SLA-Iα鏈和β鏈的原核表達(dá)與抗血清制備

劉 瑩，杜吉革，蓋新娜，周 磊，郭 鑫，楊漢春

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)與人獸共患病重點實驗室，北京 100193)

SLA-Iα鏈和β鏈的原核表達(dá)與抗血清制備

劉 瑩，杜吉革，蓋新娜，周 磊，郭 鑫*，楊漢春*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)與人獸共患病重點實驗室，北京 100193)

豬主要組織相容性復(fù)合體I類分子又稱豬白細(xì)胞抗原I類分子(SLA-I)，參與內(nèi)源性抗原在體內(nèi)的遞呈過程，其結(jié)構(gòu)包括重鏈(α鏈)和輕鏈(β鏈)兩部分。本研究首先采用RT-PCR從原代豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中擴(kuò)增出SLA-I α鏈胞外區(qū)基因和β鏈基因；繼而利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得包涵體形式表達(dá)的SLA-I α鏈胞外區(qū)和β鏈重組蛋白質(zhì)；將目的重組蛋白質(zhì)洗滌、復(fù)性、純化后，經(jīng)Western blot及質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行驗證。以純化的重組蛋白質(zhì)免疫兔制備抗血清，經(jīng)間接ELISA檢測其效價達(dá)1∶256 000。以制備的抗血清進(jìn)行Western blot和間接免疫熒光試驗，結(jié)果顯示，所制備的抗血清能夠特異性地識別原代及傳代PAM表達(dá)的SLA-I α鏈及β鏈蛋白。研究結(jié)果不僅為SLA-I類分子的功能研究提供了有用的分析試劑，也為病毒感染的免疫機(jī)制研究奠定了必要的基礎(chǔ)。

SLA-I α鏈；SLA-I β鏈；原核表達(dá)；抗血清

主要組織相容性復(fù)合物I類分子(the major histocompatibility complex class I，MHCI)在所有有核細(xì)胞及血小板的表面均有表達(dá)。MHCI分子由α鏈和β鏈(β2微球蛋白)構(gòu)成。α鏈分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)三個部分，胞外區(qū)的功能區(qū)包括α1、α2、α3 三個結(jié)構(gòu)域，其中α1和α2共同形成多肽結(jié)合槽；β鏈只有胞外區(qū)，通過非共價鍵與α3結(jié)合，以維持 MHCI分子天然構(gòu)型的穩(wěn)定性及其表達(dá)。MHCI分子參與內(nèi)源性抗原的遞呈過程，是機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中最重要的“橋梁”分子。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，α鏈在伴侶分子的作用下成熟，與β鏈組裝成完整的MHCI分子[1]。MHCI分子結(jié)合適宜長度的內(nèi)源性短肽，形成α鏈-β鏈-短肽復(fù)合物，經(jīng)高爾基體分泌到細(xì)胞表面，發(fā)揮遞呈抗原的功能，最終激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，清除感染病毒[2]。

病毒在與宿主相互作用的過程中能夠抑制感染細(xì)胞表面MHCI分子的表達(dá)，從而破壞宿主細(xì)胞的抗原遞呈能力，抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。病毒利用其蛋白質(zhì)抑制MHCI分子表達(dá)的途徑各有不同，如腺病毒的E3蛋白、牛痘病毒的203蛋白通過結(jié)合MHCI分子造成其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的滯留[3-4]；而人巨細(xì)胞病毒的US2、US11蛋白及鼠巨細(xì)胞病毒gp48蛋白則通過使MHCI分子的α鏈降解來抑制MHCI分子表達(dá)[5-6]。

豬的MHC分子又稱豬白細(xì)胞抗原(SLA)。SLA-I被認(rèn)為是與豬免疫應(yīng)答相關(guān)的最重要的基因之一[7]。已有研究報道，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)能夠下調(diào)感染細(xì)胞表面SLA-I的表達(dá)[8-9]，但引起下調(diào)的具體機(jī)制尚不完全清楚。本研究制備的SLA-I α鏈和β鏈的抗體將為深入研究PRRSV等病原感染對以PAM為靶細(xì)胞的SLA-I表達(dá)調(diào)控以及免疫抑制的分子機(jī)制奠定必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株、實驗動物與主要試劑

