麥冬多糖脂質(zhì)體增強(qiáng)雛雞免疫功能的分析

范云鵬，馬 琳，張為民，宋曉平，郭 超，侯偉峰，童德文

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

麥冬多糖脂質(zhì)體增強(qiáng)雛雞免疫功能的分析

范云鵬，馬 琳，張為民，宋曉平*，郭 超，侯偉峰，童德文*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

為探討麥冬多糖脂質(zhì)體(OPL)的增強(qiáng)免疫活性，進(jìn)行以下試驗。體外試驗，采用MTT法測定OPL對雛雞脾中T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響，并以麥冬多糖(OP)作為對照；體內(nèi)試驗，400只11日齡雛雞隨機(jī)均分為8組，先用環(huán)磷酰胺進(jìn)行免疫抑制造模，14日齡時用新城疫疫苗進(jìn)行免疫，在免疫的同時注射不同劑量的OPL，然后測定免疫后不同時間點OPL對外周血淋巴細(xì)胞增殖、抗體效價和細(xì)胞因子含量的影響。結(jié)果顯示，在體外，OPL在7.813～125 μg·mL-1時無論是單獨作用還是協(xié)同PHA、LPS作用均能顯著促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞的增殖，且效果顯著優(yōu)于OP(P<0.05)；在體內(nèi)，OPL高、中劑量能夠顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)抗體效價，提高細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的含量，且效果顯著優(yōu)于OP(P<0.05)。結(jié)果表明，OPL能夠顯著提高OP的增強(qiáng)免疫活性，有望開發(fā)成新型的麥冬多糖制劑。

麥冬多糖脂質(zhì)體；免疫功能；淋巴細(xì)胞增殖；免疫抑制

麥冬作為傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘、微苦，性微寒，入心、肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰生津、清心潤肺的功效，主治肺熱燥咳、熱病傷陰、腸燥便秘等病癥。現(xiàn)代藥理研究表明，麥冬中的主要活性成分麥冬多糖具有較強(qiáng)的免疫促進(jìn)作用，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，從而發(fā)揮良好的免疫增強(qiáng)活性[1-2]。但由于其高度親水性和約2 nm的分子尺寸，使得麥冬多糖口服或注射給藥后在體內(nèi)的消除期很短，快速以原型經(jīng)腎排泄，在相應(yīng)的靶組織分布較少，且在體內(nèi)不穩(wěn)定。這些不理想的藥動學(xué)性質(zhì)限制了它的臨床應(yīng)用[3]。因此研究新型的麥冬多糖制劑或是選擇一種高效的載體以改善麥冬多糖的相關(guān)性質(zhì)，使其更好地在體內(nèi)進(jìn)行代謝，發(fā)揮藥效作用就顯得特別重要。

脂質(zhì)體，作為現(xiàn)代藥物載體研究的內(nèi)容之一，是由類脂質(zhì)制備的具有復(fù)層或單層單位膜結(jié)構(gòu)的小囊，其結(jié)構(gòu)類似生物膜，易被攝取，由于具有增強(qiáng)療效、提高穩(wěn)定性、延長藥效、降低毒性和靶向性等優(yōu)點而日益受到重視[4-5]。目前，中藥脂質(zhì)體的研究已經(jīng)成為中藥領(lǐng)域的一大熱點。作者所在課題組前期研究證明，將甘草次酸、蜂膠黃酮等中藥有效成分制成脂質(zhì)體后在體內(nèi)外能夠顯著提高其免疫增強(qiáng)活性，并延長藥效[6-7]。因此，我們推測將麥冬多糖制成脂質(zhì)體后也能夠提高其免疫增強(qiáng)作用，并改善在體內(nèi)代謝過快等缺點。

本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，以麥冬多糖脂質(zhì)體為研究對象，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能為目標(biāo)，體外試驗，測定麥冬多糖脂質(zhì)體對雞脾中T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響；體內(nèi)試驗，測定麥冬多糖脂質(zhì)體對免疫抑制雛雞外周血淋巴細(xì)胞增殖、抗體效價和細(xì)胞因子含量的影響。本研究旨在探討麥冬多糖脂質(zhì)體的增強(qiáng)免疫活性，并為進(jìn)一步研制和應(yīng)用效果明確的新型中藥免疫增強(qiáng)劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物準(zhǔn)備

