豬Fosl2基因克隆、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其mRNA發(fā)育性表達(dá)變化

范興興，李新建，李改英，郭吉利，韓雪蕾，呂 剛，任廣志

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

豬Fosl2基因克隆、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其mRNA發(fā)育性表達(dá)變化

范興興，李新建，李改英，郭吉利，韓雪蕾，呂 剛，任廣志*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

本試驗(yàn)旨在克隆豬Fosl2基因CDS序列并對(duì)其進(jìn)行分析，研究該基因在豬的不同階段各種組織(心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌、背部脂肪)中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律。以豫南黑豬為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆豬Fosl2基因CDS區(qū)域，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)豫南黑豬7～180日齡上述組織中Fosl2基因的發(fā)育性表達(dá)。結(jié)果表明，豬Fosl2基因的CDS區(qū)為984 bp，編碼327個(gè)氨基酸，跨膜序列為17～33位氨基酸，該肽鏈沒(méi)有信號(hào)肽，為跨膜非分泌型蛋白，在122～187位氨基酸的位置存在亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，核苷酸和氨基酸序列同其他種屬間的保守性很高。Fosl2基因擁有廣泛的組織表達(dá)譜，在心、肝、脾、腎、肺、背最長(zhǎng)肌和背部脂肪的不同發(fā)育階段均有不同程度的表達(dá)，而其在肺中的表達(dá)量均高于同時(shí)期其他組織內(nèi)的表達(dá)量，推測(cè)豬Fosl2基因可能與肺部組織的發(fā)育有關(guān)；其在背部脂肪不同發(fā)育階段的變化趨勢(shì)表明其可能參與調(diào)控豬脂肪的生成進(jìn)而影響瘦肉率。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究豬Fosl2結(jié)構(gòu)及其多功能奠定基礎(chǔ)。

豬；Fosl2；克??；序列分析；發(fā)育性表達(dá)

Fos基因家族包含4個(gè)基因：Fos、FosB、Fosl以及Fosl2(Fos-like antigen 2)，這些基因編碼形成的亮氨酸鏈可以與Jun基因家族(包含C-Jun、Junb和Jund)編碼的蛋白二聚合成活化因子蛋白1(Activator protein-1,AP1)[1]，而AP1與細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化調(diào)控，細(xì)胞凋亡的發(fā)生，胚胎發(fā)育及器官發(fā)生以及體內(nèi)免疫系統(tǒng)的調(diào)控功能相關(guān)[2]。近年來(lái)，隨著AP1研究的日趨深入，人們發(fā)現(xiàn)Fos基因家族在細(xì)胞的增殖分化，動(dòng)物體的新陳代謝、生長(zhǎng)性狀、免疫系統(tǒng)應(yīng)答等生理活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。V.Foletta等[4]1994年首次克隆出小鼠Fosl2基因的cDNA序列，并指出其在卵巢、胃、大腸、小腸、肺、心等內(nèi)臟器官中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，隨后的研究更顯示出該基因與人和動(dòng)物的脂肪代謝[2]、骨骼發(fā)育[5-7]以及疾病和癌癥的發(fā)生相關(guān)[8-10]，因此該基因也引起了動(dòng)物育種界以及醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。然而目前關(guān)于Fosl2的相關(guān)研究都集中在國(guó)外，且多數(shù)以人、牛、小鼠為主，豬上關(guān)于該基因的研究未見報(bào)導(dǎo)。本試驗(yàn)旨在揭示豬Fosl2的結(jié)構(gòu)與功能，為進(jìn)一步研究豬Fosl2的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 選取同等飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)的7、30、60、180日齡豫南黑豬各3頭，屠宰后立即取心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌、背部脂肪7種組織樣品，迅速放入液氮中，-80 ℃保存，用于組織表達(dá)特性分析；同時(shí)，選取產(chǎn)仔母豬新鮮胎衣樣品組織，放入液氮，-80 ℃保存，用于Fosl2基因CDS的克隆。