原代和傳代PAM細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET-21a(+)、pGEXT-6p-1由本實驗室保存；新西蘭兔購自北京芳元緣養(yǎng)殖場；TRIzol、SuperMixTaqDNA聚合酶、DNA瓊脂糖膠回收試劑盒、pEASY-Blunt Cloning Vector、感受態(tài)細(xì)胞Top10、BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶購自Promega公司；ECL顯色液購自Vigorous生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；包涵體復(fù)性試劑盒(Protein Refolding Kit)購自默克Novagen公司；可溶性TMB底物顯色液購自Macgene公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；His標(biāo)簽抗體、GST標(biāo)簽抗體購自Abmart公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。

1.2 主要設(shè)備

TS-1型搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；ABI 7200型PCR儀(美國ABI公司)；PowerPac200型核酸水平電泳儀、PowerPac1000型蛋白質(zhì)電泳儀、Gel DocTMXR+型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Centrifuge 5810R低溫冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.3 引物設(shè)計

參照GenBank中SLA-1*0401(EU170457.1)基因序列設(shè)計SLA-Iα鏈胞外區(qū)引物[10]，參照L13854基因序列設(shè)計β鏈的擴(kuò)增引物[11]，用于擴(kuò)增原代PAM中SLA-I的α鏈胞外區(qū)基因、β鏈基因。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計α鏈胞外區(qū)和β鏈的原核表達(dá)引物，如表1所示。

1.4 SLA-I α鏈胞外區(qū)基因和β鏈基因的克隆與鑒定

用 TRIzol提取原代PAM細(xì)胞總RNA，參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板分別用表1中的引物和Prime STAR?HS DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將回收的PCR產(chǎn)物與pEASY-Blunt載體連接后，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落進(jìn)行PCR鑒定，提取陽性菌落質(zhì)粒送測序。兩種陽性質(zhì)粒分別命名為pEASY-Blunt-α和pEASY-Blunt-β，測得的序列用DNAMAN生物軟件及在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對。

1.5 SLA-Iα鏈胞外區(qū)基因和β鏈基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分別以質(zhì)粒pEASY-Blunt-α和pEASY-Blunt-β為模板，用表1中的原核表達(dá)引物分別擴(kuò)增SLA-I的α鏈胞外區(qū)基因和β鏈基因，α鏈胞外區(qū)PCR產(chǎn)物和pET-21a(+)載體經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后連接，β鏈PCR產(chǎn)物和pGEXT-6p-1載體經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后連接，均轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞。挑選單菌落進(jìn)行PCR鑒定，提取陽性菌落質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送測序，命名為pET-21a-α、pGEXT-6p-1-β。

表1 SLA-I α鏈胞外區(qū)基因、β鏈基因的克隆引物及原核表達(dá)引物信息表

1.6 SLA-Iα鏈胞外區(qū)和β鏈的原核表達(dá)與純化

將pET-21a-α、pGEXT-6p-1-β質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體，超聲破碎后收集上清和沉淀，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及其可溶性。隨后，對獲得的兩種重組蛋白質(zhì)分別進(jìn)行純化與復(fù)性，SDS-PAGE檢測純化效果。BCA蛋白測定試劑盒測定純化蛋白質(zhì)的濃度。

1.7 SLA-Iα鏈胞外區(qū)和β鏈重組蛋白的鑒定

1.7.1 Western blot 純化復(fù)性后的兩種重組蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)上，分別以His標(biāo)簽抗體、GST標(biāo)簽抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行孵育，用ECL顯色液進(jìn)行顯色，最后在化學(xué)發(fā)光儀中曝光。同時以誘導(dǎo)表達(dá)的pET-21a(+)、pGEXT-6p-1空載體作陰性對照。

