超強(qiáng)馬立克病病毒株的致病性研究

龔振華，張 康，，王麗萍，郭光禮，李金平，于建敏，李 蕾，侯廣宇，王建琳，單 虎

(1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109；3.青島易邦生物工程有限公司，青島 266032；4.山東臨朐縣畜牧局，臨朐 262600)

超強(qiáng)馬立克病病毒株的致病性研究

龔振華1，張 康1，2，王麗萍3，郭光禮4，李金平1，于建敏1，李 蕾1，侯廣宇1，王建琳2*，單 虎2

(1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109；3.青島易邦生物工程有限公司，青島 266032；4.山東臨朐縣畜牧局，臨朐 262600)

擬對一株超強(qiáng)馬立克病病毒(MDV)SD2012-1株的致病性進(jìn)行研究。將60只SPF雞平均分成未免組、HVT免疫組和CVI988疫苗免疫組3組。于1日齡時(shí)對其進(jìn)行馬立克病(MD)疫苗免疫，于10日齡時(shí)進(jìn)行SD2012-1攻毒；每天觀察攻毒雞臨床癥狀，對病死雞進(jìn)行病理剖檢和組織學(xué)觀察；用PCR反應(yīng)對感染雞進(jìn)行MDV跟蹤監(jiān)測。病理學(xué)研究結(jié)果顯示：攻毒后第2周，試驗(yàn)雞有輕微組織病變；攻毒后第6周，試驗(yàn)雞有眼觀病變，鏡檢有散在的腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊；攻毒后第9周，試驗(yàn)雞有明顯的眼觀腫瘤病變，鏡檢有大量腫瘤細(xì)胞聚集；SD2012-1可以突破CVI988疫苗免疫，引起高達(dá)30%的雞發(fā)病。PCR跟蹤監(jiān)測結(jié)果顯示：攻毒后第5天，未免組和HVT免疫組可檢出MDV；攻毒后第10天，未免組和HVT免疫組陽性檢出率均為100%，CVI988免疫組陽性檢出率為30%；攻毒后第20天，3組試驗(yàn)雞陽性檢出率均為100%；用PCR檢測病死雞的肝、腎、肌胃、腸系膜、十二指腸、心和法氏囊樣品的結(jié)果均為MDV陽性；攻毒300 d后，健康存活雞的羽髓PCR檢測結(jié)果均為MDV陽性。結(jié)果表明，HVT疫苗對于SD2012-1株幾乎無保護(hù)作用，超強(qiáng)馬立克病病毒SD2012-1株能夠長期在免疫雞體內(nèi)存在，突破免疫保護(hù)，引起發(fā)病，這對國內(nèi)防控雞馬立克病提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

超強(qiáng)馬立克病病毒株；免疫；攻毒；腫瘤

馬立克病(Marek’s disease，MD)由皰疹病毒科B亞群的馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起，感染MDV的雞呈現(xiàn)淋巴組織細(xì)胞惡性增生，其內(nèi)臟器官、外周神經(jīng)、肌肉、性腺、虹膜以及皮膚中出現(xiàn)淋巴樣瘤細(xì)胞浸潤，形成眼觀腫瘤病變[1]。從20世紀(jì)70年代起，全球相繼采用Ⅲ型、Ⅱ型和I型單價(jià)或多價(jià)MD疫苗控制這一疾病[2]。近年來，MD疫苗免疫效果明顯降低，在一些已用CVI988 /Rispens株疫苗免疫的雞群，出現(xiàn)免疫失敗，給目前的養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的損失[3-5]。隨著MDV毒株的不斷變異，其毒力在進(jìn)一步增強(qiáng)，超強(qiáng)MDV毒株(vvMDV和vv+MDV)因突破CVI988疫苗免疫，有可能導(dǎo)致該疫苗免疫保護(hù)效果完全喪失，這將嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6-8]。有關(guān)超強(qiáng)MDV毒株突破免疫保護(hù)，導(dǎo)致一些雞場頻發(fā) CVI988 疫苗免疫失敗的原因有待進(jìn)一步研究[9]。作者對所分離保存的一株超強(qiáng)MDV毒株SD2012-1株[10]的致病性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 SPF 雞、MDV 毒株和疫苗

