOCS4不僅在顆粒細(xì)胞分化過程中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)功能，參與卵泡的發(fā)育調(diào)控[17-18]， 還在調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(Epidermal growth factor，EGF)[19]和IL-4[20]受體的相互作用上扮演重要的作用。但目前有關(guān)SOCS4在免疫調(diào)控中的作用及其N端NTCR4-5保守區(qū)的功能研究報(bào)道鮮見。探討應(yīng)激條件下SOCS4在中樞免疫系統(tǒng)和黏膜免疫系統(tǒng)中的表達(dá)規(guī)律，可能有助于闡述其在熱應(yīng)激致病過程中的作用機(jī)理。鑒于此，本研究以對(duì)熱帶亞熱帶氣候條件下有較強(qiáng)適應(yīng)性的本地土雜豬(陸川豬×長白豬)為研究對(duì)象，克隆SOCS4基因，分析其結(jié)構(gòu)特征，研究其在熱應(yīng)激豬的胸腺、脾、腸系膜淋巴結(jié)和小腸組織中的表達(dá)變化，為進(jìn)一步闡述SOCS4 N末端功能和系統(tǒng)闡述SOCS4在應(yīng)激誘發(fā)豬免疫抑制中的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 15頭3～4月齡健康去勢土雜豬(長白豬×陸川豬)購自湛江某豬場，體重40 kg左右。飼養(yǎng)于人工氣候溫室中(環(huán)境溫度：(35±1)℃)，24 h不間斷供熱。受試豬自由飲水，每日飼喂3次，早、中、晚各1次。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)參照其他豬種。

1.1.2 主要試劑 Trizol、 Sample Protector、 pMD18-T載體、 ExTaq Mix酶、 DEPC、 DNA Marker DL-2000、 6×loading Buffer、 PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA(gDNA) Synthesis Kit、SYBR@Prime Script RT-PCT Kit II均購自TaKaRa公司。Plasmid Mini Kit I、 Gel Extraction Kit購自O(shè)MEGA公司。瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購于OXOID公司。氨芐青霉素購自上海生工生物工程公司。大腸桿菌工程菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。Gold View核酸染料購自賽百盛公司。其他國產(chǎn)分析純?cè)噭┚徸詮V州化學(xué)制劑廠。

1.1.3 主要儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)。梯度PCR儀、 水平電泳槽、 Chromo 4熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。BioPhotometer plus核酸蛋白分析儀(德國Eppendorf公司)，超低溫冰箱(日本三洋)，GDS-800凝膠成像系統(tǒng)(美國UPV公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 分別在高溫處理開始后的第0、1、3、6和9天屠宰受試豬，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3頭。分別采取脾、胸腺、空腸和小腸等組織，液氮速凍后存于-80 ℃低溫冰箱，用于qRT-PCR。基因克隆所用樣品與試驗(yàn)對(duì)照組樣品均采自第0天的受試豬。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank登錄的豬SOCS4基因序列(HM565936.1)和GAPDH基因序列(AF017079.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和熒光定量PCR引物(表1)，設(shè)計(jì)好的引物交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

劉蜀貝在《比較文學(xué)：語文教學(xué)應(yīng)有的開放視野》一文中指出，“比較文學(xué)作為研究文學(xué)的一種理念和方法，在中學(xué)語文教學(xué)中的普及和應(yīng)用，對(duì)當(dāng)前的語文教學(xué)改革有著非常積極的影響”。[9]具體到教學(xué)實(shí)踐，他認(rèn)為：

表1 PCR引物序列

Table 1 PCR primers used in present study

引物名稱Name引物序列(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm大小/bpSize用途PurposeSOCS4F:ATCCAGAAGAAATATCCTACTGR:CTAGCATTGTTGTTCTGGTG591400克隆SOCS4F:CAGTTACTCGGACAGCCCTAGTR:CTGTGGCCACAGGAATGATCTA58156定量GAPDHF:GAAGGTCGGAGTGAACGGATR:GGGTAGAATCATACTGGAACA58149定量

1.2.3 RNA提取 TRIZOL法提取各組織總RNA,具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。提取的總RNA用DEPC水充分溶解，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RT-PCR