1.7.2 質(zhì)譜鑒定 將純化后的pET-21a-α、pGEXT-6p-1-β蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色，切取對應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶，送上海啟研生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.8 SLA-Iα鏈胞外區(qū)和β鏈抗血清的制備

1.8.1 抗血清的制備 將0.6 mg純化的SLA-Iα鏈胞外區(qū)和β鏈重組蛋白分別免疫新西蘭兔。首免時將蛋白溶液與弗氏完全佐劑等體積混勻，背部皮下多點注射。此后與等量的弗氏不完全佐劑混勻，免疫方法同前，每次免疫間隔兩周。第三次免疫7～10 d后耳緣靜脈采血，檢測抗體效價，達(dá)標(biāo)后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，一周后心臟采血，收集血清。

1.8.2 抗血清效價的測定 采用方陣法確定抗原的最佳包被濃度、陰陽血清的最佳稀釋度，用最佳包被濃度的重組蛋白質(zhì)包被ELISA反應(yīng)板，4 ℃過夜；0.5% Tween-PBS洗滌3次后用5%脫脂乳37 ℃封閉2 h；充分洗滌后，加入倍比稀釋的抗血清，同時以正常兔血清作為陰性對照(NC)。二抗為1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG。TMB顯色后用2 mol· L-1H2SO4終止反應(yīng)，測定OD450 nm值，以抗血清的OD450 nm與陰性對照OD450 nm值之比(P/N值)高于2時抗血清的最高稀釋度判定為抗血清的效價。

1.9 抗血清在Western blot及間接免疫熒光試驗(IFA)中的應(yīng)用

1.9.1 Western blot分析SLA-Iα鏈及β鏈在PAM中的表達(dá) 收集原代PAM和傳代PAM細(xì)胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至NC膜上。依次用制備的抗血清(1∶500稀釋)和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶10 000稀釋)孵育NC膜。分析SLA-Iα鏈、β鏈在PAM中的表達(dá)，鑒定抗血清的反應(yīng)性。

1.9.2 IFA分析SLA-Iα鏈及β鏈在PAM中的表達(dá) 將原代PAM和傳代PAM細(xì)胞接種至鋪有無菌玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)過夜。吸棄上清，用預(yù)冷的乙醇固定30 min；棄乙醇后，PBS洗滌。加入5% BSA或脫脂乳，37 ℃濕盒封閉1 h；PBS洗滌3次。加入1∶200陰性血清及制備的抗血清，37 ℃濕盒孵育2 h，PBS洗滌3次，每孔加入1∶200稀釋的 TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，37 ℃濕盒避光孵育45～60 min，PBS洗滌3次。加入1∶1 000稀釋的DAPI，室溫5 min；PBS洗滌3次。最后將玻片取出，固定到滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 SLA-Iα鏈胞外區(qū)基因及β鏈基因的克隆與鑒定

瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小分別為825、357 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，如圖1所示。將測序結(jié)果Blast顯示，擴(kuò)增得到的SLA-Iα鏈胞外區(qū)核苷酸序列與SLA-1*0401胞外區(qū)相似性為96.2%，得到的β鏈核苷酸序列與L13854的相似性為99%。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.α鏈胞外區(qū)RT-PCR產(chǎn)物；2.β鏈RT-PCR產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker；1.RT-PCR product of α chain extracellular region；2.RT-PCR product of β chain圖1 SLA-I α鏈胞外區(qū)基因及β鏈基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR products of α chain extracellular region and β chain of SLA-I

2.2 SLA-Iα鏈胞外區(qū)、β鏈基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用表1中所列的原核表達(dá)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段酶切后分別克隆到pET-21a(+)、pGEXT-6p-1載體上。獲得的重組質(zhì)粒pET-21a-α、pGEXT-6p-1-β經(jīng)雙酶切后電泳觀察得到片段的大小，如圖2所示，酶切片段的大小與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 SLA-I α鏈胞外區(qū)和β鏈的原核表達(dá)與純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21a-α 、pGEXT-6p-1-β以及空載體pET-21a、pGEXT-6p-1轉(zhuǎn)化BL21并誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，表達(dá)的目的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分別為36和38 ku，大小與預(yù)計的重組蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量相符，兩種重組蛋白質(zhì)均以包涵體形式表達(dá)；按照Novagen?Protein Refolding Kit說明書對兩種重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化復(fù)性，結(jié)果見圖3。