SPF雞：從濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司購買SPF雞胚孵化，置負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。病毒株：MDV 超強(qiáng)病毒SD2012-1株[10]，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。MD疫苗：HVT疫苗，乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠，批號(hào)：獸藥生字(2010)100082001；CVI988疫苗，批號(hào)：JC241。

1.2 主要試劑

DNA小量提取試劑盒、6×Loading Buffer、核酸染料等購自北京夏斯康泰生物技術(shù)有限公司(VWI)；DNA Marker(DL2000)、2×ESTaqMaster Mix購自北京康為生物科技有限公司；病理組織切片HE染色和其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 免疫與攻毒試驗(yàn)

60只SPF雞被隨機(jī)分成3組，分別置于隔離器中飼養(yǎng)，每組各20只雞。3組雞均于1日齡時(shí)進(jìn)行MD疫苗免疫注射，于10日齡時(shí)進(jìn)行MDV超強(qiáng)毒攻毒。第一組未注射疫苗，每只雞皮下注射0.5 mL生理鹽水作為未免疫對照；第二組每只雞以2 000 PFU的劑量頸部皮下免疫 HVT 疫苗；第三組每只雞以3 000 PFU的劑量頸部皮下免疫CVI988疫苗。攻毒所用MDV毒株為SD2012-1，每只雞皮下注射SD2012-1的DEF培養(yǎng)物0.5 mL (稀釋到4 000 PFU·mL-1)。攻毒后每天觀察雞的精神狀態(tài)，記錄發(fā)病和死亡情況。

1.4 剖檢與組織病理學(xué)觀察

剖檢病死雞，觀察心、十二指腸、肝、腎、脾、法氏囊、腺胃、肌胃等組織有無腫瘤病變；采集病變心、肝、脾、腎等組織，用10%福爾馬林(3.7%～4%中性甲醛)溶液固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察各組織器官的病理組織學(xué)變化。

1.5 感染雞的MDV跟蹤監(jiān)測

用PCR試驗(yàn)擴(kuò)增Meq基因以跟蹤監(jiān)測采集樣品中的MDV。PCR引物序列[11]，F(xiàn)：5′-GGCACGGTACAGGTGTAAAGAG-3′，R：5′-GCATAGAC-GATGTGCTGCTGAG-3′。50 μL的PCR反應(yīng)體系：25 μL 2×EsTaqMasterMix，2.0 μL上游引物，2.0 μL下游引物，2.0 μL模板，19 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃保存。本PCR試驗(yàn)設(shè)置CVI988細(xì)胞毒和SD2012-1細(xì)胞毒作為陽性對照，其中CVI988擴(kuò)增大小為1 081 bp，SD2012-1擴(kuò)增大小為1 255 bp[12 ]。

1.5.1 帶毒活雞的MDV檢測 采集攻毒后5、10、20 d以及后期健康存活雞只的羽髓，用基因組 DNA 提取試劑盒提取病料的DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測MDV。

1.5.2 病死雞的MDV檢測 采集病死雞的肝、脾、腎等內(nèi)臟器官樣品，用基因組 DNA 提取試劑盒提取病料的DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測MDV。

2 結(jié) 果

2.1 感染雞的臨床表現(xiàn)

SD2012-1攻毒后第6周，3組試驗(yàn)雞中均有發(fā)病，病雞厭食、消瘦、羽毛蓬亂，未免組和HVT免疫組試驗(yàn)雞見個(gè)別死亡。3組試驗(yàn)雞死亡的高峰期集中出現(xiàn)在攻毒后的第9周。未免疫組發(fā)病率為85%，死亡率為55%；HVT免疫組發(fā)病率為85%，病死率為50%；CVI988組發(fā)病率為30%，病死率為10%(表1)。

表1 SD2012-1病毒株感染SPF雞的發(fā)病率和死亡率

2.2 病理變化

2.2.1 病死雞的剖檢變化 攻毒后第6周，死亡雞剖檢無明顯的眼觀腫瘤病變，僅見肝、腎、脾和法氏囊腫脹，肝脂肪變性，腺胃黏液分泌增多、黏膜出血(圖1)。攻毒后第9周，死亡雞剖檢有明顯的眼觀腫瘤病變，肝、腎、脾腫大，肝、腎、脾和腸系膜有明顯腫瘤結(jié)節(jié)，肌胃角質(zhì)膜增厚、潰爛、易剝離(圖2)。