1.2.4.1 目的片段的擴(kuò)增：根據(jù)PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，具體步驟按說明書進(jìn)行。擴(kuò)增體系(50 μL)：cDNA溶液2.0 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1.0 μL，下游引物(10 μmol·L-1)1.0 μL，Master Mix(2×)25 μL，dH2O 21 μL。擴(kuò)增參數(shù)： 94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s， 退火30 s， 72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存產(chǎn)物。

1.2.4.2 產(chǎn)物回收與轉(zhuǎn)化：產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gel Extraction Kit回收目的片段，將回收的目的片段與pMD18-T載體連接(參考說明書)，后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞涂布于預(yù)先加入Amp的LB瓊脂平板，37 ℃過夜。

1.2.4.3 重組質(zhì)粒鑒定與測序：挑選白色單菌落接種于10 μL LB液體培養(yǎng)基，參照以上反應(yīng)條件，取1 μL菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測結(jié)果為陽性時(shí)，將剩余9 μL接種于加有Amp(100 μg·μL-1)的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 160 r·min-1振蕩培養(yǎng)13～16 h。按照Plasmid Mini Kit I說明書抽提質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒送往英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

1.2.4.4 生物信息學(xué)分析：利用NCBI在線ORF Finder軟件查找豬SOCS4開放閱讀框，利用DNAStar軟件翻譯ORF核苷酸序列，用Clustal X1.81軟件與GenBank上已發(fā)表的長白豬、人、小鼠和牛SOCS4的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，并用Box Shade作圖。Predictprotein(http://www.predictprotein.org/)預(yù)測SOCS4蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，ESyPred3D Web Server 1.0同源建模預(yù)測SOCS4三維結(jié)構(gòu)；通過ExpAsy的Protscale程序計(jì)算疏水性；通過NCBI CDD在線預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域；TargetP 1.1 Server軟件預(yù)測亞細(xì)胞定位。

1.2.5 熒光定量PCR 熒光定量反應(yīng)體系：10.0 μL SYBR Premix Ex Taq II (2×)，0.4 μL上游引物(20 μmol·L-1)，0.4 μL下游引物(20 μmol·L-1)，2.0 μL cDNA模板，7.2 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)后對(duì)體系中熒光信號(hào)進(jìn)行檢測。采用相對(duì)定量，用2-ΔΔCt法來計(jì)算SOCS4在各個(gè)組織的表達(dá)量，用SPASS軟件進(jìn)行顯著性分析。將所得數(shù)據(jù)與第0天對(duì)照組經(jīng)過歸一化處理，處理組以對(duì)照組的倍數(shù)表示并作圖。

2 結(jié) 果

2.1 豬SOCS4基因的克隆

2.2 豬SOCS4基因序列特征

克隆得到土雜豬SOCS4 ORF全長1 326 bp，編碼441個(gè)氨基酸，蛋白分子量為50.5 ku，等電點(diǎn)(PI)6.60。NCBI在線CDD蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件檢測結(jié)果顯示，克隆序列完整，具有SOCS家族特有的保守結(jié)構(gòu)域SH2區(qū)與SOCS box區(qū)(圖2)。不同物種氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SOCS4 N末端存在一段保守序列mSOCS470-151(圖3黃色區(qū)域)。

圖1 SOCS4質(zhì)粒 PCR電泳圖Fig.1 The electrophoresis result of PCR product of SOCS4 plasmid

2.3 豬SOCS4基因同源性分析

利用DNAMAN軟件中的多序列比對(duì)程序，將測序結(jié)果與長白豬(HM565936.1)、牛(NM_001076218.2)、山羊(XM_005685884.1)、貓(XM_004001462.1)、馬(XM_005605169.1)、犬(XM_003435136.3)、人(NM_199421.1)和小鼠(BC_117814.1)進(jìn)行同源性比對(duì)，分析結(jié)果顯示分別為100.0%、96.1%、96.1%、95.2%、94.6%、94.3%、93.0%和88.1%(表2)。