1.1.1 麥冬多糖(OP)的制備 稱取麥冬1 000 g，加2 000 mL 95%乙醇，80 ℃水浴回流2次，藥渣晾干后加9倍量水煎煮3次，合并濾液至1 000 mL，緩慢加入95%乙醇至含醇量達(dá)80%，攪勻，靜置24 h，取沉淀，用三氯乙酸法去除蛋白質(zhì)，DEAE纖維素柱層析分離純化后，冷凍干燥，得麥冬多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測定，其多糖凈含量為98.8%。

1.1.2 麥冬多糖脂質(zhì)體(OPL)的制備 根據(jù)前期試驗響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果，采用逆向蒸發(fā)法制備[8]。具體操作：稱取大豆磷脂190 mg和膽固醇23.75 mg，加入三氯甲烷15 mL，使其溶解；將含麥冬多糖20 mg的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)5 mL緩慢注入到三氯甲烷中，后置于冰水浴超聲，至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑；然后將乳劑置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，50 ℃減壓蒸發(fā)除去三氯甲烷，使其在瓶壁上形成一層均勻的膠質(zhì)，后加入PBS 20 mL，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗脫至膠質(zhì)完全溶解，經(jīng)水浴超聲20 min，形成均勻的麥冬多糖脂質(zhì)體；最后將其依次通過孔徑為0.45 和0.22 μm的微孔濾膜，重復(fù)操作兩次，最終制得麥冬多糖脂質(zhì)體。

臨用前OPL用生理鹽水稀釋為4.0、2.0、1.0 mg·mL-1三個質(zhì)量濃度，OP稀釋為4.0 mg·mL-1，用于體內(nèi)試驗；用不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將OPL和OP均稀釋成5種質(zhì)量濃度：125、62.5、31.25、15.625和7.813 μg·mL-1，以0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存，用于體外試驗。

1.2 主要試劑

大豆卵磷脂，購于上海太偉藥業(yè)有限公司；膽固醇，購于天津市博迪化學(xué)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，按說明書用三蒸水配制，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌并分裝，于4 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前加入青鏈霉素(終濃度為100 IU·mL-1)，10%的小牛血清，用5.6% NaHCO3調(diào)pH至7.4。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Amresco公司)溶液，用pH 7.4的PBS配制成5 mg·mL-1的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝，4 ℃避光保存；二甲亞砜(DMSO)，天津科密歐化學(xué)試劑公司；植物血凝素(PHA，Sigma公司)，用無小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制成100 μg·mL-1，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存；脂多糖(LPS，Sigma公司)，用無小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制成50 μg·mL-1，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存。淋巴細(xì)胞分離液，購自上海浩洋生物有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-B95A型循環(huán)水真空泵，鄭州科工貿(mào)有限公司；KQ-500DE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；PT-3502G型酶標(biāo)儀，北京普天新橋技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司，ICX-40型倒置顯微鏡，浙江舜宇光學(xué)科技有限公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，德國Nunclon公司生產(chǎn)；ELISA試劑盒，上海繼錦科技有限公司。

1.4 麥冬多糖脂質(zhì)體對體外脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

取40日齡羅曼蛋公雞頸靜脈放血處死，浸入75%的乙醇中消毒5 min。打開腹腔，取出脾，用滅菌PBS沖洗3次，移入200目細(xì)胞篩網(wǎng)，研磨脾，邊研邊加Hank's液，收集細(xì)胞液，緩慢均勻地加在淋巴細(xì)胞分離液上層。以2 000 r·min-1離心20 min，吸取中間云霧狀白細(xì)胞層，用Hank's液洗滌2次。用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2.5×106個·mL-1；將細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞板中，100 μL·孔-1。每孔加入各濃度的OPL、OP和空白脂質(zhì)體(BL)80 μL，每個藥物濃度重復(fù)4孔。另取培養(yǎng)板，在加入藥物的同時，分別加入20 μL PHA或LPS以刺激T、B淋巴細(xì)胞增殖(終濃度分別為20、10 μg·mL-1)，另設(shè)PHA、LPS和細(xì)胞對照組(CC)。然后置于37.5 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)44 h，取出每孔加入MTT 30 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將每孔中的上清棄去，加入100 μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩5 min左右使沉淀完全溶解。用酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm波長處的吸光值(A570 nm)，作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)[9]。