1.1.2 主要試劑 DL2000 Marker、TaqDNA聚合酶均購(gòu)自北京康為試劑公司；凝膠回收試劑盒(TIANgel Midi)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；X-gal、IPTG購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；Amp購(gòu)自Sigma公司；RNAiso Plus Trizol、DEPC、大腸桿菌DH5α、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，pTA2 Vector載體購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司。1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)比對(duì)GenBank上人Fosl2基因(BC022791.1)、牛(NM_001192950.1)、獼猴(NM_001260911.1)序列的保守區(qū)域后，利用Primer5.0設(shè)計(jì)克隆豬Fosl2基因CDS區(qū)的PCR引物，同時(shí)設(shè)計(jì)該基因以及內(nèi)參基因GAPDH(AF017079.1)的熒光定量PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息見表1。1.2 豬Fosl2基因CDS區(qū)擴(kuò)增及產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

提取樣品組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒及特異性引物對(duì)豫南黑豬總RNA進(jìn)行去除基因組DNA以及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，利用RT-PCR方法擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)結(jié)束后取PCR反應(yīng)液5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收后，將PCR產(chǎn)物與pTA2載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后，Amp+平板挑取陽(yáng)性菌落后提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，選取陽(yáng)性重組子送寶生物(大連)工程有限公司測(cè)序。

表1Fosl2基因及內(nèi)參基因的引物信息

Table 1 The information of primers used in the study

基因名稱Genename引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpLengthofproduct用途PurposeFosl2F1-GAGGGCGGGGGAAGAAAAACAR1-GGTGAAACCAAAAGGCACTGAGCATT1427CDS克隆Fosl2F2-AGCAGAAATTCCGGGTAGATATGGR2-AGCGAGGGTATGGGTTGGACC138組織表達(dá)特性分析GAPDHF-GGTCACCAGGGCTGCTTTTR-CATTTGATGTTGGCGGGAT210組織表達(dá)特性分析

1.3 多物種種間Fosl2進(jìn)化分析

應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)8個(gè)不同物種間Fosl2 CDS區(qū)域的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建Fosl2基因序列的進(jìn)化關(guān)系樹，F(xiàn)osl2核苷酸及氨基酸序列信息來(lái)源于GenBank，具體信息為牛(NM_001192950.1)、人(BC022791.1)、獼猴(NM_001260911.1)、大猩猩(XM_004029036.1)、星鼻鼴鼠(XM_004686333.1)、樹鼩(XM_006162129.1)、綿羊(XM_004005786.1)、虎鯨(XM_004268168.1)。

1.4 豬Fosl2蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

用ExPASy-ProtParam Tool工具對(duì)豬Fosl2蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行包括氨基酸組成、元素組成、等電點(diǎn)、分子量等的預(yù)測(cè)，應(yīng)用ProtScale的在線版本對(duì)豬Fosl2蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水區(qū)域預(yù)測(cè)，應(yīng)用TM-PRED在線軟件分析豬Fosl2蛋白的跨膜區(qū)，應(yīng)用Signa1P4.0在線軟件進(jìn)行豬Fosl2的信號(hào)肽分析，應(yīng)用PHD在線軟件對(duì)豬Fosl2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，應(yīng)用InterProScan在線軟件對(duì)豬Fosl2蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 豬Fosl2基因組織表達(dá)特性分析

1.5.1 cDNA合成 取4個(gè)不同時(shí)期(7、30、60、180日齡)豫南黑豬的心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌以及背部脂肪分別進(jìn)行總RNA提取，測(cè)得總RNA的OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0即為符合要求，根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行去除基因組DNA反應(yīng)以及反轉(zhuǎn)錄，基因組DNA的去除反應(yīng)體系10 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，RNase Free dH2O 5.0 μL，總RNA 2.0 μL?；靹蚝蠖虝弘x心，42 ℃ 2 min，該產(chǎn)物命名為A。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL ：A 10 μL，5×PrimeScript BufferⅡ 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix1 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL。37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 S，該反應(yīng)產(chǎn)物命名為B，即為cDNA產(chǎn)物。1.5.2 熒光定量PCR反應(yīng) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明，在羅氏熒光定量PCR Lightcycler 480儀上進(jìn)行，熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL：SYBR GREEN 12.5 μL，F(xiàn)osl2-F1(10 μmol·L-1)1 μL，F(xiàn)osl2-R1(10 μmol·L-1)1 μL，B反應(yīng)液 1.5 μL，加滅菌ddH2O至終體積為25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s ；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，45個(gè)循環(huán)。系統(tǒng)將自動(dòng)采集熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)指數(shù)，并進(jìn)行分析繪制每一感應(yīng)管的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，設(shè)定無(wú)cDNA 樣品的空白管作為陰性對(duì)照。