對(duì)不同物種SOCS4氨基酸序列遺傳距離進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)本地土雜豬與長白豬遺傳距離為0，與牛、羊距離次之，為0.039，而與小鼠最遠(yuǎn)，為0.119。

2.4 疏水性分析

利用ExpAsy的Protscale程序計(jì)算豬SOCS4的疏水性并作圖(圖4)?？梢奡OCS4蛋白在275、276和374位疏水性最強(qiáng)。同時(shí)存在兩個(gè)明顯的親水區(qū)，在247位親水性最強(qiáng)。

圖2 SOCS4保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 The conserved domain region of SOCS4

表2 土雜豬SOCS4氨基酸序列與其他動(dòng)物的同源性比較

Table 2 The identical alignment of amino acid sequence of TZ pig SOCS4 compared with other animals

%

圖中綠、紅、黃色區(qū)域分別代表SOCS box、SH2和N末端保守域1(NTCR4-5).1.LKQKLQDAVG；2.HISELM；3.DLAFRWHFIKR)Regions marked with green，red and yellow displayed the SOCS box，SH2 and N-terminal conserved region 1(NTCR4-5).1.LKQKLQDAVG；2.HISELM；3.DLAFRWHFIKR)，respectively圖3 SOCS4在本地土雜豬與幾種哺乳動(dòng)物間的氨基酸序列同源對(duì)比圖Fig.3 Identical alignment of the amino acid sequence of the local TZ pig with the corresponding parts of cattle(NM_001076218.2)，human(NM_199421.1) and mouse(BC117814.1) SOCS4 proteins

2.5 亞細(xì)胞定位

TargetP1.1預(yù)測結(jié)果表明，SOCS4蛋白非葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Chloroplast transit peptide，cTP)和線粒體導(dǎo)肽(Mitochondrial targeting peptide，mTP)，也不是分泌通道信號(hào)肽(Secretory pathway signal peptide，SP，圖5)。

2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)與三維結(jié)構(gòu)分析

Predictprotein(http://www.predictprotein.org/)預(yù)測結(jié)果表明，SOCS4氨基酸殘基由9.75%的α-螺旋，7.03%的β-折疊，和83.22%的無規(guī)卷曲組成。

將克隆序列所編碼氨基酸序列提交到ESyPred3D Web Server 1.0(http://www.unamur.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/esypred/)，同源建模結(jié)果顯示SOCS4約由5個(gè)α-螺旋、多個(gè)β-折疊、轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲組成(圖6)。

Y軸為親水指數(shù)：正數(shù)時(shí)表示疏水，數(shù)值越大，疏水越強(qiáng)；負(fù)數(shù)時(shí)表示親水，數(shù)值越小親水越強(qiáng)。X軸為SOCS4蛋白質(zhì)各個(gè)氨基酸位置Y-axis displayed the hydrophilic index：a positive number indicates a hydrophobicity，the greater of the value indicated the more of hydrophobic；negative number indicates hydrophilic，the smaller of the value indicated the stronger of hydrophilic.X-axis displayed the positions of SOCS4 amino acids圖4 豬SOCS4蛋白疏水性Fig.4 The hydrophobicity profile of pig SOCS4 protein

Len.氨基酸長度；Loc.基于mTP、SP和other 3項(xiàng)分?jǐn)?shù)的高低對(duì)蛋白質(zhì)葉細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測； -.代表其他；RC.可靠性評(píng)測值，分?jǐn)?shù)由高到底分為1～5級(jí)，分?jǐn)?shù)越低，預(yù)測越可靠Len.Sequence length；Loc.PredI:Ction of localization based on the scores of mTP，SP and other；-.Any other location；RC.Reliability class，scores from high in the end is divided into 1 to 5，the lower the score，the more reliable prediction圖5 豬SOCS4氨基酸序列亞細(xì)胞定位分析Fig.5 The subcellular location analyses of pig SOCS4

圖6 豬SOCS4蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型Fig.6 The 3-dimensional structure model prediction of pig SOCS4

2.7 熱應(yīng)激條件下SOCS4的表達(dá)

