公山羊β防御素104a生物信息學(xué)分析及表達(dá)特性研究

任有蛇，張國(guó)林，郭麗娜，張春香，鄭亞琳，張彩霞，喬利英，靳 黎，呂麗華，劉文忠

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 太谷 030801)

公山羊β防御素104a生物信息學(xué)分析及表達(dá)特性研究

任有蛇#，張國(guó)林#，郭麗娜，張春香*，鄭亞琳，張彩霞，喬利英，靳 黎，呂麗華，劉文忠

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 太谷 030801)

旨在預(yù)測(cè)山羊β防御素104a蛋白質(zhì)特性，研究其在成年公山羊生殖組織及其他組織中的表達(dá)特性及其定位。采用在線軟件對(duì)gBD104a基因(KJ508074.1)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用QRT-PCR法檢測(cè)gBD104amRNA在睪丸、附睪及其他組織中的表達(dá)情況，用免疫熒光技術(shù)對(duì)生殖組織和精子中的gBD104a進(jìn)行定位。結(jié)果，(1)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明gBD104a基因cDNA全長(zhǎng)324 bp，編碼107個(gè)氨基酸，第1～19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，第27～55個(gè)氨基酸為潛在的β防御素構(gòu)象區(qū)域，在C端有7個(gè)潛在的O糖基化位點(diǎn)；(2)QRT-PCR結(jié)果表明，gBD104a在附睪體中表達(dá)量最高，在附睪頭、氣管、皺胃、空腸、回腸等組織中表達(dá)量較高，其他組織中表達(dá)量均較低；(3)免疫組化定位結(jié)果顯示，在附睪頭和體部的假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞檢測(cè)到較強(qiáng)的gBD104a陽(yáng)性信號(hào)，在附睪尾部的纖毛柱狀上皮細(xì)胞也檢測(cè)到較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào)。gBD104a包裹在精子頭部頂體和中段線粒體表面。gBD104a是一種分泌型糖蛋白，在成年公山羊機(jī)體各組織中廣泛表達(dá)，但主要表達(dá)在附睪體，是精子表面的主要成分。推測(cè)可能與精子運(yùn)動(dòng)、頂體反應(yīng)和獲能有關(guān)。需要進(jìn)一步深入研究其功能。

β防御素104a；生殖組織；表達(dá)特性及定位；公山羊

β防御素家族蛋白是一類含有多個(gè)半胱氨酸殘基的陽(yáng)離子抗菌肽，在機(jī)體組織上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)[1]，不僅具有廣譜抗菌活性[1-3]，還在色素沉積、吸引免疫細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)和生殖調(diào)控等多個(gè)方面具有重要生理作用[4]。β防御素在哺乳動(dòng)物的雄性生殖器官中大量表達(dá)，且已被證明在雄性生殖過程中起重要作用[5-6]。Y.S.Zhou等[7]構(gòu)建了9個(gè)β防御素基因先天缺失的雄性小鼠模型，發(fā)現(xiàn)這些試驗(yàn)小鼠產(chǎn)生的精子活力明顯下降，且附睪尾中的精子表現(xiàn)出提前獲能和自發(fā)頂體反應(yīng)的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致小鼠不育。Y.Heguo等[8]發(fā)現(xiàn)，人β防御素106(Human beta-defensins 106，hBD106)主要在附睪、睪丸和肺表達(dá)，在骨骼和皮膚中也有表達(dá)。hBD114和hBD118主要在附睪中表達(dá)，體外和體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其不僅可抵抗由脂多糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，還可避免由脂多糖引起的精子活力下降[9-10]。T.L.Tollner等[11]研究表明，獼猴精子獲能過程中精子頭部會(huì)脫落一部分蛋白，其主要成分為β防御素126蛋白。體外試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)β防御素126有保障精子穿過宮頸黏液和調(diào)節(jié)精子與輸卵管上皮細(xì)胞結(jié)合的能力[12]。小鼠β防御素22(Mouse beta-defensins 22，mBD22)表達(dá)特點(diǎn)與之相似[13]。另外C.C.Pedro等[14]研究發(fā)現(xiàn)，mBD 29主要在附睪尾中大量表達(dá)，作為CCR6的配體對(duì)精子活力的保持具有特殊的作用。然而有關(guān)山羊β防御素104a(Goat Beta-Defensins 104，gBD104a)在體內(nèi)表達(dá)定位的情況還鮮有報(bào)道。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)其蛋白特性，并用QRT-PCR方法對(duì)gBD104a的mRNA在成年公山羊全身各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，用組織免疫熒光技術(shù)對(duì)生殖組織和精子中g(shù)BD104a表達(dá)進(jìn)行定位，探尋gBD104a基因的表達(dá)規(guī)律，為gBD104a的生物學(xué)功能的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和組織樣品采集