a.肝邊緣黃色彌漫性變性；b.肝表面凹凸不平；c.法氏囊腫大；d.肌胃腫大；e.腺胃腫大；f.脾腫大并有大量白色散在結(jié)節(jié)；g.腎腫大蒼白a.Yellow degeneration diffusely in liver edge；b.Rough and uneven in liver surface；c.Bursa of Fabricius swelling；d.Muscular stomach swelling；e.Glandular stomach swelling；f.Lots of white diffused nodule in the swelled spleen；g.Kidney swelling and pale in color圖1 攻毒后第6周死亡雞的病理變化Fig.1 Lesions on dead chickens 6 weeks post infection with SD2012-1

a.腸系膜變厚且有散在結(jié)節(jié)；b.十二指腸黏膜潰瘍；c.肝散在白色結(jié)節(jié)；d.肌胃腫大且角質(zhì)層變厚，易剝離；e.心白色結(jié)節(jié)a.Diffused nodule in the thicken mesentery；b.Ulcer in duodenal mucosa；c.White nodule in the live；d.Muscular stomach swelling with thicken corneum layer，and easy to be peeled；e.White nodule in the heart圖2 攻毒后第9周死亡雞的病理變化Fig.2 Lesions on dead chickens 9 weeks post infection with SD2012-1

2.2.2 病理組織學(xué)觀察 顯微鏡下觀察，攻毒后第2周，攻毒雞心輕度淤血，肝細(xì)胞輕度腫脹，脾輕度出血，腎小管上皮細(xì)胞腫脹(圖3)。

攻毒后第6周，攻毒雞主要表現(xiàn)為心輕度出血，肝有散在腫瘤細(xì)胞，脾淤血，腎輕度出血，有散在的腫瘤細(xì)胞灶(圖4)。

攻毒后第9周，攻毒雞主要表現(xiàn)為心有腫瘤細(xì)胞聚集，肝中央靜脈和小葉間靜脈淤血，周圍有腫瘤細(xì)胞浸潤增生，脾有腫瘤細(xì)胞，實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，腎有大量腫瘤細(xì)胞聚集(圖5)。

A.攻毒SPF雞心出血(100×)；B.攻毒SPF雞肝細(xì)胞輕度腫脹(400×)；C.攻毒SPF雞脾輕度出血(100×)；D.攻毒SPF雞腎小管上皮細(xì)胞腫脹 (400×)A.Haemorrhage in the heart of the SPF chicken infected with virus (100×)；B.Swelling of the liver cells of the SPF chicken infected with virus (400×)；C.Mild haemorrhage in the spleen of the SPF chicken infected with virus (100×)；D.Renal tubular epithelial cell swelling of the SPF chicken infected with virus (400×)圖3 攻毒后第2周死亡雞組織病理變化(HE染色)Fig.3 Histopathologic lesions on dead chickens 2 weeks post infection with SD2012-1 (HE)

A.攻毒SPF雞心淤血、出血(100×)；B.攻毒SPF雞肝有局灶性的腫瘤細(xì)胞(400×)；C.攻毒SPF雞脾明顯出血(100×)；D.攻毒SPF雞腎可見散在的腫瘤灶(40×)A.Congestion and haemorrhage in the heart of the SPF chicken infected with virus (100×)；B.Tumor cells focally distributed the liver of the SPF chicken infected with virus (400×)；C.Haemorrhage in the spleen of the SPF chicken infected with virus (100×)；D.Scattered tumor cells in the kidney of the SPF chicken infected with virus (40×)圖4 攻毒后第6周死亡雞組織病理變化(HE染色)Fig.4 Histopathologic lesions on dead chickens 6 weeks post infection with SD2012-1(HE)

A.攻毒SPF雞心腫瘤細(xì)胞灶(100×)；B.攻毒SPF雞肝淤血、血管周圍有大量腫瘤細(xì)胞堆積(100×)；C.攻毒SPF雞脾有散在的腫瘤細(xì)胞，實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死(400×)；D.攻毒SPF雞腎大量腫瘤細(xì)胞聚集(100×)A.tumor cells accumulated in the heart of the SPF chicken infected with virus (100×)；B.lots of tumor cells around the vessel and congestion in the liver of the SPF chicken infected with virus (100×)；C.some cells necrose and some tumor cells scattered in the spleen of the SPF chicken infected with virus (400×)；D.lots of tumor cells accumulated in the kidney of the SPF chicken infected with virus (100×)圖5 攻毒后第9周死亡雞組織病理變化(HE染色)Fig.5 Histopathologic lesions on dead chickens 9 weeks post infection with SD2012-1(HE)