本地土雜豬在高溫環(huán)境處理后的第1和第3天，小腸和脾組織中SOCS4 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。在胸腺組織中，SOCS4 mRNA的表達(dá)量在第3和第9天顯著上調(diào)(P<0.05)。而在腸系膜淋巴結(jié)中，SOCS4的表達(dá)量在高溫處理后的第1、6和9天顯著上調(diào)(P<0.05)(圖7)。

D0、D1、D3、D6和D9分別代表第0、1、3、6和9天；“**”表示差異極顯著(P<0.01)，“*”表示差異顯著(P<0.05)D0，D1，D3，D6 and D9.The 0 day，1 day，3 day，6 day and 9 day，respectively.“*” and “**” indicated the difference are significant (P<0.05) and highly significant (P<0.01)圖7 熱應(yīng)激不同時(shí)段SOCS4基因在腸系膜淋巴結(jié)、脾、胸腺和小腸中的表達(dá)Fig.7 The expression of SOCS4 mRNA at different time in indicated tissues by real-time PCR

3 討 論

人類的SOCS4基因編碼440個(gè)氨基酸的前體蛋白，而小鼠SOCS4基因編碼的前體蛋白為436個(gè)氨基酸。本研究發(fā)現(xiàn)，本地土雜豬SOCS4基因同長白豬[21]一樣，編碼441個(gè)氨基酸的前體蛋白。同其他家族成員一樣，SOCS4基因具有家族特異性的C端40個(gè)氨基酸的SOCS box區(qū)、中央SH2區(qū)和N末端區(qū)。雖然SOCS蛋白N末端結(jié)構(gòu)域具有高度無序性，但SOCS4和SOCS5的N末端卻存在一段保守序列(NTCR4-5)[16]。據(jù)報(bào)道，SOCS4的這段保守序列包含3個(gè)短小螺旋(88LKQKLQDAVG97，120HISELM125,和136DLAFRWHFIKR146)[22]，而本研究發(fā)現(xiàn)，SOCS4的N末端保守域內(nèi)同樣存在這3段序列(圖3)。序列同源對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本地土雜豬SOCS4在不同哺乳動(dòng)物物種之間相似性較高，多在90%以上?？梢奡OCS4基因在進(jìn)化過程中具有高度保守性。

SOCS家族成員之間具有高度保守的中央SH2和SOCS box結(jié)構(gòu)域。其中，中央SH2區(qū)參與識(shí)別同源磷酸酪氨酸基序[14]，SOCS box則與延伸因子B、C、卡林5和環(huán)指結(jié)構(gòu)域蛋白共同作用，來招募E2泛素交聯(lián)酶，形成復(fù)雜的泛素機(jī)制，不僅可以使目標(biāo)蛋白降解[23]，還可保護(hù)SOCS蛋白免受蛋白酶體介導(dǎo)的干擾[24]。盡管SOCS4的泛素化機(jī)制尚未被證實(shí)，但它卻可以通過結(jié)合EGFRpY1092因子來參與調(diào)解STAT3信號(hào)，而且低摩爾的SOCS4還能與JAK2pY1007結(jié)合發(fā)揮作用[25]。而由于N末端長度不一，結(jié)構(gòu)和功能的變化較大，使得SOCS成員之間的三維結(jié)構(gòu)并不存在相似性[25]。本研究中，豬SOCS4 N端由285個(gè)氨基酸殘基組成，占自身總蛋白近2/3。其N末端結(jié)構(gòu)域“NTCR4-5”除了有著蛋白整體的支架作用外[26]，這段較為保守的序列是否還存在其它特殊功能，或是否在熱應(yīng)激誘發(fā)的免疫抑制中發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步研究。

