關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選

張 雯，許厚強(qiáng)*，陳 偉，3，陳 祥，桓聰聰，3，夏 丹，周 迪

(1.貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選

張 雯1，2，許厚強(qiáng)1，2*，陳 偉1，2，3，陳 祥1，2，桓聰聰1，2，3，夏 丹1，2，周 迪1，2

(1.貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

本研究旨在篩選出關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)GenBank已公布的牛MyoDI基因的啟動子序列，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，擴(kuò)增貴州關(guān)嶺牛MyoDI基因的啟動子區(qū)，構(gòu)建重組克隆載體pUCM-T-MyoDI -pro，并對陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。再利用篩選試驗(yàn)和生物信息學(xué)分析篩選出關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果，篩選出關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上含有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有SATB1、Xbp、MEF2、Pax-3、Pbx1、PPAR、TFⅡD、COUP-TF、Gfi-1、HNF-1、HOX4C、NRF2(ARE)、MEF1、RXR、SMUC、Snail、MyoD、VDR。結(jié)合在線軟件分析和文獻(xiàn)，最終篩選出關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上含有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、VDR和MEF2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這些轉(zhuǎn)錄因子對啟動子活性起著重要的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上含有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、VDR和MEF2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

MyoDI基因；轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；啟動子；細(xì)胞核提取物；生物信息學(xué)分析

生肌決定因子(Myogenic determination gene，MyoD)家族是肌肉生成過程中參與分子調(diào)控的一個重要基因家族[1]。該家族在肌細(xì)胞的分化和特化過程中具有重要意義，它們只表達(dá)在骨骼肌細(xì)胞及其前體細(xì)胞中，在非肌細(xì)胞系中的表達(dá)會被其他特異性基因抑制[2]。生肌決定因子I是MyoD家族的一員，它在肌肉特異基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著總開關(guān)的作用[1]。邱海芳等[3]研究還表明，MyoDI基因在肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。田璐等[4]研究發(fā)現(xiàn)，MyoDI基因顯著影響肉牛的多個肉質(zhì)性狀，如宰前活重、胴體重、凈肉重、眼肌面積等。MyoDI基因?qū)∪獾男纬珊腿赓|(zhì)性狀都具有顯著影響，這引起了大家對該基因的重視。

國內(nèi)外對MyoDI基因的研究在小鼠、雞和豬的肌細(xì)胞生成機(jī)理等方面較多，在牛上對該基因的研究則主要集中在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平[5]。目前，李飛等[6]研究表明，關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子具有啟動活性，能在小鼠骨骼肌細(xì)胞中特異性表達(dá)，但對MyoDI基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子作用機(jī)制還不清楚。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對肌肉特異性啟動子的轉(zhuǎn)錄活性及其對肌肉細(xì)胞增殖和分化的作用進(jìn)行了深入研究[7]，但由于肌細(xì)胞的分化特性導(dǎo)致多種肌肉特異性啟動子只在終末分化的肌細(xì)胞內(nèi)才能啟動基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，所以這些肌肉特異性啟動子在體外培養(yǎng)的肌源干細(xì)胞內(nèi)的啟動效率很低，這給肌肉機(jī)理研究帶來了困難[8-9]。關(guān)嶺牛具有體質(zhì)結(jié)實(shí)，肢蹄強(qiáng)健，行動靈活，耐勞、耐旱、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)等特性，是一個適宜山區(qū)耕作和放牧，有較好的挽力和產(chǎn)肉性能，廣大農(nóng)戶樂于飼養(yǎng)的優(yōu)良地方牛品種[10]。因此，本試驗(yàn)以關(guān)嶺牛為試驗(yàn)對象對其MyoDI基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行篩選，為下一步研究提供方向。

