京海黃雞新城疫和傳染性支氣管炎抗病性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

王文浩，張 濤，王金玉*，張跟喜，樊慶燦，陳學(xué)森，韓鯤鵬，王永娟

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 2．江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；3.江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)，南通 226103)

京海黃雞新城疫和傳染性支氣管炎抗病性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

王文浩1，2，張 濤1，2，王金玉1，2*，張跟喜1，2，樊慶燦1，2，陳學(xué)森1，2，韓鯤鵬1，2，王永娟3

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 2．江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；3.江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)，南通 226103)

旨在尋找影響京海黃雞新城疫和傳染性支氣管炎抗病性狀的SNP位點(diǎn)。本研究采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的方法，檢測(cè)京海黃雞基因組的SNP位點(diǎn)，并對(duì)這些位點(diǎn)與新城疫和傳染性支氣管炎性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：在基因組水平上有1個(gè)與京海黃雞新城疫抗病性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，7個(gè)與該性狀潛在顯著的SNPs位點(diǎn)，并將這些位點(diǎn)定位到5個(gè)基因上，分別為EEA1、CARS2、SCML2、GRP20以及TOMIL2基因，這些基因均可能影響或調(diào)控機(jī)體的抗病及免疫能力，可以考慮作為京海黃雞新城疫抗病性狀的候選基因作為后續(xù)研究。沒有發(fā)現(xiàn)與京海黃雞傳染性支氣管炎顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，該性狀可能是復(fù)雜性狀，受到多種因素的影響。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)可能對(duì)京海黃雞的新城疫抗病性狀存在一定的影響，可以作為候選基因，為京海黃雞抗病育種過程中的標(biāo)記輔助選擇提供參考資料。

京海黃雞；簡(jiǎn)化基因組測(cè)序；抗病性狀；SNPs

全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)是以遍布于整個(gè)基因組的單核苷酸多態(tài)性(SNP)為分子標(biāo)記，以發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀發(fā)生的遺傳標(biāo)記和遺傳標(biāo)記的分布特征為目的，對(duì)復(fù)雜的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行直接的關(guān)聯(lián)分析[1]。與以往的方法相比，全基因組關(guān)聯(lián)分析最大優(yōu)點(diǎn)：不需要在研究之前，根據(jù)那些并沒有完全研究清楚的分子機(jī)理來假定某個(gè)基因或位點(diǎn)與研究的經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)。即GWAS不需要構(gòu)建任何不確定的假設(shè)。GWAS是直接在全基因組范圍內(nèi)篩選與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)的方法[2]。

2005年，《Science》發(fā)表了一篇關(guān)于年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜黃斑變性的GWAS文章，引起了生物學(xué)界和醫(yī)學(xué)界學(xué)者們的廣泛關(guān)注[3]，這是GWAS的首次報(bào)道。隨后，研究者們開展了一系列關(guān)于人類遺傳疾病的GWAS研究。2008年，J.C.Barrett[4]使用全基因關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與克羅恩病關(guān)聯(lián)顯著的SNP位點(diǎn)。2009年，L.A.Weiss[5]對(duì)人的自閉癥進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的染色體區(qū)域。在豬上，N.Duijvesteijn 等[6]以 987 頭杜洛克為試驗(yàn)動(dòng)物，使用60K SNP芯片，研究了公豬屠體中的雄烯酮含量，發(fā)現(xiàn)了37 個(gè)與雄烯酮含量關(guān)聯(lián)顯著的SNP，這些SNP主要分布于1號(hào)和6號(hào)染色體上。在牛上，L.Jiang等[7]以14個(gè)半同胞家系組成的2 093中國荷斯坦奶牛為試驗(yàn)動(dòng)物，使用牛50 kb SNP 芯片，結(jié)合混合線性模型和遺傳傳遞不平衡的方法，對(duì)產(chǎn)奶性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了105個(gè)與中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀關(guān)聯(lián)顯著的SNPs。家禽上，R.Liu等[8]使用雞Illumina 60K SNP芯片，研究北京油雞的屠宰和肉質(zhì)性狀，發(fā)現(xiàn)了24個(gè)與雞的屠宰性狀關(guān)聯(lián)顯著和潛在顯著的SNP。L.Xie 等[9]使用雞Illumina60 K SNP芯片，對(duì)白洛克和杏花雞的F2代雜交群體的體重性狀和日增重性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)雞1號(hào)染色體的173.5～175.0區(qū)域是與雞的體重和日增重性狀關(guān)聯(lián)顯著的SNP集中區(qū)域。該區(qū)域存在極為明顯的連鎖現(xiàn)象。