試驗(yàn)羊?yàn)榻】档臅x嵐絨山羊公羊，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地提供。選用體重相近18月齡的成年公羊4只，頸靜脈放血致死，取每一個(gè)體的睪丸(Testis，Tes)、附睪頭(Caput，Cap)、附睪體(Corpus，Cor)和附睪尾(Cauda， Cau)、氣管(Trachea，Tra)、食管 (Esophagus，Eso)、皺胃(Abomasum，Abo)、十二指腸(Duodenum，Duo)、空腸(Jejunum，Jej)、回腸(Ileum，Ile)、膽囊(Gall bladder，Gab)、腸淋巴結(jié)(Payer’s patches，Pap)、腮腺(Parotid gland，Pag)、脾(Spleen，Spl)、扁桃體(Tonsil，Ton)、胸隔膜(Diaphragm，Dia)、視網(wǎng)膜(Retina，Ret)、下丘腦(Hypothalamus，Hya)、垂體(Hypophysis，Hyp)、甲狀腺(thyroid gland，Thg)、腎上腺(Adrenal gland，Adg)、精囊腺(Seminal vesicle，Sev)、前列腺(Prostate glands，Prg)、膀胱(Bladder，Bla)、輸精管(Seminiferous duct，Sed)、輸尿管(Ureter，Ure)、心包膜(Pericardium，Per)、肺 (Lung，Lun)和腎(Kidney，Kid)組織同一部位的樣品。所有樣品用經(jīng)過DEPC水處理的錫箔紙包被后放入凍存管，并迅速置于液氮中，采樣結(jié)束后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus試劑 (D9180A)、SYBR PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒(DDR037A)、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(DDR041A)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。Rabbit Anti-gBD104a多克隆一抗委托北京天成新脈生物技術(shù)有限公司制備，即用型SABC免疫組化試劑盒、FITC標(biāo)記的Goat Anti-Rabbit二抗(BST08L30c)、綠色熒光染料均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析 gBD104a蛋白的基本理化性質(zhì)用http://web.expasy.org/protparam/在線軟件預(yù)測(cè)；gBD104a蛋白結(jié)構(gòu)域采用http://smart.embl-heidelberg.de/在線軟件SMART程序分析；糖基化位點(diǎn)采用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/和http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/在線預(yù)測(cè)。

1.3.2 總RNA提取 按照RNAiso Plus試劑盒操作說明書步驟提取組織總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀(北京NanoDrop)測(cè)定總RNA的濃度和純度，用DEPC處理水調(diào)整濃度至0.5 μg·μL-1左右，保存在-80 ℃。

1.3.3 cDNA合成 按照SYBR PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說明書操作，10 μL體系為：隨機(jī)引物0.5 μL，Oligo dT 引物0.5 μL， RT Enzyme MIX I 0.5 μL ，Total RNA模板0.5 μg，5 ×PrimeScriptTMMaster Mix 2 μL，RNase Free ddH2O 5.5 μL；反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，其產(chǎn)物保存在-20 ℃。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中g(shù)BD104a的mRNA序列(KJ508074.1)和18S rRNA序列(AF379200.1)，通過Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物，并在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心(NCBI)在線比對(duì)其特異性，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，參數(shù)見表1。

表1gBD104a和18S rRNA基因引物序列

Table 1 Oligo-nucleotide primers pairs for thegBD104aand 18S rRNA genes

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductlengthgBD104aF:AGCAGTCATCATAGCAGCGGR:GGGAGCACAATGCCTCTCTT8418SrRNAF:CAGACAAATCACTCCACCAAR:GAAGGGCACCACCAGGAGT117

1.3.5 常規(guī)RT-PCR檢測(cè) 用15 μL PCR 反應(yīng)體系：用mix正反向引物(10 μmol·L-1)各0.6 μL，山羊組織cDNA模板1.0 μL， 2×Taq MasterMix 7.5 μL，ddH2O 5.3 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。用2.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3.6 相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 附睪頭組織cDNA按照2×稀釋8 個(gè)梯度，其濃度分別是2、22、23、24、25、26、27、28，無模板的空白作陰性對(duì)照，反應(yīng)體系總體積20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，正反向引物1.6 μL，ddH2O 6.0 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40 個(gè)循環(huán)。軟件自動(dòng)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 QRT-PCR QRT-PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同上，每個(gè)組織樣本3個(gè)重復(fù)，導(dǎo)出定量PCR獲得Ct值。