1.5.3 熒光定量結(jié)果分析及數(shù)據(jù)處理 定量中以180日齡肺的Ct值為對(duì)照進(jìn)行計(jì)算，以GAPDH為參照進(jìn)行相對(duì)定量數(shù)值分析，結(jié)果用Ct法(2-△△Ct)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，最終數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行圖形制作以及單因素方差分析(One way ANOVA)和多重比較分析，所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)”表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬Fosl2基因的克隆

豬胎衣中的總RNA提取后，經(jīng)測(cè)定OD值符合要求。反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳顯示獲得長(zhǎng)度為1 427 bp的片段(圖1)，將產(chǎn)物回收與載體連接后，選取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，所得片段長(zhǎng)度為1 427 bp，其中包括豬Fosl2基因CDS區(qū)984 bp(圖2)，將序列提交NCBI，獲得登錄號(hào)KM191330。通過(guò)BLAST在線比對(duì)，與GenBank牛的Fosl2基因同源性為91%，所得片段即為豬的Fosl2基因。

圖1 豬胎衣組織目的片段RT-PCR結(jié)果Fig.1 The RT-PCR results of Fosl2 of the pig afterbirth

2.2 多物種間Fosl2的同源性比較以及進(jìn)化分析

利用DNAStar軟件，對(duì)豬與牛、人、獼猴、大猩猩、鼴鼠、樹鼩、綿羊以及虎鯨的Fosl2 基因的CDS區(qū)域核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表2所示：豬與牛、人、獼猴、大猩猩、星鼻鼴鼠、樹鼩、綿羊，虎鯨的核苷酸序列同源性分別為 91%、92%、92%、100%、91%、92%、94%、94%；豬與牛、人、獼猴、大猩猩、星鼻鼴鼠、樹鼩、綿羊、虎鯨的氨基酸序列同源性分別為 95%、97%、96%、100%、95%、96%、95%、96%。利用GenBank 公布的核苷酸序列，采用DNAman軟件建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。該進(jìn)化樹顯示，豬Fosl2與大猩猩Fosl2在一個(gè)小分枝上，2個(gè)物種的分子進(jìn)化地位最近，同時(shí)與其他哺乳動(dòng)物在一個(gè)大分枝上。

上行表示豬Fosl2核苷酸序列，下行表示推測(cè)的豬Fosl2氨基酸序列；起始密碼子ATG用下劃線標(biāo)出，“﹡”代表終止密碼子TAAThe upper line show the nucleotide sequences and the lower line show the deduced amino acid sequences；The initial code ATG is underlined，﹡indicate the terminal code TAA圖2 豬Fosl2 核苷酸序列及推測(cè)氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of pig Fosl2

表2 豬Fosl2與其他動(dòng)物的核苷酸和氨基酸序列一致性比較

Table2 Comparison of nucleotide and amino acid of Fosl2 between pig and other animals

物種Species核苷酸一致性/%Nucleotideidentity氨基酸一致性/%Aminoacidsidentity牛Bostaurus9195人Homosapiens9297獼猴MacacaMulatta9296大猩猩Gorilla100100星鼻鼴鼠Condyluracristata9195樹鼩Tupaiachinensis9296綿羊Ovisaries9495虎鯨Orcinusorca9496