每年因?yàn)榧膊〗o家禽業(yè)帶來巨大的損失。對(duì)于抗病性能的選擇，常規(guī)育種具有一定的難度，分子遺傳學(xué)技術(shù)雖然迅猛發(fā)展，但在雞抗病研究未見有實(shí)質(zhì)性的成效。相對(duì)于生產(chǎn)性能，家禽抗病性的研究總體偏少[10]，對(duì)于抗病育種的選擇方法、選擇性狀和選擇標(biāo)記都仍然處于探索中。本研究采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，旨在尋找影響京海黃雞新城疫和傳染性支氣管炎抗體水平相關(guān)聯(lián)的SNPs和相關(guān)的基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)群體為京海黃雞育種場(chǎng)11世代核心群純種母雞400只。所有母雞同一批次孵化，在同一雞舍內(nèi)，以相同條件飼養(yǎng)，其健康狀況良好，無患病記錄，且均有系譜可查，彼此間親緣關(guān)系清楚。所有個(gè)體在1日齡時(shí)帶翅號(hào)，按照既定免疫日程進(jìn)行免疫(表1)。所有個(gè)體于60日齡時(shí)采集血液3 mL，其中1.5 mL用于禽血DNA的提取，1.5 mL用于析出血清，測(cè)定新城疫和傳染性支氣管炎抗體滴度。其中，DNA提取采用北京艾德萊生物公司試劑盒，用核酸分析儀分析其濃度和純度?？贵w滴度的測(cè)定采用美國AFFINITECH新城疫和傳染性支氣管炎抗體ELISA檢測(cè)試劑盒。

1.2 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

提取后質(zhì)檢合格的DNA樣品送于北京百邁克生物技術(shù)公司進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。測(cè)序原理：利用酶切預(yù)測(cè)軟件對(duì)參考基因組的GC含量、重復(fù)序列情況和基因特點(diǎn)等信息進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)標(biāo)記開發(fā)方案。利用上述分析得出的酶切組合對(duì)DNA進(jìn)行酶切打斷試驗(yàn)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行一系列修復(fù)、修飾后進(jìn)行橋式擴(kuò)增。用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，通過PCR擴(kuò)增，增大文庫量，建好的文庫用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序(圖1)。然后將測(cè)序得到的reads(雙端序列)比對(duì)到參考基因組Gallus_gallus.WASHUC2.59上，通過篩選獲得SLAF片段后進(jìn)行SNP檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

通過SPSS11.0軟件統(tǒng)計(jì)所測(cè)抗體水平的均值、極值、方差、標(biāo)準(zhǔn)差、偏度等?？紤]到群體遺傳背景間差異可能導(dǎo)致的群體分層現(xiàn)象，通過主成分分析法對(duì)群體分層進(jìn)行評(píng)估，再繪制QQ-plot圖來對(duì)群體分層進(jìn)行檢測(cè)。全基因組關(guān)聯(lián)分析采用GAPIT軟件的混合線性模型(Mixed liner model，MLM)完成，公式：