1.3.8 組織免疫熒光分析 參照施力光等[15]描述的山羊生殖器官免疫熒光試驗(yàn)的步驟：切片(厚度 0.5 μm)、脫蠟、梯度乙醇脫水、3.0% H2O2(80%甲醇)抗原修復(fù)、封閉。Rabbit Anti-gBD104a多克隆一抗按照1∶50稀釋，4 ℃過夜；PBS沖洗3 次各 5 min；加FITC標(biāo)記二抗37 ℃，30 min；PBS洗3次；加SABC復(fù)合物37 ℃，30 min；PBS沖洗4 次；然后綠色熒光染色；脫水、透明、封片。同時(shí)用抗體稀釋液PBS代替一抗做陰性對(duì)照。熒光正置生物顯微鏡(Olympus)下觀察，拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔCt計(jì)算gBD104a相對(duì)定量結(jié)果。設(shè)定gBD104a在成年附睪頭中的相對(duì)表達(dá)量為1。數(shù)據(jù)處理和分析用Excel 2007和SPSS 17.0。組織免疫組化圖片用Image-proplus 7.0分析。

2 結(jié) 果

2.1 gBD104a蛋白生物信息學(xué)分析

2.1.1 gBD104a蛋白基本理化性質(zhì)分析gBD104a基因編碼的mRNA全長(zhǎng)989 bp，遞交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank No.：KJ508074。其中CDS區(qū)長(zhǎng)324 bp，為1個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，編碼107個(gè)氨基酸。目的蛋白分子質(zhì)量(MW)為11.82 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為9.75，不穩(wěn)定系數(shù)為57.29，大于40，為不穩(wěn)定蛋白。對(duì)氨基酸所占比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示有16個(gè)帶正電荷的Arg+Lys殘基，有7個(gè)帶負(fù)電荷的Asp+Glu殘基；不同性質(zhì)氨基酸所占的比例不同，疏水系數(shù)為55.61，親水性指數(shù)總平均為-0.426，說明蛋白分子為親水性蛋白；蛋白濃度在1 g·L-1時(shí)，半胱氨酸未形成二硫鍵時(shí)吸光系數(shù)(Abs)為1.215，預(yù)測(cè)所有的半胱氨酸成對(duì)形成胱氨酸；預(yù)測(cè)不穩(wěn)定系數(shù)為57.29，大于40。說明目的基因編碼的蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白。

2.1.2 gBD104a蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域分析 SMART程序分析結(jié)果如圖1所示，gBD104a蛋白的CDS區(qū)序列編碼的蛋白質(zhì)前19個(gè)氨基酸區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽區(qū)域，另外在序列第27～55個(gè)氨基酸處為潛在的防御素區(qū)域，具有典型的C-X6-C-X3-C-X9-C-X5-CC-防御素特有的構(gòu)象，為6個(gè)半胱氨酸殘基所囊括的區(qū)域。

圖1 gBD104a編碼的蛋白質(zhì)SMART分析Fig.1 SMART analysis of the protein translated from goat gBD104a gene

2.1.3 gBD104a蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 根據(jù)在線網(wǎng)站的分析結(jié)果，該蛋白沒有潛在的N糖基化修飾位點(diǎn)，有7個(gè)潛在的O糖基化修飾位點(diǎn)，分別在gBD104a蛋白的第63、83、86、94、97、102和103位氨基酸處。

2.2gBD104a在成年公羊各組織中的表達(dá)特性

2.2.1 總RNA提取及常規(guī)RT-PCR檢測(cè) 用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)各種組織總RNA的A260 nm/A280 nm均為1.8～2.0，2.0%變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S、18S清晰，無降解(圖略)，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以不同組織cDNA為模板進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因常規(guī)RT-PCR反應(yīng)，其產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，所檢測(cè)的組織中均有g(shù)BD104的表達(dá)，其中以氣管、皺胃、空腸、回腸等組織的條帶相對(duì)于其他組織更明顯。將產(chǎn)物回收測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank(KJ508074)序列相似性達(dá)到98%以上，可以開展后續(xù)的QRT-PCR檢測(cè)。