轉(zhuǎn)錄因子是一類細(xì)胞核蛋白，而轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)則是一些短的特定的DNA序列，一般為5～10個核苷酸，定位于啟動子、增強(qiáng)子、沉默子等順式作用元件。轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因調(diào)控區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，既可以啟動一組特定基因的表達(dá)，也可以關(guān)閉一組特定基因的表達(dá)[11-12]。這表明轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控序列的相互作用在決定某個基因是否表達(dá)中起著重要的作用。隨著對轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，尤其是近幾年染色質(zhì)免疫沉淀及生物信息學(xué)的發(fā)展，對進(jìn)一步研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了思路和方法[13]。本試驗(yàn)所用的試劑盒Promoter-Binding TF Profiling AssayⅡ具有靈敏度高、檢測速度快、檢測種類多、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，克服了凝膠遷移試驗(yàn)和構(gòu)建一系列啟動子缺失或突變的報(bào)告體的復(fù)雜性。

綜上所述，本試驗(yàn)利用探針和啟動子競爭性的與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的方法篩選MyoDI基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并結(jié)合生物信息學(xué)方法對關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子序列進(jìn)行分析，從而確定MyoDI基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這對探究MyoDI基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有重要意義，同時也為牛肉品質(zhì)的改善和牛產(chǎn)肉性狀的提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自大連TaKaRa公司；Promoter-Binding TF Profiling Assay Ⅱ和Nuclear Extraction Kit(Catalog Number SK-0001)試劑盒購自Signosis公司；2×Es Taq MasterMix和BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀(jì)公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、動物組織DNA提取試劑盒、T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 關(guān)嶺?；蚪MDNA的提取 利用動物組織DNA提取試劑盒提取關(guān)嶺牛背最長肌的基因組DNA，結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子的克隆 根據(jù)GenBank提供的牛MyoDI序列(登錄號NW_003104409)，利用在線軟件Promoter 2.0預(yù)測該基因的啟動子區(qū)，并利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行MyoDI基因啟動子區(qū)的克隆。上游引物F：5′- ACCTCCCGACATCATACATT-3′，下游引物R：5′-GGTTTGGGTTGCTAGACG-3′。以關(guān)嶺?；蚪MDNA為模板，利用常規(guī)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。20 mL總體積的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，35個循環(huán)；最后再72 ℃ 2 min，1個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。

1.2.3 pUCm-T-MyoDI-pro重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 利用T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒進(jìn)行pUCm-T-MyoDI-pro重組質(zhì)粒的構(gòu)建。將菌液PCR鑒定為陽性的克隆載體送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，并利用DNAMAN將測序結(jié)果與NCBI上的序列進(jìn)行比對。

1.2.4 關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選 利用Promoter-Binding TF Profiling Assay Ⅱ、所提的細(xì)胞核提取物和回收純化的目的片段進(jìn)行關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選試驗(yàn)(其原理是通過啟動子片段和有標(biāo)記的探針競爭性的與細(xì)胞核提取物里的蛋白結(jié)合，再通過柱離心和洗脫等步驟將復(fù)合物TF-bound probes分離下來，再將分離的復(fù)合物變性后與雜交板孵育，最后利用多功能酶標(biāo)儀檢測結(jié)果。流程見圖1)。本試驗(yàn)選雄激素受體(Androgen receptor，AR)作為空白對照，試驗(yàn)組與對照組的加樣體系按表1進(jìn)行(試驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行)。試驗(yàn)結(jié)束后對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理分析。將測序正確的序列利用在線軟件TFSEARCH (http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)和ALGGEN ROMO(http：//alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)進(jìn)行MyoDI基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測，綜合試驗(yàn)結(jié)果和預(yù)測結(jié)果進(jìn)行MyoDI基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選。

表1 試驗(yàn)組與對照組體系

圖1 試驗(yàn)原理圖Fig.1 The principle diagram of the experiment

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 本試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)按Signosis科研試劑產(chǎn)品中國總代理—武漢中幟生物科技有限公司提供的方法進(jìn)行處理分析：對照組處理結(jié)果=對照組結(jié)果的平均值-空白組的平均值；試驗(yàn)組處理結(jié)果=試驗(yàn)組結(jié)果的平均值-空白組的平均值；判斷值=對照組處理結(jié)果/試驗(yàn)組處理結(jié)果。

處理結(jié)果>50，且判斷值>3(這個標(biāo)準(zhǔn)由武漢中幟生物科技有限公司提供，因?yàn)閿?shù)值太小的數(shù)據(jù)誤差比較大)的確定啟動子區(qū)含有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA的提取