表1 京海黃雞免疫日程

Table 1 Jinghai Yellow chicken’s immunization schedule

日齡/dDay周齡Week疫苗名稱Name代號(hào)Code方法Method備注Note1馬立克CV1988頸皮注孵化廳1威支靈滴眼3球蟲Coccivac飲水10禽流感AI-K頸皮注0.2mL·羽-114法氏囊弱毒D78飲水21法氏囊弱毒D78飲水24新城疫油苗ND-K頸皮注24新支二聯(lián)ND+IB滴眼3雞痘FP刺眼7新城疫油苗ND-K注射0.25mL·羽-1新支二聯(lián)飲水

y=Xα+Qβ+Kμ+e

其中，通過PCA計(jì)算樣品的聚類主成分，以PC1、PC2定義群體的群體結(jié)構(gòu)Q，通過GAPIT軟件計(jì)算樣品間親緣關(guān)系Kinship(K)，X為基因型，y為表型，最終每個(gè)SNP位點(diǎn)都能得到一個(gè)與相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)值；用Bonferroni法對(duì)混合線性模型計(jì)算得出的P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正[10]，篩選出全基因組范圍內(nèi)顯著、潛在顯著的SNP位點(diǎn)。

1.4 功能位點(diǎn)基因注釋和生物學(xué)功能挖掘

使用BLAST軟件將關(guān)聯(lián)位點(diǎn)前后50 kb范圍內(nèi)的基因序列與參考基因組Gallus_gallus.WASHUC2.59進(jìn)行對(duì)照，找出該位點(diǎn)在基因組上所在位置。并將此結(jié)果與 nr、SwissProt、GO、COG、KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得多變區(qū)基因的注釋信息，進(jìn)而探索基因與性狀之間的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 DNA質(zhì)檢及抗體水平測(cè)定

提取的DNA使用核酸蛋白分析儀測(cè)定基因組DNA的濃度和純度，確保所有基因組濃度大于100 ng·mL-1，OD260 nm/OD280 nm值為1.7～1.8。使用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA有無拖尾現(xiàn)象(圖2)。新城疫和傳染性支氣管炎抗體滴度的描述性統(tǒng)計(jì)見表2。

圖1 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序原理Fig.1 The theory of SLAF-seq

圖2 凝膠電泳檢測(cè)圖Fig.2 Gel electrophoresis of each sample

表2 凝抗體滴度描述性統(tǒng)計(jì)分析

Table 2 Antibody’s descriptive statistical analysis

疾病Disease統(tǒng)計(jì)量Stastics最大值Max最小值Mim均值Mean標(biāo)準(zhǔn)差SD變異系數(shù)C.V.新城疫ND3961415.172.400.123傳染性支氣管炎IB3991516.93.070.122

2.2 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

根據(jù)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，首先進(jìn)行酶切，然后對(duì)酶切片段雙端測(cè)序后，所有樣品共得到329 314 696個(gè)測(cè)序reads，保留測(cè)序單堿基錯(cuò)誤率占總堿基數(shù)目的比率在1/100以下的resds，再使用SOAP軟件將各個(gè)樣品數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組Gallus_gallus.WASHUC2.59，選取雙端reads都比對(duì)到基因組上的reads，Pair-end和Single-end效率越高，測(cè)序質(zhì)量越好。得到整體的比對(duì)效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。再根據(jù)比對(duì)糾錯(cuò)結(jié)果，選取樣品平均深度在2以上的group，定義SLAF標(biāo)記，得到94 926個(gè)SLAF標(biāo)記以及在每個(gè)染色體上的分布(表4)，再根據(jù)定義好的SLAF標(biāo)記，進(jìn)行基于樣品的群體內(nèi)部SNP檢測(cè)(表5)，再對(duì)測(cè)得的SNPs做質(zhì)量控制：剔除基因型檢出率小于80%、剔除最小基因頻率小于3%的個(gè)體，最終得到符合條件的可用于后續(xù)分析的306 322個(gè)SNPs。

表3 獲得的reads與參考基因組對(duì)比后結(jié)果

Table 3 The comparison result between obtained reads number and reference genome sequence %

Pair-end percentage為雙端都比對(duì)到基因組上的reads占總reads的比例；Single-end percentage為一端比對(duì)到基因組上而另一端沒比對(duì)到基因組上的reads占總reads的比例；Unmap percentage為未比對(duì)到基因組上的reads占總reads的比例