1～23.氣管；食管；皺胃；十二指腸；空腸；回腸；膽囊；腸淋巴結(jié)；腮腺；脾；扁桃體；下丘腦；垂體；甲狀腺；腎上腺；精囊腺；前列腺；膀胱；輸精管；輸尿管；心包膜；肺；腎1-23.trachea；esophagus；abomasum；duodenum；jejunum；ileum；gall bladder；payer’s patches；parotid gland；spleen；tonsil；hypothalamus；hypophysis；thyroid gland；adrenal gland；seminal vesicle；prostate glands；bladder；seminiferous duct；ureter；pericardium；alveolus pulmonary；kidney圖2 RT-PCR檢測(cè)成年公羊各組織gBD104a 表達(dá)量Fig.2 gBD104a expression in different tissues of bucks dertermined by RT-RCR

2.2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 圖3A為軟件自動(dòng)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖可以看出，在8個(gè)數(shù)量級(jí)梯度上線性關(guān)系良好，gBD104a和18SrRNA回歸系數(shù)分別為0.998和0.997，擴(kuò)增效率分別為104.4%和103.3%，說明本研究建立的定量檢測(cè)gBD104a和18S rRNA的方法有效；圖3B為gBD104a和18S rRNA QRT-PCR的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，其基線平穩(wěn)、拐點(diǎn)清楚、平行性好。圖3C為其熔解曲線，僅有單一峰，說明沒有非特異性產(chǎn)物和引物二聚體。

A.標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線；C.熔解曲線A.Standard curves of gBD104a and 18S rRNA gene；B.PCR amplification plots；C.Dissociation curves圖3 gBD104a 與18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Fig.3 Construction of standard curves for gBD104aA and 18S rRNA

2.2.3gBD104amRNA在生殖器官中的表達(dá)量 成年公羊生殖器官各組織gBD104amRNA定量分析結(jié)果見圖4。從圖4可知，成年公羊生殖器官各組織gBD104amRNA表達(dá)量順序：附睪體>>附睪頭>附睪尾>輸精管>睪丸、前列腺和精囊腺。附睪體中g(shù)BD104amRNA表達(dá)量顯著高于其他生殖器官中的表達(dá)量，是睪丸組織的107.5倍(P<0.05)，是附睪頭的18.27倍(P<0.05)。附睪頭、附睪尾和輸精管gBD104amRNA表達(dá)量顯著高于睪丸、前列腺和精囊腺(P<0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)The different lowercases indicate significant difference(P<0.05)圖4 生殖器官各組織gBD104a mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of gBD104a mRNA in reproduction organs

2.2.4gBD104amRNA在其余各組織中的表達(dá)量 山羊其他組織中g(shù)BD104a熒光定量分析結(jié)果如圖5所示。在所檢測(cè)的其他組織中，氣管中g(shù)BD104amRNA表達(dá)量最高，其顯著高于皺胃的(P<0.05)，極顯著高于空腸和回腸(P<0.01)；皺胃gBD104amRNA表達(dá)量顯著高于空腸和回腸(P<0.05)，極顯著高于膽囊、十二指腸、胸隔膜、輸尿管和腎(P<0.01)。然而在下丘腦、甲狀腺、腎上腺和腮腺等重要分泌器官、腸淋巴結(jié)和扁桃體等免疫器官表達(dá)量均較低，顯著低于輸尿管和胸膈膜等組織(P<0.05)。在垂體和小腦中g(shù)BD104amRNA表達(dá)量很低。全身各組織中，以附睪體中的gBD104amRNA表達(dá)量最高，其次是附睪頭和氣管，再者是皺胃、附睪尾、輸精管、空腸和回腸，其余各組織中g(shù)BD104amRNA相對(duì)表達(dá)量均低于0.2。除附睪外，在氣管和消化道分泌活動(dòng)旺盛的上皮組織中g(shù)BD104amRNA表達(dá)量也較高。

圖5 其他組織GBD104a mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of GBD104a mRNA in other tissues

2.3 gBD104a在成年公羊睪丸、附睪和精子中的定位

2.3.1 gBD104a在成年公羊睪丸和附睪中的定位 gBD104a通過免疫組化技術(shù)在成年公羊睪丸、附睪中的定位結(jié)果見圖6。gBD104a是分泌蛋白，圖6顯示，僅在附睪頭和附睪體的假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞中檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，在附睪尾部的柱狀上皮細(xì)胞和精漿中有較為明顯的陽(yáng)性信號(hào)，在睪丸組織中檢測(cè)到微量陽(yáng)性信號(hào)。