2.3 病毒的PCR跟蹤監(jiān)測

2.3.1 病毒的PCR檢出率 試驗(yàn)雞用MDV超強(qiáng)毒株SD2012-1攻毒后，用PCR方法檢測羽髓MDV，樣品MDV陽性檢出率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，PCR電泳結(jié)果見圖6和圖7。SD2012-1攻毒后第5天，未免組MDV陽性檢出率為25%，HVT免疫組MDV陽性檢出率為20%，CVI988免疫組MDV全部陰性；SD2012-1攻毒后第10天，未免組和HVT免疫組MDV陽性檢出率為100%和95%，CVI988免疫組MDV陽性檢出率為30%；SD2012-1攻毒后第20天，未免疫組、HVT免疫組和CVI988免疫組陽性檢出率均為100%；3組試驗(yàn)雞的MDV陽性檢出率的遞增結(jié)果見圖8。

表2 感染SD2012-1的病毒PCR檢測結(jié)果

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.CVI988病毒陽性對照；2.SD2012-1病毒陽性對照；3.陰性對照；4～13.SD2012-1攻毒后第5天雞羽髓樣品M.DL2000 DNA marker；1.CVI988 positive control；2.SD2012-1 positive control；3.Negative control；4-13.Feather pulp samples from chickens of day 5 post infection with SD2012-1圖6 SD2012-1攻毒后第5天部分雞羽髓樣品MDV的PCR檢測結(jié)果Fig.6 PCR amplification for chicken feather samples of day 5 post infection with SD2012-1

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.CVI988病毒陽性對照；2.SD2012-1病毒陽性對照；3.陰性對照；4～13.SD2012-1攻毒后第20天雞羽髓樣品M.DL2000 DNA marker；1.CVI988 positive control；2.SD2012-1 positive control；3.Negative control；4-13.Feather pulp samples from chickens of day 20 post infection with SD2012-1圖7 SD2012-1攻毒后第20天部分雞羽髓樣品MDV的PCR檢測結(jié)果Fig.7 PCR amplification for chicken feather samples of day 20 post infection with SD2012-1

圖8 攻毒SD2012-1試驗(yàn)雞的PCR陽性檢出率遞增示意Fig.8 Curve of positive rate of MDV by PCR

2.3.2 存活雞的帶毒試驗(yàn)結(jié)果 從CVI988免疫組選取5只健康活雞，從攻毒后30 d起，每隔30 d定期拔取羽髓。用PCR方法定期對存活雞羽髓進(jìn)行PCR檢測(圖9)，統(tǒng)計(jì)MD病原檢出率。如表3所示，310日齡試驗(yàn)雞(感染SD2012-1病毒300 d)羽髓的PCR檢測結(jié)果均為100% MDV陽性。

表3 存活雞的帶毒試驗(yàn)結(jié)果

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.CVI988病毒陽性對照；2.SD2012-1病毒陽性對照；3.陰性對照；4～13.部分存活雞羽髓樣品M.DL2000 DNA marker；1.CVI988 positive control；2.SD2012-1 positive control；3.Negative control；4-13.Feather pulp samples from living chickens圖9 部分存活帶毒雞的羽髓PCR檢測結(jié)果Fig.9 PCR amplification for feathers from living chickens infected with SD2012-1

2.3.3 病毒在感染雞體內(nèi)的分布 用PCR方法檢測病死雞的肝、腎、肌胃、腸系膜、十二指腸、心和法氏囊樣品，這些被檢測樣品均在1 081 bp的位置擴(kuò)增出了特異性的目的條帶(圖10)，表明這些被檢測的臟器中均存在SD2012-1株馬立克病病毒感染。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.CVI988病毒陽性對照；2.SD2012-1病毒陽性對照；3.肝；4.腎；5.肌胃；6.腸系膜；7.十二指腸；8.心；9.法氏囊M.DL2000 DNA marker；1.CVI988 positive control；2.SD2012-1 positive control；3.Liver；4.Kidney；5.Muscular stomach；6.Mesentery；7.Duodenum；8.Heart；9.Bursa of Fabricius圖10 發(fā)病雞各臟器的病毒PCR檢測結(jié)果Fig.10 PCR amplification for organs from chickens infected with SD2012-1