Pair-end percentage means the ratio of double end sequence to the original sequence;Single-end percentage means only one end can comparise to the original sequence;Unmap percentage means no end can comparise to the original sequence

表4 SLAF標(biāo)記統(tǒng)結(jié)果

Table 4 SLAF marker’s statistical result

染色體ChromosomeSlAF標(biāo)記數(shù)SlAF_number染色體ChromosomeSlAF標(biāo)記數(shù)SlAF_number117713151541213092164239980174504776118138855432191313633882017697344621903828262245692442237431020182482411177625158122031266681318902766314174528489

表5 SLAF多態(tài)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Table5 SLAF’s polymorphism statistical result

SLAF數(shù)量SLAFnumber總深度Totaldepth平均深度AveragedepthSLAFpolyPoly率/%Polyratio949261586974055.189492099.99

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

基于SNP，通過admisture軟件，計(jì)算樣品的群體結(jié)構(gòu)，做樣品的群體結(jié)構(gòu)聚類分析，分別假設(shè)400個(gè)樣品的分群數(shù)(K值)為1～10，進(jìn)行聚類，聚類結(jié)果如圖3；再充分考慮個(gè)體間親緣關(guān)系可能導(dǎo)致的群體分層的影響，做出2個(gè)性狀的QQ-plot圖(圖4)，如圖4所示，通過SNP關(guān)聯(lián)分析計(jì)算的觀測(cè)值(縱坐標(biāo))在期望值(橫坐標(biāo))上方，說明并無群體分層現(xiàn)象，基于混合線性模型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果是比較可靠的，可以進(jìn)行后續(xù)分析；將聚類分析結(jié)果帶入GAPIT混合線性模型分析軟件，將簡(jiǎn)化基因組測(cè)序得出的SNPs分別與京海黃雞的新城疫、傳染性支氣管炎抗體滴度指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，每個(gè)SNP都對(duì)應(yīng)一個(gè)與相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析后得到的P值，再用Bonferroni法對(duì)該混合線性模型計(jì)算得出的P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得出在全基因組水平上顯著關(guān)聯(lián)的P值為3.3×10-7，在全基因組水平上潛在顯著關(guān)聯(lián)的P值為3.3×10-6。

根據(jù)上述分析模型以及多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，在全基因組水平上找到了1個(gè)與新城疫抗病性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，找到了7個(gè)與新城疫抗病性狀潛在顯著的SNPs位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)序列號(hào)、所在染色體上位置、對(duì)應(yīng)P值以及距離最近基因如表6所示；而對(duì)于傳染性支氣管炎抗病性狀，未找到在全基因組水平上顯著或者潛在顯著的SNP位點(diǎn)。

A圖中每種顏色代表一個(gè)群，每行代表一個(gè)分群值的情況；圖中展示了400個(gè)樣品分群值為1～10的聚類情況，B圖中為每個(gè)K值對(duì)應(yīng)的C.V.值，K為1的時(shí)候最小In the figure A，every colour stands for a group，each line means a situation of a cluster；Figure B shows clustering situation that the cluster number varies from 1 to 10圖3 群體結(jié)構(gòu)聚類圖Fig.3 Clustering figure of group structure

上圖通過SNP關(guān)聯(lián)分析計(jì)算的觀測(cè)值(縱坐標(biāo))均在期望值(橫坐標(biāo))上方，說明并無群體分層現(xiàn)象Both of the observed values are higher than expected values，shows no population stratification圖4 兩個(gè)性狀的QQ-plot圖Fig.4 QQ-plot pictures of two traits

2.4 功能位點(diǎn)的基因注釋和生物學(xué)功能挖掘

基于雞基因組Gallus_gallus.WASHUC2.59的基因組信息對(duì)GIWAS分析結(jié)果進(jìn)行了注釋，并一一列出(表6)，同時(shí)用nr、SwissProt、GO、COG、KEGG等數(shù)據(jù)庫對(duì)上述5個(gè)基因進(jìn)行了注釋，探索其生物學(xué)功能以及與性狀之間可能的關(guān)系。