所提基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得單一無明顯拖尾的條帶(圖2)，表明可以用于目的片段的擴(kuò)增。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.基因組DNAM.DL15000 DNA marker；1.Genomic DNA圖2 關(guān)嶺?；蚪MDNAFig.2 The genomic DNA of Guanling cattle

2.2MyoDI基因啟動子克隆

目的片段的擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得單一目的條帶，目的片段大小與預(yù)期的牛MyoDI基因啟動子區(qū)大小(2 547 bp)一致(圖3)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4.關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL15000 DNA marker；1-4.PCR amplified products of Guanling cattle MyoDI promoter region圖3 關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)的克隆Fig.3 The cloning of the Guanling cattle MyoDI promoter region

2.3 pUCm-T-MyoDI-pro重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行的目的片段的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得單一的目的條帶，片段大小為2 547 bp，與預(yù)期相符(圖4)。將此PCR產(chǎn)物送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，其測序結(jié)果與NCBI上的牛MyoDI基因啟動子區(qū)序列的同源性為99.41%(圖5)，說明pUCm-T-MyoDI-pro構(gòu)建成功。這個差異是關(guān)嶺牛本身存在的，同時也用高保真酶進(jìn)行了該片段的擴(kuò)增和測序，測序結(jié)果表明，其與NCBI上的牛MyoDI基因啟動子區(qū)序列也存在差異，與本試驗(yàn)的測序結(jié)果一致。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.目的片段的克隆產(chǎn)物M.DL15000 DNA marker；1，2.The cloning products of purpose fragments圖4 以pUCm-T-MyoDI-pro為模板的目的片段的克隆Fig.4 The cloning of purpose fragment by the pUCm-T-MyoDI-pro as template

2.4 關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)目的片段和細(xì)胞核提取物的濃度測定

以測序正確的pUCm-T-MyoDI-pro質(zhì)粒為模板進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，將其PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收后，用微量紫外分光光度計(jì)檢測其濃度為370.5 ng·mL-1。利用多功能酶標(biāo)儀和BCA蛋白定量試劑盒檢測出關(guān)嶺牛肌肉組織的細(xì)胞核提取物濃度約為1.6 mg·mL-1。

圖5 關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子的序列與NCBI上序列的比對結(jié)果Fig.5 The comparison result between the sequence in the NCBI and the Guanling cattle MyoDI gene promoter sequence

2.5 關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選

圖6 篩選出的轉(zhuǎn)錄因子的對照組與試驗(yàn)組處理值的比較圖Fig.6 The comparison chart of the control and experimental groups processing value of the transcription factors screened

圖7 部分未篩選出的轉(zhuǎn)錄因子的對照組與試驗(yàn)組的處理值的比較圖Fig.7 The comparison chart of the control and experimental groups processing value of some transcription factors not screened

2.5.1 Promoter-Binding TF Profiling Assay Ⅱ的篩選結(jié)果 利用多功能酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光檢測功能對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測，得到一系列的數(shù)值，將數(shù)值按照試驗(yàn)方法里的數(shù)據(jù)分析進(jìn)行處理。處理值代表的是發(fā)光強(qiáng)弱，實(shí)質(zhì)是表示了細(xì)胞核提取物中的每個轉(zhuǎn)錄因子與對應(yīng)的探針綁定后被洗脫下來的探針多少，間接表明了啟動子上是否含有該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。從處理的數(shù)據(jù)結(jié)果來看(圖6和圖7)，可以初步判定MyoDI基因啟動子上有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：SATB1、Xbp、MEF2、Pax-3、Pbx1、PPAR、TFⅡD、COUP-TF、Gfi-1、HNF-1、HOX4C、NRF2(ARE)、MEF1、RXR、SMUC、Snail、MyoD、VDR。2.5.2 在線軟件對關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測

2.5.2.1 在線軟件TFSEARCH的預(yù)測結(jié)果：利用在線軟件TFSEARCH分析關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分析結(jié)果顯示，其上也含有MyoD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(表2)，與試驗(yàn)結(jié)果中含有的MyoD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)重復(fù)，進(jìn)一步推測該基因啟動子序列上存在MyoD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