SOCS蛋白在CD4+T細(xì)胞的分化中扮演著重要的角色。研究顯示，在T細(xì)胞分化時(shí)，SOCS4在小腸、大腸和胸腺組織上出現(xiàn)高表達(dá)[12]。胃癌細(xì)胞SOCS4啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化可調(diào)節(jié)或參與腫瘤的生長[27]。人膽管上皮細(xì)胞SOCS4的表達(dá)受微小隱孢子蟲的誘導(dǎo)可調(diào)節(jié)STAT3和STAT6的磷酸化[28]等?？梢?，SOCS4廣泛參與了機(jī)體的生理病理變化。本研究中，高溫條件下SOCS4表達(dá)量在小腸和脾臟組織中顯著下調(diào)，而在胸腺組織上第3和9天的表達(dá)量顯著上調(diào)，腸系膜淋巴結(jié)組織上的表達(dá)量不僅在第1和第6天表現(xiàn)極顯著上調(diào)，且第9天也上調(diào)明顯。說明SOCS4的表達(dá)量在高溫環(huán)境下的豬各組織發(fā)生了變化，且呈組織和時(shí)間依賴性。處理時(shí)間的長短可能直接影響機(jī)體的狀態(tài)，而不同狀態(tài)下SOCS4也可能發(fā)揮不同的作用。根據(jù)報(bào)道，溫和及較短時(shí)間的應(yīng)激處理能增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，而高強(qiáng)度、長時(shí)間的應(yīng)激處理，動(dòng)物出現(xiàn)明顯的免疫抑制和炎性因子的紊亂現(xiàn)象[29]。此外，高溫?zé)釕?yīng)激可通過TLR4或TLR2調(diào)節(jié)炎性因子TNF-α、IL-6和IL-12等的表達(dá)[30]，而IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子的高分泌則是CD4+T細(xì)胞向Th1的方向分化的標(biāo)志[31]，進(jìn)而引發(fā)自身免疫、遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)等。但在熱應(yīng)激豬，SOCS4與TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路以及各種炎癥因子之間的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了豬SOCS4基因，并發(fā)現(xiàn)其在熱應(yīng)激條件下的表達(dá)發(fā)生明顯的改變，且呈組織和時(shí)間依賴性。

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(編輯 郭云雁)

Cloning and Bioinformatics Analysis of PorcineSOCS4 cDNA and Its Dynamic during Heat Stress

WANG Ping1，JU Xiang-hong2,3，5*，YONG Yan-hong2，JIA Ru-min1, MA Ming-long1,ZHAO Yun-tao4，LIAO Ming3，5

(1.DepartmentofAnimalScience，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China； 2.DepartmentofVeterinaryMedicine，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China； 3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandPrevention，MinistryofAgriculture，Guangzhou510642，China； 4.ModernBiochemicalCenter，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China； 5.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

The aim of this study was to systematically elucidate the mechanism of heat stress-induced swine immunosuppression，and inflammatory factors disorder.The TZ (Luchuan pig×Landrace pig)porcineSOCS4 gene was cloned in this study，it consisted of 1 326 bp of ORF encoding a protein with 441 amino acids，285 amino acids of them formed the N-terminal of SOCS4.It shared high amino acid sequence identity with that in Landrace pigs(100.0%)，BosTaurus(96.1%)，CapraHircus(96.1%)，F(xiàn)eliscatus(95.2%)，Equuscaballus(94.6%)，Canislupusfamiliaris(94.3%)，Homosapiens(93.0%) andMusmusculus(88.1%).The molecular weight of SOCS4 protein was 50.5 ku，and PI was 6.60.qRT-PCR results showed that the expression ofSOCS4 in thymus gland of TZ pigs was significantly upregulated on day 3 and 9 after heat stress began (P≤0.05).As well in mesenteric lymph node，where it significantly upregulated on day 1 and 6 (P≤0.01).The expression ofSOCS4 decreased significantly in small intestine and spleen of TZ pigs during heat stress (P≤0.05).The TZ porcineSOCS4 cDNA was cloned successfully，and a significant changes ofSOCS4 mRNA expression were appeared in heat stressed pigs with a tissue and time dependence manner.

pig；SOCS4；cloning；qRT-PCR；heat stress

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.021

2014-06-12

國家自然科學(xué)基金(31101862)；中國博士后科學(xué)基金

王 萍(1988-)，女，甘肅定西人，碩士生，主要從事動(dòng)物應(yīng)激性致病機(jī)理研究，E-mail: 870727290@qq.com

*通信作者：巨向紅，博士，副教授，E-mail: juxh77@163.com

S858.31

A

0366-6964(2015)02-0323-09