早內(nèi)體抗原1(Early endosome antigen 1，EEA1)。上述數(shù)據(jù)庫注釋后得出該蛋白細(xì)胞分布為膜片段、核、早內(nèi)體、胞漿、外部質(zhì)膜；該蛋白能具有保守的結(jié)構(gòu)域，如核酸結(jié)合域、鈣調(diào)蛋白結(jié)合域、鋅離子結(jié)合域等，參與膜泡結(jié)合、突觸膜泡內(nèi)體融合、早內(nèi)體晚內(nèi)體運(yùn)輸?shù)纫幌盗猩顒?dòng)。

半胱氨酸-轉(zhuǎn)移核糖核酸酶2(Cysteinyl-tRNA synthetase 2，CARS2)，根據(jù)上述數(shù)據(jù)庫的注釋，得出該蛋白細(xì)胞分布為線粒體、胞漿；分子功能包括調(diào)控半胱氨酸-轉(zhuǎn)移核糖核酸連接酶活性，也具有保守的結(jié)構(gòu)域，如核苷酸結(jié)合域、ATP結(jié)合域以及金屬離子結(jié)合域；參與的生物學(xué)過程包括半胱氨酸-轉(zhuǎn)移核糖核酸的氨?；饔?。

中足性梳樣2(Sex comb on midleg-like 2，SCML2)，根據(jù)上述數(shù)據(jù)庫的注釋，得出其細(xì)胞分布為PcG蛋白質(zhì)復(fù)合體、核腔、染色質(zhì)核仁；分子功能包括調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、也具有核小體結(jié)合域、組蛋白結(jié)合域、DNA結(jié)合域；參與的生物進(jìn)程包括染色質(zhì)重組、DNA模板化轉(zhuǎn)錄的正負(fù)調(diào)控、精子的形成、胚胎的形態(tài)發(fā)生、造血作用、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期的調(diào)控、多細(xì)胞動(dòng)物有機(jī)體發(fā)育的調(diào)控等。

G蛋白偶聯(lián)受體20(G protein-coupled receptor 20，GPR20)，屬于與G蛋白有信號(hào)連接的一大類受體家族的一員，根據(jù)上述數(shù)據(jù)庫的注釋，得出其為質(zhì)膜的有機(jī)組成部分；分子功能包括調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體的活性、具有特定的蛋白結(jié)合域、小分子結(jié)合域；參與的生物進(jìn)程包括參與免疫系統(tǒng)內(nèi)淋巴細(xì)胞的活化、白血球的分化、正調(diào)控白血球的活化作用和免疫效應(yīng)的過程、調(diào)控骨髓白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、參與腎的系統(tǒng)進(jìn)程包括全身動(dòng)脈血壓的調(diào)控、G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)通路、血液凝固、負(fù)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、正調(diào)控細(xì)胞的代謝過程、粒細(xì)胞的激活、正調(diào)控細(xì)胞因子的分泌等。

myb1樣靶標(biāo)2(Target of myb1-like 2，TOM1L2)，根據(jù)上述數(shù)據(jù)庫的注釋，得出其存在于胞質(zhì)、胞膜、早期內(nèi)體、部分細(xì)胞器；分子功能包括調(diào)控蛋白激酶活化劑的活性、有特定的蛋白質(zhì)結(jié)合域；參與的生物進(jìn)程包括細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)吞作用、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路、內(nèi)小體轉(zhuǎn)運(yùn)。

表6 每個(gè)SNP位點(diǎn)在染色體上位置以及對(duì)應(yīng)P值

Table 6 The chromosome location of every SNP and itsPvaule

序列號(hào)SNPID染色體Chromosome位置/bpPositionP值Pvaule最近基因Proximalgene距離/bpDistancers1465925871465925872.39E-07EEA116647rs151056686315105668633.48E-07-rs118584710811.86E+085.76E-07CARS242388rs112412613111.24E+087.50E-07SCML2withinrs215218592421.52E+089.58E-07GPR20375711rs117497640011.75E+081.96E-06-rs1449416461449416462.29E-06TOM1L2646rs6332074206332074202.44E-06-