M.DL2000 plus DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-21a-α BamHI和XhoI雙酶切鑒定；2.pGEXT-6p-1-β BamHI和XhoI雙酶切鑒定M.DL2000 plus DNA marker；1.pET-21a-α digested with BamHIand XhoI；2.pGEXT-6p-1-β digested with BamHIand XhoI圖2 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids

A.α鏈胞外區(qū)的原核表達(dá)與純化：M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-21a(+)誘導(dǎo)后；2.pET-21a-α誘導(dǎo)后上清；3.pET-21a-α誘導(dǎo)后沉淀；4.包涵體洗滌復(fù)性后。B.β鏈的原核表達(dá)與純化：M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pGEXT-6p-1誘導(dǎo)后；2.pGEXT-6p-1-β誘導(dǎo)后上清；3.pGEXT-6p-1-β誘導(dǎo)后沉淀；4.包涵體洗滌復(fù)性后A.Recombinant expression of α chain extracellular region and purification：M.Protein molecular weight marker；1.pET-21a(+)induced with IPTG；2.The supernatant of pET-21a-α induced with IPTG；3.The inclusion bodies of pET-21a-α induced with IPTG；4.Protein of inclusion bodies after wash and refolding.B.Recombinant expression of β chain and purification：M.Protein molecular weight marker；1.pGEXT-6p-1 induced with IPTG；2.The supernatant of pGEXT-6p-1-β induced with IPTG；3.The inclusion bodies of pGEXT-6p-1-β induced with IPTG；4.Protein of inclusion bodies after wash and refolding圖3 SLA-Iα鏈胞外區(qū)和β鏈的原核表達(dá)及其純化Fig.3 Prokaryotic expression and purification of α chain extracellular region and β chain of SLA-I

2.4 SLA-Iα鏈胞外區(qū)和β鏈重組蛋白質(zhì)的鑒定

2.4.1 重組蛋白質(zhì)的Western blot鑒定 純化的兩種重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到NC膜上進(jìn)行Western blot，結(jié)果見圖4。帶有His標(biāo)簽的α鏈胞外區(qū)重組蛋白及帶有GST標(biāo)簽的β鏈重組蛋白和表達(dá)GST的pGEXT-6p-1空載體均出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，大小與預(yù)期相符。

2.4.2 質(zhì)譜鑒定 將純化的 α鏈胞外區(qū)重組蛋白質(zhì)與 β鏈重組蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)確是所要的目的蛋白質(zhì)(圖5)。

2.5 重組蛋白質(zhì)抗血清效價的測定

經(jīng)間接ELISA測定，以抗血清OD450 nm與陰性對照(NC)OD450 nm值之比高于2時抗血清的最高稀釋度判定為抗血清的效價，結(jié)果如表2所示，制備的兩種抗血清的效價均可達(dá)到1∶256 000。

2.6 抗血清在Western blot及IFA中的應(yīng)用

2.6.1 Western blot鑒定PAM中表達(dá)的SLA-Iα鏈及β鏈 將原代PAM及傳代PAM裂解后進(jìn)行Western blot，結(jié)果如圖6所示。已知SLA-I的α鏈相對分子質(zhì)量約為45 ku，β鏈相對分子質(zhì)量約為12 ku。從圖中可以看出，兩種細(xì)胞的裂解蛋白質(zhì)在相應(yīng)的位置均出現(xiàn)了特異性反應(yīng)條帶。表明所制備的抗血清能夠特異性識別原代及傳代PAM細(xì)胞表達(dá)的 SLA-Iα鏈和β鏈蛋白。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-21a(+)空載體誘導(dǎo)后；2.純化后的α鏈胞外區(qū)重組蛋白；3.pGEXT-6p-1空載體誘導(dǎo)后；4.純化后的β鏈重組蛋白M.Protein molecular weight marker；1.pET-21a(+)induced with IPTG；2.Recombinant α protein after purification；3.pGEXT-6p-1 induced with IPTG；4.Recombinant β protein after purification圖4 SLA-I α鏈胞外區(qū)和β鏈重組蛋白的Western blot鑒定Fig.4 Western blot analysis of recombinant α chain extracellular region and β chain of SLA-I