1.5 麥冬多糖脂質(zhì)體對免疫抑制雞免疫功能的影響

11日齡健康雛雞400只，隨機(jī)均分為8組，每組50只。分別為OPL的高(4.0 mg·mL-1)、中(2.0 mg·mL-1)、低劑量組(1.0 mg·mL-1)、OP組(4.0 mg·mL-1)、空白脂質(zhì)體組(BL)、環(huán)磷酰胺模型對照組(MC)、疫苗對照組(VC)和空白對照組(BC)。除VC和BC組外，其余各組雛雞均每羽肌肉注射8 mg·mL-1的環(huán)磷酰胺溶液0.5 mL，每天1次，連續(xù)3 d；14日齡時，除空白對照組外均用新城疫Ⅳ系疫苗免疫，28日齡二免。在首次免疫的同時，1～5組分別肌肉注射相應(yīng)藥物，1.0 mL·只-1，MC、VC和BC組注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。分別于首免后第7(D7)、14(D14)、21(D21)和28(D28)天，每組隨機(jī)抽取6羽心臟采血，用MTT法測定外周血T淋巴細(xì)胞增殖；每組再隨機(jī)抽取6只，翅靜脈采血，分離血清，用β-微量法檢測抗體效價，ELISA法測定細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的含量變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 體外試驗結(jié)果2.1.1 OPL及OP單獨作用時對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果見圖1。在 7.813～125 μg·mL-1，OPL和OP組的A570 nm值顯著高于BL和CC組(P<0.05)，且在5個質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OPL組的A570 nm值均為最高，并顯著高于OP組(P<0.05)。結(jié)果表明，在單獨作用時，OPL和OP均能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，且OPL的效果顯著優(yōu)于OP。

柱形圖中標(biāo)注不同字母者差異顯著(P<0.05)。以下圖同Bars in the figure with different superscripts differ significantly (P<0.05).The followings are the same圖1 藥物單獨刺激時對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(A570 nm值)Fig.1 Effects of splenic lymphocyte proliferation in single stimulation of drugs (A570 nm values)

2.1.2 OPL及OP協(xié)同PHA刺激時對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 在 125～7.813 μg·mL-1，PHA組的A570 nm值顯著高于CC組(P<0.05)，表明PHA能夠顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。在5個質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OPL組的A570 nm值均為最高，并顯著高于其它4個組(P<0.05)。在125、62.5、31.25和7.813 μg·mL-1時，OP組的A570 nm值顯著高于PHA和CC組(P<0.05)。結(jié)果表明，在協(xié)同PHA作用時，OPL和OP均能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，且OPL的效果顯著優(yōu)于OP(圖2)。

2.1.3 OPL及OP協(xié)同LPS刺激時對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 在7.813～125 μg·mL-1，LPS組的A570 nm值顯著高于CC組(P<0.05)，表明LPS能夠顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。在5個質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OPL組的A570 nm值均為最高，并顯著高于OP、BL、LPS和CC組(P<0.05)。在125、62.5、31.25和15.625 μg·mL-1時，OP組的A570 nm值顯著高于LPS和CC組(P<0.05)。結(jié)果表明，在協(xié)同LPS作用時，OPL和OP均能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，且OPL的效果顯著優(yōu)于OP(圖3)。

圖2 藥物協(xié)同PHA刺激時對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(A570 nm值)Fig.2 Effects of splenic lymphocyte proliferation in synergistical stimulation of drugs with PHA (A570 nm values)

圖3 藥物協(xié)同LPS刺激時對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(A570 nm值)Fig.3 Effects of splenic lymphocyte proliferation in synergistical stimulation of drugs with LPS (A570 nm values)