3 討 論

本研究采用了簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的方法來尋找全基因組范圍內(nèi)的SNP，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(Reduced-representation sequencing)技術(shù)即是指利用生物信息學(xué)方法，設(shè)計(jì)標(biāo)記開發(fā)方案，篩選特異性長度片段，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)獲得海量標(biāo)簽序列來充分代表目標(biāo)物種全基因組信息的測(cè)序方法，是將整個(gè)基因組進(jìn)行“簡(jiǎn)化”后進(jìn)行的測(cè)序。它有著通量高、準(zhǔn)確率高、數(shù)據(jù)利用率高、性價(jià)比高以及不受參考基因組限制，對(duì)沒有參考基因組的物種也可以進(jìn)行大規(guī)模篩查SNP位點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)[11-12]，與傳統(tǒng)的芯片技術(shù)相比，它更有助于一些未知SNP位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。后續(xù)的多重假設(shè)檢驗(yàn)校正時(shí)，公式為P=ɑ/n，其中n為質(zhì)控后所有用于后續(xù)分析的SNP數(shù)，雞上較常用的芯片一般找出的SNPs數(shù)約幾萬個(gè)，而本試驗(yàn)經(jīng)質(zhì)控合格后用于后續(xù)分析的SNPs超過30萬個(gè)，因此為了降低假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，適當(dāng)提高了ɑ值(由0.05提高到0.1)，最終得出在全基因水平上顯著關(guān)聯(lián)的P值。

目前在雞上對(duì)于遺傳相關(guān)性的研究主要集中在生長、繁殖等性狀，對(duì)于抗病性狀的研究并不多，究其原因是現(xiàn)在的抗病性狀界限難以區(qū)分，還存在一個(gè)確定的抗病性狀到底能不能代表抗病能力的問題，以及抗病性狀較難檢測(cè)、檢測(cè)費(fèi)用較高等，熟知的抗病性狀大多數(shù)是抗體[10]。本研究中，所有京海黃雞均確保同批次孵化、健康狀況良好、飼喂及外周環(huán)境保持一致、同時(shí)段免疫、免疫后同一日程采血，取血清檢測(cè)其抗體滴度，力求將可能影響結(jié)果的負(fù)面影響減到最小。

本研究發(fā)現(xiàn)，1號(hào)染色體上的EEA1基因與京海黃雞的新城疫抗體水平在基因組水平上顯著相關(guān)。最早從人體內(nèi)克隆出了一段編碼一種進(jìn)化上保守的180 ku的蛋白的cDNA，并命名為EEA1[11]，在人上，EEA1是一種與早期核內(nèi)體胞質(zhì)面瞬發(fā)性相關(guān)聯(lián)的親水性外周膜蛋白，同時(shí)EEAI自身抗體被認(rèn)為與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、亞急性皮膚紅斑狼瘡以及韋格納肉芽腫病有關(guān)[13]，同時(shí)根據(jù)數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果表明，該基因還具有特異性的核苷酸結(jié)合域，而根據(jù)已有文獻(xiàn)植物抗病基因編碼的蛋白大多富含氨基酸重復(fù)單位和核苷酸結(jié)合位點(diǎn)[14-15]，在動(dòng)物上未見該基因的相關(guān)報(bào)道，該基因可作為影響京海黃雞新城疫抗體水平的候選基因進(jìn)行后續(xù)研究。同時(shí)鑒定出4個(gè)基因(CARS2、SCML2、GPR20、TOMIL2)與京海黃雞新城疫抗體滴度存在潛在關(guān)聯(lián)。其中GPR20是G蛋白偶聯(lián)受體家族的一員，與核苷酸和脂類受體密切相關(guān)，并且已經(jīng)證明GPR20在沒有配合基的情況下能夠保持持續(xù)的活性來確保與它偶聯(lián)的G蛋白持續(xù)的活性[16]；CARS2是一種半胱氨酸-轉(zhuǎn)移核糖核酸酶，目前已經(jīng)在染色體上靠近CARS基因的地方發(fā)現(xiàn)了與糖尿病性腎病顯著相關(guān)的位點(diǎn)，并證明了這個(gè)I型糖尿病重要的晚期并發(fā)癥之前發(fā)病機(jī)理的通路研究[17]；SCML2屬于多梳家族的一員，該家族被認(rèn)為參與控制哺乳動(dòng)物的細(xì)胞增殖以及腫瘤發(fā)生[18]；TOMIL2基因目前未見相關(guān)報(bào)道。根據(jù)文獻(xiàn)和基因注釋結(jié)果綜合來看最終得到的5個(gè)基因均可能影響機(jī)體的抗病及免疫能力，可以考慮作為候選基因進(jìn)行后續(xù)研究。本研究未發(fā)現(xiàn)與京海黃雞傳染性支氣管炎抗病性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，可能是由于該性狀是一個(gè)復(fù)雜性狀，受到多重因素的影響相互抵消的結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的方法在全基因組范圍內(nèi)尋找影響京海黃雞新城疫和傳染性支氣管炎抗病性狀的SNP位點(diǎn)，最終在全基因范圍內(nèi)找到了1個(gè)與京海黃雞新城疫抗病性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，找到了7個(gè)與京海黃雞新城疫抗病性狀潛在顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，最終共定位到5個(gè)基因上，這5個(gè)基因均可能影響機(jī)體的抗病及免疫能力；全基因組范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)與傳染性支氣管炎顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)。該結(jié)果能夠?yàn)榫┖｜S雞及其他品種的研究提供一定的參考。