2.3.2 gBD104a在成年公羊精子中的定位 gBD104a在成年公羊精子中的定位結(jié)果見圖7。從圖7A可以看出，gBD104a包裹在精子頭部頂體上和精子尾部中段線粒體上。精子尾部的主段和末端沒有g(shù)BD104a的包裹。而圖7B陰性對(duì)照精子頭部和尾部都沒有陽(yáng)性信號(hào)。

3 討 論

3.1 gBD104a生物信息學(xué)分析

gBD104a為近年新發(fā)現(xiàn)的β防御素家族成員，僅與牛防御素家族中精子相關(guān)抗原11的B型剪接體[16]和牛類β防御素15有部分同源區(qū)域。圖1顯示，經(jīng)SMART程序預(yù)測(cè)到潛在的防御素構(gòu)象正是gBD104a蛋白序列6個(gè)半胱氨酸殘基所在的區(qū)域。蛋白質(zhì)理化分析預(yù)測(cè)這6個(gè)半胱氨酸殘基兩兩相連，符合β防御素保守的立體結(jié)構(gòu)模式[1]。T.Ganz等[1-2]證明，β防御素這種特殊的構(gòu)象是維持其生理活性的關(guān)鍵，Y.Suresh等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，防御素構(gòu)象在發(fā)揮其免疫作用的過程中起關(guān)鍵作用。因此推測(cè)，gBD104a可能同其他β防御素一樣具有免疫功能。

糖基化位點(diǎn)可以使蛋白質(zhì)抵抗消化酶的作用，并且只有在該位點(diǎn)發(fā)生糖基化修飾才能使原蛋白質(zhì)正常折疊[17]。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析結(jié)果說明gBD104a蛋白C末端可能發(fā)生高度O糖基化修飾。精子表面的蛋白質(zhì)在射出體外之前會(huì)有一個(gè)明顯的糖基化修飾過程。當(dāng)處在雌性生殖道中時(shí)，精子表面的糖蛋白修飾又會(huì)有一個(gè)系統(tǒng)的移除或改變構(gòu)象的過程，這個(gè)過程也是精子獲能的特征之一[18]。T.L.Tollner等[19]在研究獼猴β防御素126對(duì)精子的作用時(shí)也證明了高度O糖基化修飾的這種作用。以此推測(cè)，gBD104a蛋白C端糖基化修飾可能對(duì)精子成熟及生殖免疫識(shí)別有重要作用。

3.2 公山羊生殖組織中g(shù)BD104a表達(dá)特性分析

在哺乳動(dòng)物中大部分的β防御素基因主要在雄性輸精管道中表達(dá)，且表達(dá)均受雄激素調(diào)控，并在性成熟時(shí)得以加強(qiáng)，暗示著β防御素具有生殖和宿主防御的雙重作用。精子由睪丸產(chǎn)生后，在附睪中成熟，附睪尾中貯存[20-21]，附睪頭和附睪體則是精子主要的成熟場(chǎng)所，其復(fù)雜的管腔液是影響精子成熟的重要因素[22-24]。A.J.Scott等[25]曾研究了β防御素家族在大鼠和小鼠附睪各部分的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，結(jié)果顯示，其中的29個(gè)成員分別在附睪不同的部位有明顯的區(qū)域特異性表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，附睪頭和附睪體是gBD104a在公山羊生殖組織中的主要表達(dá)場(chǎng)所，這說明gBD104a編碼的蛋白質(zhì)可能在精子成熟過程中發(fā)揮重要作用，且蛋白質(zhì)發(fā)揮生理功能的主要部位可能是附睪體。

其中A、C、E和G分別為睪丸、附睪頭、附睪體和附睪尾陽(yáng)性。B、D、F和H分別為睪丸、附睪頭、附睪體和附睪尾的陰性對(duì)照；A.gBD104a在睪丸組織中檢測(cè)到微量陽(yáng)性信號(hào)；C和E.gBD104a分別在附睪頭和體部的假?gòu)?fù)層柱狀上皮細(xì)胞中被檢測(cè)到強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)；G.gBD104a在附睪尾部的柱狀上皮細(xì)胞和管腔液中被檢測(cè)到較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào)B，D，F(xiàn) and H are negative controls of adult goat testis，caput，corpus and cauda,respectively；A.The weak positive signal of gBD104a is detected in testis；C and E.gBD104a strong positive signals are detected in pseudostratified ciliated columnar epithelium of caput, and corpus，respectively；G.gBD104a strong positive signal is detected in columnar epithelium of cauda and luminal liquid圖6 睪丸和附睪gBD104a 免疫組化結(jié)果 400×Fig.6 Immunohistochemistry results of gBD104a in testis and epididymis 400×