2.2 體內(nèi)試驗結(jié)果

2.2.1 麥冬多糖脂質(zhì)體對外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響 在首次免疫后的所有時間點，MC組的A570 nm值均顯著低于VC組(P<0.05)，表明造模成功。首免后第7—28天，OPLH、OPLM和OP組的A570 nm值顯著高于MC組，且OPLL組的A570 nm值在首免后第14—28天也高于MC組(P<0.05)。首免后第14—28天，OPLH組的A570 nm值均顯著高于OP組(P<0.05)。首免后第21和28天，OPLM組的A570 nm值也顯著高于OP組(P<0.05)(圖4)。結(jié)果表明，OPL的高、中劑量能夠促進(jìn)機(jī)體的淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)機(jī)體的免疫功能恢復(fù)，且效果顯著優(yōu)于OP。

H.高劑量組；M.中劑量組；L.低劑量組。下同H.High dose group；M.Medium dose group；L.Low dose group.The followings are the same圖4 各組淋巴細(xì)胞增殖的動態(tài)變化(A570 nm值)Fig.4 The changes of lymphocyte proliferation in every group (A570 nm values)

2.2.2 麥冬多糖脂質(zhì)體對抗體效價的影響 在首次免疫后的所有時間點，MC組的抗體效價均顯著低于VC組(P<0.05)，表明造模成功。首免后第7—28天，OPLH、OPLM、OPLL和OP組的抗體效價顯著高于MC組(P<0.05)。首免后第14—28天，OPLH和OPLM組的抗體效價均高于OP組，且在第21和28天時，OPLH與OP差異顯著，在第28天時，OPLM與OP差異顯著(P<0.05)(圖5)。結(jié)果表明，OPL的高、中劑量能夠提高機(jī)體的抗體效價，促進(jìn)機(jī)體的免疫功能恢復(fù)，且效果顯著優(yōu)于OP。

圖5 各組抗體效價的動態(tài)變化Fig.5 The changes of antibody titers in every group

2.2.3 麥冬多糖脂質(zhì)體對IL-2含量的影響 首免后第7—28天，OPLH、OPLM、OPLL和OP組的IL-2含量均顯著高于MC組(P<0.05)。首免后第14～28天，OPLH和OPLM組的IL-2含量高于OP組，且在第28天時，OPLH與OP差異顯著，在第21和28天時，OPLM與OP差異顯著(P<0.05)(圖6)。結(jié)果表明，OPL的高、中劑量能夠促進(jìn)機(jī)體IL-2的生成，且效果顯著優(yōu)于OP。

圖6 各組IL-2含量的動態(tài)變化Fig.6 The changes of IL-2 in every group

圖7 各組IFN-γ含量的動態(tài)變化Fig.7 The changes of IFN-γ in every group

2.2.4 麥冬多糖脂質(zhì)體對IFN-γ含量的影響 首免后第7—28天，OPLH、OPLM和OP組的IFN-γ含量均顯著高于MC組(P<0.05)。首免后第14—28天，OPLM組的IFN-γ含量顯著高于OP組(P<0.05)，OPLH組的IFN-γ含量也高于OP組，且在第14和21天時，差異顯著(P<0.05)(圖7)。結(jié)果表明，OPL的高、中劑量能夠促進(jìn)機(jī)體IFN-γ的生成，且效果顯著優(yōu)于OP。

3 討 論

環(huán)磷酰胺屬于烷化劑類藥物，是醫(yī)學(xué)上常用的抗癌藥，也是一種免疫抑制劑，具有細(xì)胞毒性，它的作用機(jī)制與病毒的免疫抑制相似。主要表現(xiàn)為對活化增殖細(xì)胞的毒性，通過肝酶P450水解成醛磷酰胺，與DNA雙鏈交叉連接破壞DNA，殺死有絲分裂期和進(jìn)入循環(huán)周期的細(xì)胞，破壞和干擾母細(xì)胞的增殖和分化，非特異性地殺傷抗原敏感性小淋巴細(xì)胞，限制其轉(zhuǎn)化為免疫母細(xì)胞，還能夠抑制體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答作用[10-12]。因此，在試驗中，經(jīng)常使用環(huán)磷酰胺對動物進(jìn)行免疫抑制或免疫缺陷造模。在當(dāng)前的研究中，試驗結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺能夠顯著降低模型組雛雞的淋巴細(xì)胞增殖、抗體效價、IFN-γ和 IL-2的含量，表明造模成功，可以用來評價OPL的免疫增強(qiáng)活性。