2.5.2.2 在線軟件ALGGEN PROMO的預(yù)測結(jié)果：利用在線軟件ALGGEN PROMO分析關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分析結(jié)果顯示，其上也含有MyoD、VDR和TFIID轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(表3)，與試驗(yàn)結(jié)果吻合。

從試驗(yàn)結(jié)果可以得出，MyoDI基因啟動子上有SATB1、Xbp 、MEF2、Pax-3、Pbx1、PPAR、TFⅡD、COUP-TF、Gfi-1、HNF-1、HOX4C、NRF2(ARE)、MEF1、RXR、SMUC、Snail、MyoD、VDR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；軟件預(yù)測的結(jié)果中也含有MyoD、VDR和TFIID轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；又有文獻(xiàn)報(bào)道說肌肉特異性啟動子中含有Trex/MEF-3元件、MEF-1元件、Pax3/7元件、SRE元件、MEF-2元件、CACCC盒等[14]轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。所以，本試驗(yàn)綜合上述的結(jié)果篩選出關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、MEF2、VDR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

表2 在線軟件TFSEARCH對關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

表3 在線軟件ALGGEN PROMO對關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

3 討 論

目前，李飛等[6]已經(jīng)證實(shí)，關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子為骨骼肌特異性啟動子。本試驗(yàn)篩選出關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上含有MEF1、Pax3和MEF2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這與肌肉特異性啟動子中含有Trex/MEF-3元件、MEF-1元件、Pax3/7元件、SRE元件、MEF-2元件、CACCC盒等[14]轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的報(bào)道相符；與肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2( MEF-2)被認(rèn)為是絕大部分肌肉特異性基因的保守元件[15-19]的報(bào)道也相符；關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)的測序結(jié)果顯示其包含MEF-1元件的核心序列5′-CANNTG-3′(N代表任何一種堿基)[14]，進(jìn)一步證明關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)含有MEF-1元件。

MEF-1和MEF-2元件在肌肉特異性啟動子中具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。H.Weintraub等[19]研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)肌肉特異基因的上游調(diào)控區(qū)域存在MEF-1元件，該元件被堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)家族蛋白識別激活后發(fā)揮其調(diào)控作用，bHLH結(jié)構(gòu)主要存在于生肌調(diào)控家族因子中，如MyoD、Myf5、Myogenin和MRF4，它們在骨骼肌生長和發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，具有bHLH結(jié)構(gòu)域的MyoD蛋白能與靶基因啟動子區(qū)的MEF-1等順式作用元件結(jié)合而促進(jìn)靶基因特異性轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)肌纖維的形成[20]，這可能與MyoDI能激活自身的表達(dá)[4]有關(guān)，對于保持成肌作用具有重要意義。M.J.Potthoff等[21]在骨骼肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)MEF2與含bHLH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控肌肉基因的表達(dá)并起始生肌分化；P.M.Cunha等[22]研究發(fā)現(xiàn)，鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子lame duck可以與MEF2因子物理性協(xié)同結(jié)合，從而使轉(zhuǎn)錄因子MEF2更緊固地結(jié)合在肌肉特異性基因啟動子的MEF-2元件上并驅(qū)使肌管融合；突變鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子或MEF2后均可阻礙肌管的融合。

Pax3/7元件主要存在于生肌調(diào)控因子MRF基因啟動子的上游調(diào)控區(qū)，發(fā)揮著起始MRF基因表達(dá)的作用，在胚胎的骨骼肌發(fā)育中起至關(guān)重要的作用[14]研究表明，當(dāng)Pax3和Myf5均發(fā)生突變時，會導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞分化的失敗[23-24]；缺少Pax3和Pax7這兩種轉(zhuǎn)錄因子的小鼠，其后期肌肉發(fā)育失敗[25]。M.Buckingham等[26]推斷出Pax3/7復(fù)合物表達(dá)量的提高能加強(qiáng)生肌調(diào)控因子MRF對肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖并分化為肌纖維的指導(dǎo)；S.Kuang等[27]推斷Pax3/7復(fù)合物在成體骨骼肌中具有肌肉修復(fù)和再生的潛在功能；P.Hu等[28]發(fā)現(xiàn)Pax3/7復(fù)合物能與轉(zhuǎn)錄因子FoxO3協(xié)同激活成肌細(xì)胞C2C12中MyoD的表達(dá)，從而調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的分化。