所引用的序列均來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。登錄號(hào)如下：牛(NM_001192950.1)、人(BC022791.1)、獼猴(NM_001260911.1)、大猩猩(XM_004029036.1)、星鼻鼴鼠(XM_004686333.1)、樹鼩(XM_006162129.1)、綿羊(XM_004005786.1)、虎鯨(XM_004268168.1)All sequences come from the GenBank database.Bos Taurus(NM_001192950.1)，Homo sapiens(BC022791.1)，Macaca Mulatta(NM_001260911.1)，Gorilla(XM_004029036.1)，Condylura cristata(XM_004686333.1)，Tupaia chinensis(XM_006162129.1)，Ovis aries(XM_004005786.1)，Orcinus orca(XM_004268168.1)圖3 豬Fosl2 與其他動(dòng)物之間系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建Fig.3 Phylogenetic tree of Fosl2 between pig and other animals

2.3 豬Fosl2蛋白理化性質(zhì)分析以及結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測(cè)

利用在線軟件分析可知，豬Fosl2蛋白由327

個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為35.33 ku，理論等電點(diǎn)為6.42，分子式為C1512H2447N449O504S11，原子總數(shù)為4 923，N端為蛋氨酸，估計(jì)半衰期為30 h，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為89.94，表明此蛋白的性質(zhì)不穩(wěn)定，脂溶系數(shù)為66.51。雖為親水性蛋白，但在42、44～54、64～72、85～95、98～100、102～107、181～192、205、213、215～224、246～254、264～272、277～286、321～323等位點(diǎn)具有疏水性，最大疏水區(qū)位于第218位氨基酸，最大疏水值為2.167，最大親水區(qū)位于第124位氨基酸，最大親水值為-3.256，其親水性平均值為-0.669；Fosl2包括α-螺旋63個(gè)，百分比為19.27%，多集中在序列的中間區(qū)域，β-折疊共2個(gè)，位于第58和59位氨基酸，占0.61%，延伸主鏈占7.34%，無(wú)規(guī)則卷曲238個(gè)，占72.78%；Fosl2蛋白存在36個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸29個(gè)，蘇氨酸5個(gè)，絡(luò)氨酸2個(gè)；Fosl2的跨膜序列為17～33位氨基酸，序列為SGSPAHAESYSSGGGGQ，該蛋白為跨膜蛋白，Signa1P4.0信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具分析發(fā)現(xiàn)存在信號(hào)肽的概率為0，說(shuō)明該蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌型蛋白(圖4)。Fosl2蛋白在122～187位氨基酸的位置含有亮氨酸拉鏈域。

A.豬Fosl2氨基酸序列理化性質(zhì)；B.豬Fosl2氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。A圖中上行字母表示推測(cè)的豬Fosl2氨基酸序列；下行中的下劃線表示延伸主鏈，波浪線表示無(wú)規(guī)則卷曲，雙劃線表示α-螺旋，加重加粗下劃線表示β-折疊；上行中字母加粗斜體表示該位點(diǎn)為酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，字母外加方框表示絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，字母本身只加粗表示蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。B圖中R表示無(wú)規(guī)則卷曲，B表示β-折疊，A表示α-螺旋，E表示延伸主鏈A.The physicochemical properties of Fosl2 amino acid sequence in pig；B.The prediction graph of Fosl2 amino acid sequence in pig.The upper line showed deduced amino acid sequences；The lower line extended strand was underlined，random coil was marked by wavy lines，alpha helix was double underlined，beta turn was bold underlined；The bold italic letter indicated Tyr phosphorylation sites，the blocked letter showed Ser phosphorylation sites，the only bold letter indicated Thy phosphorylation sites.In Fig.B，R showed random coil，beta turn was showed by B，alpha helix was showed by A，the extended strand was showed by E.圖4 豬Fosl2氨基酸序列理化性質(zhì)分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Physical and chemical properties analysis and secondary structure prediction of pig Fosl2 amino acids sequence