T、B淋巴細(xì)胞是機(jī)體中參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞類群，T細(xì)胞具有介導(dǎo)細(xì)胞免疫及調(diào)節(jié)免疫的雙重功能，B細(xì)胞主要參與體液免疫。淋巴細(xì)胞增殖是反映機(jī)體細(xì)胞免疫最直接的指標(biāo)[13]。淋巴細(xì)胞在受到抗原刺激后能分裂增殖，發(fā)生特異性免疫應(yīng)答、產(chǎn)生抗體或分泌細(xì)胞因子。A570 nm值與淋巴細(xì)胞增殖狀態(tài)呈正相關(guān)，A570 nm越大，細(xì)胞增殖越強(qiáng)[14]。本試驗中使用的PHA、LPS在體外可以分別刺激T、B淋巴細(xì)胞的增殖。本研究體外試驗結(jié)果顯示，OPL無論是單獨作用，還是協(xié)同PHA或LPS刺激時，均能夠顯著促進(jìn)脾中T、B淋巴細(xì)胞的增殖，且效果優(yōu)于OP。但是中藥對機(jī)體免疫功能的作用，有的可能是直接作用于免疫系統(tǒng)，有的卻可能是通過作用其他系統(tǒng)間接影響免疫功能。因此，為了進(jìn)一步驗證體外作用與體內(nèi)作用是否一致，而進(jìn)行了體內(nèi)試驗。體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，在首免后第7—28天，OPL的高、中劑量能夠顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，加快雛雞免疫功能的恢復(fù)，且在大多數(shù)時間點，OPL的高、中劑量的效果顯著優(yōu)于OP。體內(nèi)外試驗結(jié)果表明，OP被脂質(zhì)體包封后，其促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的能力得到了顯著地增強(qiáng)。黃葉娥等研究也已證明中藥成分被制成脂質(zhì)體后，在體內(nèi)外同樣能夠顯著提高T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力[15-16]。

機(jī)體免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫是機(jī)體防御傳染病的主要因素之一，體液免疫是B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體一種重要的特異性免疫反應(yīng)，是抗御傳染病的主要因素之一。而抗體是介導(dǎo)體液免疫的重要分子[17-18]。抗體效價的高低直接反映機(jī)體的體液免疫狀態(tài)，在疾病中起著關(guān)鍵的作用[19]。因此，本試驗通過對各組雛雞血清中抗體效價的測定，來反映不同劑量的OPL對免疫抑制雛雞體液免疫功能的影響。結(jié)果顯示，在首免后第7—28天，OPL三個劑量組的抗體效價均顯著高于模型對照組，且在大多數(shù)時間點，OPL高、中劑量的抗體效價顯著高于OP。表明，OPL制成脂質(zhì)體后，能夠產(chǎn)生緩釋效果，且能夠使OP保持較高的血藥濃度，能夠?qū)C(jī)體的體液免疫系統(tǒng)進(jìn)行持續(xù)的刺激，從而使機(jī)體的抗體效價維持在較高的水平。我們前期研究也已證明將黃芪多糖被制成脂質(zhì)體后，在體內(nèi)同樣能夠顯著提高小鼠和雛雞的特異性抗體水平[20-21]。

IL-2是機(jī)體內(nèi)重要的淋巴因子，主要由T淋巴細(xì)胞分泌，它與靶細(xì)胞膜的IL-2受體結(jié)合是其增殖條件。IL-2能激活多種免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等的增殖、分化和抗體分泌，同時可誘生分泌多種細(xì)胞因子等免疫活性物質(zhì)，尤其可促進(jìn)IFN-γ的生成[22]。IFN-γ是一種同源二聚體糖蛋白，具有重要的免疫調(diào)節(jié)活性，在一定條件下可促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的功能，同時又可作為效應(yīng)因子激活細(xì)胞表面的IL-2受體，使IL-2發(fā)揮活性[23]?；贗L-2和IFN-γ具有如此廣泛而重要的免疫調(diào)節(jié)作用，所以本試驗選擇其作為探究OPL增強(qiáng)機(jī)體免疫功能機(jī)制的一個指標(biāo)。試驗結(jié)果顯示，在首免后的大多數(shù)時間點，OPL組的IL-2和IFN-γ含量均顯著高于OP組，由此可見，OPL可以促進(jìn)機(jī)體的IL-2和IFN-γ的分泌，且效果顯著高于PF。