另外，轉(zhuǎn)錄因子MyoD能與TCAP基因啟動子區(qū)的DNA序列結(jié)合，從而激活TCAP基因的表達(dá)，有利于肌原纖維的組裝和成熟肌纖維的形成[29]，這些研究表明轉(zhuǎn)錄因子之間及與其相應(yīng)的上游調(diào)控元件之間的相互作用對基因表達(dá)有著重要的作用。

本試驗(yàn)篩選出的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)MyoD、MEF1、Pax3和MEF2與上述報(bào)道相符，說明本試驗(yàn)的結(jié)果可靠，試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)深入研究這些轉(zhuǎn)錄因子對MyoDI基因啟動子啟動活性的影響研究奠定了理論基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步了解MyoDI基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和表達(dá)機(jī)制提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功克隆了關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)，并構(gòu)建了pUCm-T-MyoDI-pro重組質(zhì)粒，提取出關(guān)嶺牛肌肉組織的細(xì)胞核提取物并測定出其濃度為1.6 mg·mL-1。利用擴(kuò)增出的關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子區(qū)、關(guān)嶺牛肌肉組織的細(xì)胞核提取物和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合試劑盒進(jìn)行篩選試驗(yàn)，再結(jié)合在線軟件的分析，最后篩選出關(guān)嶺牛MyoDI基因啟動子上有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、MEF2、VDR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，為后續(xù)的試驗(yàn)研究提供方向。

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(編輯 郭云雁)

(編輯 郭云雁)

The Screening of Transcription Factor Binding Sites ofMyoDI Promoter in Guanling Cattle

ZHANG Wen1，2，XU Hou-qiang1，2*，CHEN Wei1，2，3，CHEN Xiang1，2，HUAN Cong-cong1，2，3，XIA Dan1，2，ZHOU Di1，2

(1.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReporductioninthePlateauMountainousRegionofMinistryofEducation，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China； 2.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;3.CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China)

This experiment was conducted to screen the transcription factor binding sites ofMyoDI promoter in Guizhou Guanling cattle.According to the sequence of bovineMyoDI gene published in GenBank，the specific primer was designed to amplify the promoter region ofMyoDI gene in Guanling cattle.The PCR products was used to construct the recombinant cloning vector pUCM-T-MyoDI-pro.Positive plasmids were authenticated by sequencing.Then screening experiment and bioinformatics analysis were applied to screen the transcription factor binding sites ofMyoDI promoter in Guanling cattle.The results showed that the transcription factor binding sites ofMyoDI promoter in Guizhou Guanling cattle had SATB1，Xbp，MEF2，Pax-3，Pbx1，PPAR，TFⅡD，COUP-TF，Gfi-1，HNF-1，HOX4C，NRF2(ARE)，MEF1，RXR，SMUC，Snail，MyoD and VDR.Combined with online software analysis and literature，we ultimately screened out the MyoD，TFIID，Pax3，MEF1，VDR and MEF2 inMyoDI promoter.These transcription factors play an important role in regulation of promoter activity.The result indicate that the Guanling cattleMyoDI promoter contain MyoD，TFIID，Pax3，MEF1，VDR and MEF2 transcription factor binding sites.

MyoDI gene；transcription factor binding sites；promoter；nuclear extracts；bioinformatics analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.025

2014-09-03

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2013ZX08009-004)；黔科合重大專項(xiàng)貴州畜禽種質(zhì)資源保存、創(chuàng)新與利用(字[2013]6008號)；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY字[2012]3008號)；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(研農(nóng)2014021)

張 雯(1989-)，女，四川達(dá)州人，研究生，主要從事動物遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新研究，E-mail: aszhangwen@sina.com

*通信作者：許厚強(qiáng)，博士，教授，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究，E-mail：houqiang0524@yahoo.com

S823.2

A

0366-6964(2015)07-1259-09