A.α鏈胞外區(qū)重組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析；B.β鏈重組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析A.Mass spectrum analysis of recombinant α chain；B.Mass spectrum analysis of recombinant β chain圖5 SLA-Iα鏈胞外區(qū)重組蛋白質(zhì)與β鏈重組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定Fig.5 Mass spectrum identification of recombinant α chain extracellular region and β chain of SLA-I

表2 不同稀釋倍數(shù)抗血清測定的OD450 nm值

A.PAM表達(dá)的SLA-Iα鏈的Western blot鑒定；B.PAM表達(dá)的SLA-Iβ鏈的Western blot鑒定。M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3.原代PAM細(xì)胞蛋白；2、4.傳代PAM細(xì)胞蛋白A.Western blot analysis of SLA-Iα chain in PAM；B.Western blot analysis of SLA-Iβ chain in PAM.M.Protein molecular weight marker；1，3.Proteins of PAM；2，4.Proteins of PAM cell line 3D4/21.圖6 Western blot鑒定PAM中表達(dá)的SLA-I分子Fig.6 Western blot analysis of two chains of SLA-I in PAMs

2.6.2 IFA鑒定PAM表達(dá)的SLA-Iα鏈與β鏈 原代PAM及傳代PAM分別加入一抗，再經(jīng)二抗孵育、染核、制片后共聚焦成像，見圖7、8。結(jié)果均顯示陰性兔血清孵育的細(xì)胞無熒光信號，而制備的兔抗SLA-Iα鏈胞外區(qū)抗血清與兔抗SLA-Iβ鏈抗血清均能特異性識別原代PAM和傳代PAM中的相應(yīng)蛋白。

3 討 論

SLA-Iα鏈與β鏈及抗原肽組成復(fù)合體，經(jīng)過高爾基體加工后被遞呈到細(xì)胞表面，在CD8等共受體分子的協(xié)助下，激活CTL免疫應(yīng)答，抵抗病毒的入侵。而病毒在長期進(jìn)化及宿主的免疫壓力下，也獲得了很多對抗宿主免疫的手段和機(jī)制，以確保其能夠持續(xù)存活[12]。SLA-I作為豬抗病毒免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子，病毒對其表達(dá)及其正常功能會進(jìn)行多方面的干擾，以影響SLA-I對抗原分子肽段的有效遞呈。已有研究表明，CSFV和PRRSV等病毒能夠下調(diào)感染細(xì)胞SLA-I的表達(dá)，造成宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答水平的下降，是導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制和病毒持續(xù)性感染的可能原因，但其具體機(jī)制還不清楚。本研究SLA-Iα鏈和β鏈抗體的制備為從分子組裝角度解析病毒感染調(diào)控SLA-I的表達(dá)提供了有效工具。

作者根據(jù)SLA-1*0401、L13854基因序列設(shè)計引物分別從PAM中獲得SLA-Iα鏈胞外區(qū)和β鏈基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得SLA-Iα鏈胞外區(qū)蛋白和β鏈蛋白。并以純化的重組蛋白質(zhì)為免疫原制備抗血清，效價均達(dá)到1∶256 000，表明原核表達(dá)的重組蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性，可在兔體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的抗體。經(jīng)Western blot 和IFA等檢測，證明制備的兔抗血清特異性較好，能識別原代和傳代PAM細(xì)胞表達(dá)的SLA-Iα鏈和β鏈蛋白。