[1] HARDY J，SINGLETON A.Genomewide association studies and human disease [J].NewEnglandJMed，2009，360(17)：1759-1768.

[2] LIU Y Z，PEI Y F，LIU J F，et al.Powerful bivariate genome-wide association analyses suggest the SOX6 gene influencing both obesity and osteoporosis phenotypes in males [J].PLoSONE，2009，4(8)：e6827.

[3] KLEIN R J，ZEISS C，CHEW E Y，et al.Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration [J].Science，2005，308(5720)：385-389.

[4] BARRETT J C，HANSOUL S，NICOLAE D L，et al.Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn’s disease [J].NatGenet，2008，40(8)：955-962.

[5] WEISS L A.Autism genetics：emerging data from genome-wide copy-number and single nucleotide polymorphism scans [J].ExpertRevMolDiagnost，2009，9(8)：795-803.

[6] DUIJVESTEIJN N，KNOL E F，MERKS J W，et al.A genome-wide association study on androstenone levels in pigs reveals a cluster of candidate genes on chromosome 6 [J].BMCGenet，2010，11(1)：42.

[7] JIANG L，LIU J，SUN D，et al.Genome wide association studies for milk production traits in Chinese Holstein population [J].PLoSONE，2010，5(10)：e13661.

[8] LIU R，SUN Y，ZHAO G，et al.Genome-wide association study identifies loci and candidate genes for body composition and meat quality traits in Beijing-You chickens [J].PLoSONE，2013，8(4)：e61172.

[9] XIE L，LUO C，ZHANG C，et al.Genome-wide association study identified a narrow chromosome 1 region associated with chicken growth traits [J].PLoSONE，2012，7(2)：e30910.

[10] 胡耀東.雞 H/L 和 SRBC 遺傳選擇及部分抗病性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析 [D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012. HU Y D.The analysis of genetic selection of disease-resistant trait (H/L and SRBC) in chicken and genome-wide association study for part of disease-resistant traits [D].Ya’an：Sichuan Agricultural University，2012.(in Chinese)

[11] MU F T，JUDY M，STEELE-MORTIMER C O，et al.EEA1，an early endosome-associated protein[J].JBiolChem，1995，6(2):503-511

[12] SUN X W，LIU D Y，ZHANG X F，et al.SLAF-seq：An efficient method of large-scale De-Novo SNP discovery and genotyping using high-throughput sequencing[J].PLoSONE，2013，3(8)：e58700.