3 討 論

20世紀(jì)90年代初，歐美地區(qū)發(fā)現(xiàn)超強(qiáng)馬立克病病毒株，這些地區(qū)在使用Ⅱ+Ⅲ型雙價(jià)疫苗和CVI988/Rispens1型疫苗后，并不能對超強(qiáng)毒株感染有很好的保護(hù)。這被視為MDV毒力趨于更強(qiáng)的一個(gè)信號(hào)[13-14]。本研究中，用MDV超強(qiáng)病毒株SD2012-1株分別感染未注射疫苗、HVT 疫苗免疫和CVI988疫苗免疫的3組試驗(yàn)雞，其中HVT免疫雞與未免疫雞的發(fā)病率均高達(dá)85%，這說明HVT疫苗對于MD病毒SD2012-1株幾乎無保護(hù)作用；此外，SD2012-1可以突破CVI988疫苗免疫，引起高達(dá)30%的雞發(fā)生馬立克病。免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，超強(qiáng)馬立克病病毒株對國內(nèi)防控雞馬立克病提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

超強(qiáng)馬立克病病毒株引起的臨床癥狀多為內(nèi)臟型，病程較急，主要由于病毒對于機(jī)體的感染性較強(qiáng)決定。本研究中，病死雞的心、肝、脾、肺和腎均出現(xiàn)腫瘤病變，并通過PCR方法可以檢測到這些組織器官的病原。這說明超強(qiáng)馬立克病病毒株SD2012-1對于雞具有較強(qiáng)的感染性。超強(qiáng)MDV毒株一般最快在病毒感染后第10天左右可引起MD的臨床癥狀[13]，但有意思的是，本研究中，由SD2012-1引起的癥狀發(fā)病較慢，早期MD癥狀并不典型，最早于攻毒后第6周出現(xiàn)MD臨床癥狀，攻毒后第8—9周，才觀察到雞大量發(fā)病，出現(xiàn)腫瘤病變。

MDV進(jìn)入機(jī)體后，主要是被吞噬細(xì)胞吞噬或共價(jià)吸附進(jìn)入敏感的淋巴細(xì)胞，合成病毒粒子。這些新合成的病毒粒子通過細(xì)胞間橋接觸感染其他細(xì)胞，再以上述方式進(jìn)入新感染的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，導(dǎo)致少數(shù)T細(xì)胞也發(fā)生細(xì)胞溶解，并發(fā)生漸進(jìn)性壞死，激發(fā)炎性反應(yīng)，還伴有巨噬細(xì)胞、粒性白細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞浸潤[14]。在這一感染過程中，病毒的復(fù)制能力和致瘤性，是其是否致病的關(guān)鍵因素。超強(qiáng)馬立克病病毒株可以引起嚴(yán)重的免疫器官衰竭和明顯的免疫抑制，通過反復(fù)發(fā)生溶細(xì)胞性感染，淋巴器官受損，并產(chǎn)生轉(zhuǎn)化感染，誘發(fā)腫瘤形成[15-16]。本研究中，攻毒SD2012-1的免疫雞的心、肝、脾、肺和腎中均檢測出馬立克病病毒超強(qiáng)毒株，說明病毒在這些內(nèi)臟器官中可以復(fù)制。內(nèi)臟的病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在病毒感染中后期，心、肝、脾、腎等組織器官出現(xiàn)了明顯的腫瘤細(xì)胞灶狀增生。中期(攻毒后第6—8周)在低倍鏡下觀察見淋巴樣瘤細(xì)胞浸潤，后期(攻毒后第8周起)脾出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞壞死現(xiàn)象。這一試驗(yàn)結(jié)果說明MD腫瘤的形成與病毒在淋巴細(xì)胞中的復(fù)制所引起的病變具有一定的相關(guān)性。