A、A1、A2.DAPI染核；B、B1、B2.TRITC染色；C、C1、C2.疊加A-A2.DAPI；B-B2.TRITC；C-C2.The merging A-B，A1-B1 and A2-B2 respectively圖7 間接免疫熒光鑒定原代PAM中表達(dá)的SLA-I分子Fig.7 Immunofluorescence identification of SLA-I in PAM with two antibodies obtained

D、D1、D2.DAPI染核；E、E1、E2.TRITC染色；F、F1、F2.疊加D-D2.DAPI；E-E2.TRITC；F-F2.The merging D-E，D1-E1 and D2-E2 respectively圖8 間接免疫熒光鑒定傳代PAM中表達(dá)的SLA-I分子Fig.8 Immunofluorescence identification of SLA-I in PAM cell line 3D4/21 with two antibodies obtained

在SLA-Iα鏈胞外區(qū)蛋白的表達(dá)過程中，最初構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)后沒有觀察到目的蛋白的表達(dá)，即使改進(jìn)誘導(dǎo)條件后表達(dá)量也很小。再一次進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，α鏈胞外區(qū)基因的5′端存在一些稀有密碼子，可能不利于基因的表達(dá)。我們重新設(shè)計了表達(dá)引物，優(yōu)化了5′端的其中2個密碼子CCG(C)、CAT(C)。優(yōu)化后構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)后α鏈胞外區(qū)獲得了較高豐度的表達(dá)。由此說明，在SLA-Iα鏈胞外區(qū)的原核表達(dá)過程中，序列5′端稀有密碼子的存在限制了宿主細(xì)胞的識別，并進(jìn)一步影響了目的蛋白的表達(dá)，而優(yōu)化密碼子不失為提高或改變目的基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率的一個有效方法。

SLA-Iα鏈胞外區(qū)和β鏈的原核表達(dá)為后期單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)，而抗血清的獲得則為開展豬細(xì)胞免疫基礎(chǔ)研究以及探究抗原遞呈細(xì)胞表面SLA-I表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了有力工具。

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(編輯 白永平)

Prokaryotic Expression of SLA-I α Chain and β Chain and Antiserum Preparation

LIU Ying，DU Ji-ge，GE Xin-na，ZHOU Lei，GUO Xin*，YANG Han-chun*

(KeyLaboratoryofAnimalEpidemiologyandZoonosisoftheMinistryofAgriculture，CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

The swine major histocompatibility complex class I or swine leukocyte antigen class I (SLA-I)，made of the heavy chain (α chain) and light chain (β chain)，is involved in the process of endogenous antigen presenting.In the present study，we first amplified the genes of the extracellular region in SLA-Iα chain and β chain from porcine alveolar macrophage (PAM) using RT-PCR.The two genes were then cloned into the prokaryotic expression vectors and induced to express in the form of inclusion bodies.After being washed，refolded and purified，the recombinant proteins were confirmed by western blot and mass spectrometer.Then，the rabbit antiserum against the recombinant proteins was prepared with titers of 1：256 000 by an indirect ELISA.Finally，the antiserum was used in Western blot and indirect immunofluorescence assay，showing that the antiserum can specifically react with SLA-I α chain and β chain expressed in both PAM and PAM cell line 3D4/21.This study not only provides useful reagents for analyzing the function of SLA-I，but also develops the basis for further study on the mechanisms associated with immune responses induced by viral infections.

SLA-I α chain；SLA-I β chain；prokaryotic expression；antiserum

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.020

2014-10-13

教育部博導(dǎo)基金(20120008110039)；國家973項目(2014CB542701)

劉 瑩(1989-)，女，江蘇徐州人，碩士，主要從事動物病毒學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：liuying8943@163.com

*通信作者：郭 鑫，教授，Tel：010-62731296，E-mail：guoxin@cau.edu.cn；楊漢春，教授，E-mail：yanghanchun1@cau.edu.cn

S852.4

A

0366-6964(2015)07-1224-08