2.4 豬Fosl2 mRNA組織表達(dá)特性

Fosl2基因在不同時(shí)期豬心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌、背部脂肪中的發(fā)育性表達(dá)量見表3。結(jié)果表明，F(xiàn)osl2基因在上述7種組織的4個(gè)不同時(shí)期(7、30、60和180日齡)都有不同程度的表達(dá)：肺不同時(shí)期的表達(dá)量均不同程度的高于同時(shí)期的其他組織表達(dá)量，其中7日齡為表達(dá)量最高值，且顯著高于其他日齡(P<0.05)，隨后30日齡表達(dá)量驟然下降(P<0.05)并達(dá)到最低值，隨后開始逐漸上升。其余組織在7日齡為表達(dá)量最大值的還有肝、脾和腎，肝在7日齡后表達(dá)量逐漸下降，且到60日齡時(shí)為最低值，180日齡時(shí)又有回升；脾則表現(xiàn)出先降低后升高，隨后再降低的曲折線表達(dá)模式；腎則是從7日齡后，表達(dá)量一直呈下降的趨勢(shì)。心和背部脂肪在4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，均為30日齡時(shí)表達(dá)量降低，隨后逐漸增加，直到180日齡時(shí)表達(dá)含量達(dá)到最高值。背最長(zhǎng)肌內(nèi)的表達(dá)量在30日齡時(shí)達(dá)到最大值，隨后又逐漸降低直至180日齡時(shí)達(dá)到最低值。

表3 豬Fosl2基因的組織表達(dá)量

Table 3 The expression of pigFosl2 in different tissues

組織Tissue7日齡7d30日齡30d60日齡60d180日齡180d心Heart0.018±0.0010ab0.0071±0.0013a0.019±0.0044ab0.026±0.0039b肝Liver0.076±0.021b0.037±0.0036a0.011±0.0056a0.036±0.0041a脾Spleen0.22±0.042b0.064±0.013a0.21±0.065b0.12±0.012ab肺Lung1.4±0.17c0.21±0.023a0.55±0.12ab0.87±0.059b腎Kidney0.095±0.01b0.063±0.036ab0.058±0.0051ab0.022±0.0021a背最長(zhǎng)肌Longissimusmuscle0.0071±0.00021b0.015±0.00051c0.0041±0.0011a0.0037±0.00095a背部脂肪Backfat0.021±0.0048a0.088±0.0043b0.041±0.0015a0.14±0.012c

同行數(shù)據(jù)后所標(biāo)數(shù)字相同表示差異不顯著(P>0.05)，所標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

In the same tissue,values with the same letter show no significant difference(P>0.05)；value with the different letter show significant difference(P<0.05)

3 討 論

本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲得豬Fosl2基因的CDS區(qū)，其包含984個(gè)堿基，編碼327個(gè)氨基酸。人Fosl2全長(zhǎng)25.17 kb，cDNA為981 bp，編碼由326個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白[11]。小鼠的Fosl2全長(zhǎng)22.05 kb，編碼由326個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白[12]。研究預(yù)測(cè)豬Fosl2基因編碼蛋白質(zhì)的理論分子量為35.33 ku，為跨膜非分泌型蛋白，具有14個(gè)疏水區(qū)，但其屬于親水性蛋白，由此可推測(cè)，F(xiàn)osl2可能存在膜結(jié)合形式，并作為機(jī)體某些調(diào)控機(jī)制的載體通道。通過(guò)不同脊椎動(dòng)物種間Fosl2基因的同源性比較，發(fā)現(xiàn)Fosl2基因物種間的同源性很高，尤其與大猩猩核苷酸序列的同源性高達(dá)100%，與虎鯨的同源性也高達(dá)94%，這表明該基因的進(jìn)化保守性非常高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)osl2蛋白在122～187位氨基酸含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，正是通過(guò)該區(qū)域，F(xiàn)osl2蛋白與Jun基因家族編碼的蛋白聚合成AP1，進(jìn)而發(fā)揮其作用。