4 結(jié) 論

麥冬多糖脂質(zhì)體能夠顯著提高麥冬多糖的免疫增強(qiáng)活性，主要包括：在體外能夠單獨或協(xié)同PHA和LPS，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖；在體內(nèi)，能夠促進(jìn)免疫抑制雛雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖、提高抗體效價、促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌。因此，將麥冬多糖制成脂質(zhì)體后，能夠增強(qiáng)其免疫活性和藥效，麥冬多糖脂質(zhì)體可以作為一種新型的麥冬多糖制劑。

[1] XIONG S L，LI A L，HUANG N，et al.Antioxidant and immunoregulatory activity of different polysaccharide fractions from tuber of Ophiopogon japonicus[J].CarbohydPolym，2011，86(3)：1273-1280.

[2] WANG X M，SUN R G，ZHANG J，et al.Structure and antioxidant activity of polysaccharide POJ-U1a extracted by ultrasound from Ophiopogon japonicus[J].Fitoterapia，2012，83(8)：1576-1584.

[3] LIN X，WANG S，JIANG Y，et al.Poly (ethylene glycol)-radix Ophiopogonis polysaccharide conjugates：preparation，characterization，pharmacokinetics andinvitrobioactivity[J].EurJPharmBiopharm，2010，76(2)：230-237.

[4] PATIL Y P，JADHAV S.Novel methods for liposome preparation[J].ChemPhysLipids，2014，177：8-18.

[5] YU Y，LU Y，BO R N，et al.The preparation of gypenosides liposomes and its effects on the peritoneal macrophages functioninvitro[J].IntJPharm，2014，460(1-2)：248-254.

[6] ZHAO X J，F(xiàn)AN Y P，WANG D Y，et al.Immunological adjuvant efficacy of glycyrrhetinic acid liposome against Newcastle disease vaccine[J].Vaccine，2011，29(52)：9611-9617.

[7] YUAN J，LIU J G，HU Y L，et al.The immunological activity of propolis flavonoids liposome on the immune response against ND vaccine[J].IntJBiolMacromol，2012，51(4)：400-405.

[8] FAN Y，SONG X，GAO Y，et al.Preparation and optimization of ophiopogon polysaccharide liposome and its activity on Kupffer cells[J].IntJPharm，2014，477(1-2)：421-430.

[9] THEKISOE M M，MBATI P A，BISSCHOP S P.Different approaches to the vaccination of free ranging village chickens against Newcastle disease in Qwa-Qwa，South Africa[J].VetMicrobiol，2004，101(1)：23-30.

[10] EL-ABASY M，MOTOBU M，NAKAMURA K，et al.Preventive and therapeutic effects of sugar cane extract on cyclophosphamide-induced immunosuppression in chickens[J].IntImmunopharmacol，2004，4(8)：983-990.

[11] CRUZ-CHAMORRO L，PUERTOLLANO M A，PUERTOLLANO E，et al.Examination of host immune resistance againstListeriamonocytogenesinfection in cyclophosphamide-treated mice after dietary lipid administration[J].ClinNutr，2007，26(5)：631-639.

[12] ATSAMO A D，NGUELEFACK T B，DATTé J Y，et al.Acute and subchronic oral toxicity assessment of the aqueous extract from the stem bark of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) in rodents[J].JEthnopharmacol，2011，134(3)：697-702.

[13] MINATO K，KAWAKAMI S，NOMURA K，et al.An exo β-1，3-glucanase synthesized de novo degrades lentinan during storage of Lentinule edodes and diminishes immunomodulating activity of the mushroom[J].CarbohydPolym，2004，56(3)：279-286.

[14] HUANG X Y，HU Y L，ZHAO X N，et al.Sulfated modification can enhance the adjuvant activity of astragalus polysaccharide for ND vaccine[J].Carbohydpolym，2008，73(2)：303-308.