[13] SELAK S，WOODMAN R C，F(xiàn)RITZLER M J.Autoantibodies to early endosome antigen (EEA1) produce a staining pattern resembling cytoplasmic anti‐neutrophil cytoplasmic antibodies[J].ClinExpImmunol，2000，(122):493-498.

[14] 倪小勛，楊文才.番茄核苷酸位點(diǎn)(NBS)-亮氨酸富集重復(fù)(LRR)型抗病基因同源序列的分離與鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，(10)：1145-1151. NI X X，YANG W C.Isolation and analysis of nucleotide binding site (NBS)- leucine- rich- repeat (LRR) type resistance gene analogs in tomato (SolanumlycopersciumL.) [J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2013，(10)：1145-1151.(in Chinese)

[15] 謝 華，陳緒清，朱 郎，等.白菜類富含亮氨酸重復(fù)(LRR)抗病蛋白基因BcLRR cDNA克隆及其介導(dǎo)的植物軟腐病抗性分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，(3)：416-423. XIE H，CHEN X Q，ZHU L，et al.cDNA cloning of an leucine-rich repeats (LRR)- like disease resistance protein gene BcLRR from Chinese cabbage and its functional analysis in mediating plant resistance to Soft- rot disease [J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2010，(2)：416-423.(in Chinese)

[16] MEMOKO H，TAKEHIKO Y，TAKAO S.Characterization of an orphan G protein-coupled receptor，GPR20，that constitutively activates Giproteins[J].JBiolChem，2008，(283):12747-12755.

[17] PEZZOLESI M G，POZNIK G D，MYCHALECKYJ J C，et al.Genomy-wide association scan for diabetic nephropathy susceptibility genes in type 1 diabetes[J].Diabetes，2009，(6):1403-1410.

[18] 吳海輝.靈長類scml1基因分子進(jìn)化的初步研究 [D].北京：中國科學(xué)院研究生院，2009. WU H H.The preliminary research on the primate scml1 gene’s molecular evolution [D].Beijing：Graduate School of Chinese Academy of Sciences，2009.(in Chinese)

(編輯 郭云雁)

Genome-wide Association Studies for Jinghai Yellow Chicken’s ND and IB Disease Resistance Character

WANG Wen-hao1，2，ZHANG Tao1，2，WANG Jin-yu1，2*，ZHANG Gen-xi1，2， FAN Qing-can1，2，CHEN Xue-sen1，2，HAN Kun-peng1，2，WANG Yong-juan3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China; 2.KeyLaboratoryforAnimalGenetics，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，Yangzhou225009，China;3.JiangsuJinghaiPoultryIndustryGroupCo.，Ltd.，Nantong226103，China)

The objective of this study was to seek SNPs that influence Jinghai Yellow chicken’s ND and IB disease resistance character.The SNPs in Jinghai Yellow chicken were detected by SLAF-seq method and then the association of SNP sites with ND and IB disease resistance character were analyzed.The result showed that one SNP was significantly associated with ND disease resistance character，7 SNPs were potential significantly associated with ND disease resistance，and they were located in 5 genes：EEA1，CARS2，SCML2，GRP20 andTOMIL2；All of the 5 genes might influence or regulate organism’s disease resistance and immune ability and could be the candidate genes for Jinghai Yellow chicken’s disease resistance character.No SNP was found that was significantly associated with IB disease resistance character，this trait was complex and was rugulated by many factors.The results showed the 5 genes had influence on Jinghai Yellow chicken’s ND disease resistance characeter，and could provide the reference data for marker assisted selection of Jinghai Yellow chicken’s disease resistant breeding process.

Jinghai Yellow chiken；SLAF-seq；disease resistance character；SNPs

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.004

2014-05-09

江蘇省高校自然科學(xué)基金(12KJB230003)；國家自然科學(xué)基金( 31201793);國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-42-G1-05);江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程；江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

王文浩(1988-)，男，江蘇射陽人，博士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:691042495@qq.com

*通信作者：王金玉，E-mail:jywang@yzu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)02-0196-08