本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)7、30、60和180日齡豫南黑豬的心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌以及背部脂肪中Fosl2基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，F(xiàn)osl2基因擁有廣泛的表達(dá)譜，在上述組織的不同發(fā)育階段均有不同程度的表達(dá)，7日齡肺內(nèi)的表達(dá)量明顯高于其他組織，因此推測(cè)該基因與胚胎肺部組織的早期發(fā)育相關(guān)。一些病理的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)osl2基因的不同表達(dá)量與肺部組織的階段性發(fā)育調(diào)節(jié)或病變相關(guān)，R.Eferl等[13]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)osl2基因參與調(diào)控肺纖維化病變過(guò)程中的細(xì)胞外基質(zhì)生成，并認(rèn)為該基因是引起肺纖維化的一種致病因子，F(xiàn)osl2轉(zhuǎn)基因小鼠較正常小鼠更易患上嚴(yán)重的非特異間質(zhì)性肺炎等肺病，本試驗(yàn)中，肺Fosl2基因的表達(dá)量在30日齡下降、后又上升的規(guī)律，反映出該基因可能在豬肺的發(fā)育過(guò)程中有某些特殊意義，其在病理研究中的發(fā)現(xiàn)提示該基因可能參與豬肺部疾病的發(fā)生，這還需要更深入的試驗(yàn)佐證。

C.Wrann等[2]證實(shí)，哺乳動(dòng)物類細(xì)胞Fosl2基因的敲除會(huì)導(dǎo)致瘦素基因(Leptin，LEP)表達(dá)量的降低，F(xiàn)osl2的過(guò)量表達(dá)會(huì)促進(jìn)小鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)LEP基因表達(dá)量的增加，而瘦素與哺乳動(dòng)物的能量代謝、脂肪生成息息相關(guān)。C.Wrann[14]發(fā)現(xiàn)Fosl2基因?qū)﹄x體培養(yǎng)的細(xì)胞以及小鼠體內(nèi)LEP基因的表達(dá)發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本試驗(yàn)中，背部脂肪內(nèi)Fosl2基因在30日齡時(shí)的表達(dá)量較7日齡顯著升高，60日齡時(shí)又有顯著下降，180日齡的表達(dá)量顯著上升，結(jié)合豬的整個(gè)生長(zhǎng)階段分析其原因：30日齡是仔豬的哺育階段，體內(nèi)脂肪或者細(xì)胞分裂有較快且明顯的增加，因而Fosl2表達(dá)量升高；隨后60日齡保育階段，仔豬的飼料結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致仔豬掉膘，其體內(nèi)脂肪的蓄積略有降低，因而Fosl2表達(dá)量降低；180日齡時(shí)Fosl2基因的表達(dá)量驟然上升，這可能是由于育肥豬此階段生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)充足、體內(nèi)脂肪快速蓄積[15]；綜合該基因的變化趨勢(shì)與豬脂肪的生長(zhǎng)規(guī)律，推測(cè)該基因可能通過(guò)與LEP基因的相互協(xié)調(diào)作用影響豬的脂肪生成，同時(shí)參與調(diào)控育肥期豬的瘦肉率，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)速度，這種推測(cè)如果得到證實(shí)，將對(duì)豬育種工作發(fā)揮一定的作用。

N.Reich等發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)osl2轉(zhuǎn)基因小鼠從12周開始，皮膚發(fā)生纖維化病變，成肌纖維細(xì)胞的分化增強(qiáng)[16]，另外，F(xiàn)osl2基因的沉默表達(dá)促進(jìn)了肌肉肌酸激酶和肌球蛋白重鏈表達(dá)含量的升高[17]。豬肉品質(zhì)的評(píng)判指標(biāo)中，嫩度是肉的主要食用品質(zhì)之一，而嫩度是由肌肉中各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定的。同時(shí)肌肉系水力是一項(xiàng)重要的肉質(zhì)性狀，它不僅影響肉的色香味、營(yíng)養(yǎng)成分、多汁性、嫩度等食用品質(zhì)，而且有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而系水力大部分是由肌肉的纖維結(jié)構(gòu)和毛細(xì)血管張力而定。本試驗(yàn)中，肌肉內(nèi)Fosl2基因的表達(dá)量在30日齡達(dá)到最大值，而此時(shí)正是肌肉細(xì)胞的快速分裂增長(zhǎng)期[15]，60和180日齡該基因的表達(dá)量較30日齡有顯著降低，原因可能是肌肉的生長(zhǎng)速度降低，因此推測(cè)Fosl2基因可能參與豬肌肉生成的調(diào)控過(guò)程，進(jìn)而對(duì)豬肉的品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。