圖7 精子gBD104a的免疫熒光結(jié)果 400×Fig.7 Immunohistochemistry results of gBD104a in sperm 400×

3.3 成年公山羊機(jī)體各組織中g(shù)BD104a的表達(dá)特性分析

防御素家族成員均含有保守的多個(gè)半胱氨酸殘基和高度相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，因此都有廣譜抗菌活性[26]，gBD104a也不例外。圖5結(jié)果顯示，gBD104amRNA在氣管、皺胃和小腸等與外界相通的管道中表達(dá)較多，在其他組織中表達(dá)較少。氣管、皺胃和小腸等器官含有豐富的上皮組織，分泌活動(dòng)旺盛，在機(jī)體免疫抵抗致病微生物方面起重要作用，這些組織中相對(duì)較高的表達(dá)量暗示著其蛋白可能具有一定的抗菌作用；然而gBD104在淋巴結(jié)、腮腺、脾、扁桃體等免疫器官內(nèi)表達(dá)量較少，不能體現(xiàn)

其免疫特性，這可能與防御素家族蛋白有別于傳統(tǒng)免疫過程的獨(dú)特殺菌機(jī)理有關(guān)[9]。gBD104在下丘腦和垂體中表達(dá)較少，說明該蛋白不是性腺軸上的主要信號(hào)蛋白。另外，gBD104在甲狀腺、腎上腺、精囊腺、前列腺等腺體器官以及膀胱、輸精管、輸尿管、心包膜、肺泡、腎等分泌活動(dòng)貧乏的上皮組織中表達(dá)較少，說明從防御素家族高度進(jìn)化而來的gBD104a擁有高度特異的生理功能，不僅簡(jiǎn)單履行免疫調(diào)節(jié)作用，可能只在特定條件下發(fā)揮其獨(dú)特的生理作用。

3.4 gBD104a在成年公山羊附睪體和精子中的定位

目前關(guān)于gBD104a定位表達(dá)的研究很少。本研究結(jié)果顯示，gBD104a在睪丸和附睪的上皮組織中均有表達(dá)，其在睪丸中有微量表達(dá)，主要表達(dá)在于附睪中柱狀上皮細(xì)胞伸向附睪管腔的部分，尤其是細(xì)胞末端的纖毛部分有明顯的陽(yáng)性信號(hào)，推測(cè)gBD104a可能在精子成熟過程中發(fā)揮重要作用。有資料表明，β防御素的一些其他成員在牛、人、大鼠的整個(gè)附睪上皮細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)[24]。Y.Heguo等[8]發(fā)現(xiàn)，人β防御素114在附睪管腔的起始部位大量聚集，離管腔越遠(yuǎn)表達(dá)量越低，作用是防止精子由脂多糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)能力的下降；C.W.A.Maria等[16]通過免疫組化技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，SPAG11D/E同樣是在附睪上皮組織中表達(dá)，并且在附睪管腔的起始和末梢部位大量聚集，精子免疫熒光技術(shù)顯示其覆蓋精子尾部，但是具體作用未知。本研究中，精子免疫熒光結(jié)果顯示，gBD104a包裹在精子頭部前段頂體和精子中端線粒體表面，驗(yàn)證了其生物信息學(xué)分析的結(jié)果，gBD104a是一種分泌型糖蛋白，參與了精子表面的糖蛋白修飾過程。K.Toshimore等[27]在1991年研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)發(fā)生高度O糖基化修飾后會(huì)攜帶負(fù)電荷，可以與唾液酸末端鏈接覆蓋在精子表面，不僅在附睪中起到精子加工和貯存的作用，還在雌性生殖道內(nèi)起到保護(hù)、免疫識(shí)別和去能因子的作用。因此，推測(cè)gBD104a可能與頂體反應(yīng)、精子運(yùn)動(dòng)或免疫識(shí)別有關(guān)，具體生物學(xué)功能需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

gBD104a基因編碼的mRNA全長(zhǎng)989 bp，其中cDNA全長(zhǎng)324 bp，前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽區(qū)域，第27～55個(gè)氨基酸為潛在的β防御素構(gòu)象區(qū)域，C端預(yù)測(cè)到7個(gè)潛在的O糖基化位點(diǎn)。gBD104a在成年山羊體內(nèi)廣泛表達(dá)，生殖組織中附睪體是主要的轉(zhuǎn)錄表達(dá)部位。在氣管、皺胃、空腸、回腸等分泌活動(dòng)旺盛的上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較高，但其他組織中的表達(dá)量較低。gBD104a定位在附睪的上皮組織中、精子頂體和尾部中段線粒體上。推測(cè)其可能與精子運(yùn)行、頂體反應(yīng)和獲能、免疫識(shí)別等有關(guān)，其具體生物學(xué)功能需進(jìn)一步研究。