[15] HUANG Y，WU C，LIU Z，et al.Optimization on preparation conditions of Rehmannia glutinosa polysaccharide liposome and its immunological activity[J].CarbohydrPolym，2014，104：118-126.

[16] YU Y，WANG D Q，ABULA S，et al.The immunological adjuvant activity of gypenosides liposome against Newcastle disease vaccine[J].IntJBiolMacromol，2013，60：116-121.

[17] PARRA F，PRIETO M.Purification and characterization of a calicivirus as the causative agent of a lethal hemorrhagic disease in rabbits[J].JVirol，1990，64(8)：4013-4015.

[18] 邱 妍，胡元亮，崔保安，等.懷牛膝多糖對雛雞疫苗免疫效果的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007，38(7)：723-727. QIU Y，HU Y L，CUI B A，et al.Effects of achyranthes bidentata polysaccharide on immune efficacy of vaccine in chickens[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2007，38(7)：723-727.(in Chinese)

[19] UNG C Y，LI H，KONG C Y，et al.Usefulness of traditionally defined herbal properties for distinguishing prescriptions of traditional Chinese medicine from non-prescription recipes[J].JEthnopharmacol，2007，109(1)：21-28.

[20] FAN Y P，HU Y L，WANG D Y，et al.Effects of astragalus polysaccharide liposome on lymphocyte proliferationinvitroand adjuvanticityinvivo[J].CarbohydPolym，2012，88(1)：68-74.

[21] FAN Y P，MA L，ZHANG W M，et al.Liposome can improve the adjuvanticity of astragalus polysaccharide on the immune response against ovalbumin[J].IntJBiolMacromol，2013，60：206-212.

[22] NHIEM N X，KIEM P V，MINH C V，et al.Structure-activity relationship of lupane-triterpene glycosides fromAcanthopanaxkoreanumon spleen lymphocyte IL-2 and IFN-γ[J].BioorgMedChemLett，2010，20 (16)：4927-4931.

[23] LETSCH A，SCHEIBENBOGEN C.Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining[J].Methods，2003，31(2)：143-149.

(編輯 白永平)

Analysis of Ophiopogon Polysaccharide Liposome on Enhancing the Immune Function in Chickens

FAN Yun-peng，MA Lin，ZHANG Wei-min，SONG Xiao-ping*，GUO Chao，HOU Wei-feng，TONG De-wen*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

In order to investigate the immune-enhancing activity of ophiopogon polysaccharide liposome (OPL)，two experiments were carried out.Invitro，the effects of OPL on splenocyte proliferation of chicken were determined by MTT method，and ophiopogon polysaccharide (OP) was used as control.Invivo，four hundred 11-day-old chickens were randomly assigned into 8 groups，and the chickens were injected with cyclophosphamide to build the immunosuppression model.At 14-day-old，the chickens were vaccinated with Newcastle disease vaccine.At the same time of the first vaccination，the chickens were injected respectively with OPL at different dosages.At various time points after the first vaccination，the peripheral lymphocyte proliferation，serum antibody titer and the contents of cytokines were measured.The results showed that OPL could significantly promote splenocyte proliferation singly or synergistically with PHA and LPS at 7.813-125 μg·mL-1invitro，and the efficacy was superior to OP (P<0.05)；Invivo，OPL at high and medium doses could significantly promote lymphocyte proliferation，enhance antibody titer and improve the contents of IL-2 and IFN-γ compared with OP at most time points (P<0.05).These results indicated that OPL could significantly improve the immune-enhancing activity of OP，OPL would be expected to exploit into a new-type preparation of OP.

ophiopogon polysaccharide liposome；immune function；lymphocyte proliferation；immunosuppression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.023

2014-11-07

國家自然科學(xué)基金項目(31402240)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(2452015037)；中國博士后科學(xué)基金項目(2014M550516)

范云鵬(1983-)，男，山東煙臺人，講師，博士，主要從事獸醫(yī)中藥學(xué)與中藥藥理學(xué)研究，E-mail：ypfan@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：童德文，教授，E-mail：dwtong@nwsuaf.edu.cn；宋曉平，教授，E-mail：sxpxbnl@163.com

S853.74

A

0366-6964(2015)07-1246-07