Fosl2基因在脾、腎、肝、心等組織中也有適量表達(dá)。但4種內(nèi)臟中Fosl2的表達(dá)規(guī)律卻不盡相同：脾呈現(xiàn)30日齡稍有下降、60日齡小幅上升、180日齡再降低的曲折線表達(dá)規(guī)律；7日齡的腎表達(dá)量最高，隨后其表達(dá)量緩慢降低；肝是自7日齡后開始降低，60日齡為最低表達(dá)量，隨后的180日齡又有所回升；心內(nèi)30日齡為最低表達(dá)量，后又有所回升，直到180日齡時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最大值。Fosl2基因在不同內(nèi)臟組織中表達(dá)規(guī)律的差異性也預(yù)示著該基因可能參與多種內(nèi)臟的發(fā)育過(guò)程，這需要更深入的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功克隆豬Fosl2基因CDS區(qū)，分析其種間高度保守性，該基因編碼肽鏈無(wú)信號(hào)肽，為跨膜非分泌型蛋白，第122～187位氨基酸位點(diǎn)存在亮氨酸鏈結(jié)構(gòu)域。豬Fosl2基因在肺組織內(nèi)的表達(dá)量均高于同時(shí)期在心、肝、腎、脾、背最長(zhǎng)肌和背部脂肪內(nèi)的表達(dá)量，推測(cè)該基因可能參與肺組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程；另外該基因在脂肪組織內(nèi)的表達(dá)變化規(guī)律與豬發(fā)育階段的脂肪生長(zhǎng)規(guī)律一致，預(yù)測(cè)該基因可能參與豬的脂肪生長(zhǎng)調(diào)控進(jìn)而影響瘦肉率；該基因在豬的心、肝、脾、腎、背最長(zhǎng)肌中的功能作用，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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(編輯 郭云雁)

Gene Cloning，Bioinformatics Analysis and Developmental Expression ofFosl2 Gene in Pig

FAN Xing-xing，LI Xin-jian，LI Gai-ying，GUO Ji-li，HAN Xue-lei，Lü Gang，REN Guang-zhi*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

The study was conducted to clone and analyze CDS sequence of pigFosl2 gene，and to investigate the developmental expression ofFosl2 in pig various tissues(heart，liver，spleen，lung，kidney，the longissimus muscle and backfat) at different stages.In this study，Yunan Black pig was used as experimental animal to clone the CDS region ofFosl2 gene by RT-PCR，the protein structure were predicted by bioinformatics，meanwhile，qRT-PCR was used to analyze developmental expression ofFosl2 gene in pig from 7- to 180-day-old.The results showed that the CDS of pigFosl2 gene was 984 bp，encoding 327 amino acids.It had no signal peptide in peptide chain，but had a transmembrane domain and a basic-domain leucine-zipper，which were from 17 to 33 amino acids and from 122 to 187 amino acids,respectively.The protein of pig Fosl2 had high conservatism among mammal，and it was transmembrane and non-secretory protein.TheFosl2 was widely expressed in tissues，the expression ofFosl2 in lung was higher than other tissues at the same stage，it was deduced that pigFosl2 might be related to the process of lung development；the variation trend in backfat showed thatFosl2 might had the function enhancing adipogenesis and then regulate lean meat percentage.Therefore，the results of this study may lay foundation for further research on the structure and the role ofFosl2 gene in physiogenesis in pig.

pig;Fosl2；cloning；sequence analysis；developmental expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.006

2014-05-26

河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(S2012)

范興興(1988-)，女，河南三門峽人，碩士生，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究，E-mail:13643806298@163.com

*通信作者：任廣志，教授，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究，E-mail: rgzhxt@163.com

S828.2

A

0366-6964(2015)02-0211-08