[1] GANZ T.Defensins：antimicrobial peptides of innate immunity[J].NatRevImmunol，2003，3：710-720.

[2] LEHRER R I.Primate defensins [J].NatRevMicrobiol，2004，2：727-738.

[3] DIAMOND G，BEVINS C L.β-Defensins：endogenous antibiotics of the innate host defense response [J].ClinImmunolImmunopathol，1998，88：221-225.

[4] SEMPLE F，DORIN J R.Beta-defensins：multifunctional modulators of infection，inflammation and more [J].InnateImmunol，2012，4:337-348.

[5] OH J，LEE J，WOO J M，et al.Systematic identification and integrative analysis of novel genes expressed specifically or predominantly in mouse epididymis [J].BMCGenomics，2006，7：314.

[6] PATIL A A，CAI Y，SANG Y，et al.Cross-species analysis of the mammalian beta-defensin gene family：presence of syntenic gene clusters and preferential expression in the male reproductive tract [J].PhysiolGenomics，2005，23：5-17.

[7] ZHOU Y S，WEBB S，LETTICE L，et al.Partial deletion of chromosome 8 beta-defensin custer confers sperm dysfunction and infertility in male mice [J].PLoSGenet, 2013，9(10)：e1003826.

[8] HEGUO Y，JING D，YIHUA G，et al.The novel human β-Defensin 114 regulates lipopolysaccharide (LPS)-mediated inflammation and protects sperm from motility loss [J].JBiolChem，2013，288(17)：12270-12282.

[9] SURESH Y，KATHERINE G H，F(xiàn)RANK S F，et al.The androgen-regulated epididymal sperm-bingding protein，human β-defensin 118(DEFB118) (formerly ESC42)，is an antimicrobial β-defensin [J].Endocrinology，2004，145(7)：3165-3173.

[10] RODRIJUEZ-JIMEEZ F J，KRAUSE A，SCHULZ S，et al.Distribution of new human β-defensin genes clustered on chromosome 20 in functionally different segments of epididymis [J].Genomics，2003，81：175-183.[11] TOLLNER T L，YUDIN A I，TREECE C A，et al.Macaque sperm release ESP13.2 and PSP94 during capacitation：the absence of ESP13.2 is linked to sperm-zona recognition and binding [J].MolReprodDev，2004，69：325-327.

[12] THEODORE L，TOLLNER，YUDIN A I，et al.Macaque sperm coating protein DEFB126 facilitates sperm penetration of cervical mucus [J].HumReprod，2008，23(11)：2523-2534.

[13] YUDIN A I，TOLLNER T L，TREECE C A，et al.β-defensin 22 is a major component of the mouse sperm glycocalyx [J].Reproduction，2008，136(6)：753-765.

[14] PEDRO C C，MARIANO G B，F(xiàn)ABIAN B，et al.A role for the chemokine receptor CCR6 in mammalian sperm motility and chemotaxis [J].CellPhysiol，2014，229(1)：24418-24441.

[15] 施力光，荀文娟，岳文斌，等.山羊PHGPx基因在不同組織中的表達(dá)特點(diǎn)及性腺中的定位[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(17)：3653-3659. SHI G L，XUN W J，YUE W B，et al.Tissue expression profile and cellular localization of PHGPx in gonad of goat[J].ScientiaAgriculturaSinica，2010，43(17)：3653-3659.(in Chinese)

[16] MARIA C W A，LUCIANA H，KATHERINE G H，et al.Novel aspects of the sperm-associated antigen 11 (SPAG11) gene organization and expression in cattle (Bostaurus) [J].BiolReprod，2007，76：1103-1116.

[17] 劉凌云，薛紹白，柳惠圖.細(xì)胞生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2002：89-92. LIU L Y，XUE S B，LIU H T.Cell biology[M].Beijing：Higher Education Press，2002：89-92.(in Chinese)

[18] SCHROTER S，OSTERHOFF C，MCARDLE W.The glycocalyx of the sperm surface [J].HumReprodUpdate，1999，5：302-313.

[19] TOLLNER T L，YUDIN A I，TARANTAL A F，et al.Beta-defensin 126 on the surface of macaque sperm mediates attachment of sperm to oviductal epithelia [J].BiolReprod，2008，78：400-412.

[20] HINTON B T，PALLADINO M A，RUDOLPH D，et al.The role of the epididymis in the protection of spermatozoa [J].CurrentTopicsDevBiol, 1996，33：61-102.

[21] JONES R C.To store or mature spermatozoa? The primary role of the epididymis [J].IntJAndrol，1999，22：57-67.

[22] HINTON B T，PALLADINO M A.Epididymal epithelium：its contribution to the formation of a luminal fluid microenvironment [J].MicroscopyResTech，1995，30：67-81.

[23] MOORE H D.Contribution of epididymal factors to sperm maturation and storage [J].Andrologia，1998，30：233-239.

[24] DACHEUX J L，GATTI J L，DACHEUX F.Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation [J].MicroscopyResTech, 2003，61：7-17.

[25] SCOTT A J，TERRY T T，HYUN J B，et al.The rat epididymal transcriptome：comparison of Segmental gene expression in the rat and mouse epididymides [J].BiolReprod，2007，76：561-570.

[26] XIN A，ZHAOY，YU H，et al.Soluble fusion expression，characterization and localization of human beta-defensin 6[J].MolMedRep，2014，9(1)：149-155.

[27] TOSHIMORE K，ARAKI S，OURA C，et al.Loss of sperm surface sialic acid induces phagocytosis：anassay with a monoclonal antibody T21，which recognizes a 54K sialoglycoprotein [J].ArchivesAndrol, 1991，27：79-86.

(編輯 郭云雁)

Bioinformatics Analysis and Expression Characteristics of Goat Beta-defensin 104a Gene in Adult Bucks

REN You-she#，ZHANG Guo-lin#，GUO Li-na ，ZHANG Chun-xiang*,ZHENG Ya-lin， ZHANG Cai-xia,QIAO Li-ying，JIN Li，Lü Li-hua，LIU Wen-zhong

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

The objectives of this study were to analyze the goat beta-defensins 104a (gBD104a) gene by bioinformatics，and to investigate the expression levels of gBD104a in various tissues of adult bucks and the location in reproduction organ and sperms.Bioinformatics analysis ofgBD104a(GenBank No.：KJ508074.1) was made by software online.Relative mRNA expressions were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.Cellular localization of gBD104a in testes，epididymidis and sperms were examined by immunohistochemistry.The results showed that：(1) The results of bioinformatics analysis showed that the cDNA ofgBD104agene contains 324 nucleotides，including a complete open reading frame (ORF) encoding 107 amino acids，software online predictded 1-19 amino acids as signal peptide area，27-55 amino acids for potential beta defensins motif，7 potential O-glycosylation sites on C-terminal；(2) The results of QRT-PCR showed thatgBD104amRNA was widely expressed，but the relative expression ofgBD104amRNA was the highest in cauda epididymis.Expressions ofgBD104amRNA in caput epididymis，tracheal，abomasums，jejunum and ileum were more than those in other tissues；(3)The results of immunohistochemistry showed that there were strong positive signal of gBD104a in pseudostratified ciliated columnar epithelium of caput and corpus，and strong positive signal in columnar epithelium of cauda.gBD104a was located on the sperm acrosome and mitochondria surface.gBD104a was an epididymal secretory glycoprotein.gBD104amRNA was widely expressed in various tissues of bucks，while the highest expression levels was in cauda epididymis.gBD104a was coated on sperm surface，which maybe play an important role in sperm motility，acrosome reaction and capacitation process.Therefore，the physiological functions of gBD104a needs be further researched.

goat beta-defensin 104a；reproductive tissues；expression characteristics and localization；bucks

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.007

2014-10-30

山西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20110311029； 20130311025-2)

任有蛇(1970-)，男，山西岢嵐人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物繁殖調(diào)控研究，E-mail：rys925@126.com；張國(guó)林(1989-)，男，山東青島人，碩士生，主要從事動(dòng)物繁殖調(diào)控研究，E-mail：zhangguolin1989@126.com。任有蛇和張國(guó)林為共同第一作者

*通信作者：張春香，副教授，E-mail：zhchx66@126.com

S827.2

A

0366-6964(2015)02-0219-09