CVI988病毒的meq基因較超強(qiáng)MDV毒株的meq基因多177 bp[17-18]。本研究中所采用的PCR試驗(yàn)基于擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA長度不同，可以區(qū)分CVI988疫苗病毒和超強(qiáng)MDV毒株[12]。本研究中，CVI988免疫組雞于1日齡接種CVI988疫苗，于10日齡攻毒SD2012-1，之后采集存活雞的羽髓和病死雞的內(nèi)臟器官，利用PCR試驗(yàn)檢測樣品中的MDV。從該組雞PCR試驗(yàn)的檢測結(jié)果來看，感染SD2012-1第10天，30%雞羽髓樣品為超強(qiáng)毒陽性，病死雞內(nèi)臟及感染SD2012-1第20天后羽髓SD2012-1的PCR陽性率是100%；PCR試驗(yàn)并沒有從該組雞檢測出CVI988病毒。這說明試驗(yàn)雞體內(nèi)盡管之前注射過CVI988疫苗，但之后該疫苗病毒已經(jīng)在雞體內(nèi)不復(fù)存在，或者是病毒含量低至該P(yáng)CR靈敏度以下。參考以往關(guān)于雞馬立克病的流行病學(xué)調(diào)查研究，也可以發(fā)現(xiàn)，在免疫過CVI988的雞群中，并不能用PCR檢測出CVI988病毒[19-20]。為什么注射CVI988活疫苗的雞群中檢測不到疫苗毒株，而攻毒超強(qiáng)病毒SD2012-1的雞群可以檢測出該MDV超強(qiáng)病毒，且持續(xù)300 d后MDV超強(qiáng)病毒檢測仍然陽性？可能是因?yàn)榕cCVI988相比，超強(qiáng)馬立克病病毒株具有突破雞體免疫的能力，能夠長期在淋巴細(xì)胞中復(fù)制，并長期存活下來，而常規(guī)的MDV毒株(主要是疫苗株)不具備在雞體內(nèi)進(jìn)一步大量復(fù)制的能力。

[1] 蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：313. CAI B X.Livestock infectious diseases[M].Beijing：China Agriculture Press，2001：313.(in Chinese)

[2] 周 蛟，周 煜，林 健，等.我國雞馬立克氏病的流行現(xiàn)狀及防制對策[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì).中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2003年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)，2003：4. ZHOU J，ZHOU Y，LIN J，et al.Marek’s disease epidemic situation in China and countermeasures of prevention and control[C]//China institute of animal husbandry and veterinary medicine.China institute of animal husbandry and veterinary medicine symposium in 2003.China Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2003：4.(in Chinese)

[3] 許大明，漢麗梅，劉 丹，等.馬立克氏病疫苗研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007(3)：13-14. XU D M，HAN L M，LIU D，et al.Research progress of Marek’s disease vaccine[J].ShanghaiJournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，2007(3)：13-14.(in Chinese)

[4] 韋 平.馬立克氏病研究的最新動(dòng)態(tài)—第八屆國際馬立克氏病研討會(huì)概況[J].中國家禽，2008，30(17)：6-14. WEI P.The latest developments in the study of Marek’s disease-The eighth session of the international symposium of Marek’s disease[J].ChinaPoultry， 2008，30(17)：6-14.(in Chinese)

[5] 李漢秋，周 煜，林 健，等.雞馬立克氏病CV1988/Rispens冷凍活疫苗和HVT凍干苗效力比較試驗(yàn)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24(1)：41-43. LI H Q，ZHOU Y，LIN J，et al.Efficiency comparative experiment of chicken Marek′s disase between Cryophilic Vaccine(CV1988/Rispens)and Lyophilized Vaccine(HVT)[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2002，24(1)：41-43.(in Chinese)

[6] 崔 寧，蘇 帥，陳孜孟，等.中國3種不同地方品系雞對馬立克病毒超強(qiáng)毒株rMd5易感性比較[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45(1)：101-106. CUI N，SU S，CHEN Z M，et al.Comparison of the susceptibility of three different local chicken lines in China to very virulent strain rMd5[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(1)：101-106.(in Chinese)

[7] VENUGOPAL K.Marek’s disease：an update on oncogenic mechanisms and control[J].ResVetSci，2000，69(1)：17-23.

[8] JAROSINSKI K W，TISCHER B K，TRAPP S，et al.Marek’s disease virus：lytic replication，oncogenesis and control[J].ExpertRevVaccines，2006，5(6)：761-772.

[9] 滕麗瓊，韋 平，宋中寶，等.一株整合有禽反轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列的馬立克氏病病毒野毒株的致病性研究[J].病毒學(xué)報(bào)，2009，25(5)：376-381. TENG L Q，WEI P，SONG Z B，et al.Evaluation of the pathogenicity of a field isolate of Marek’s disease virus integrated with retroviral long terminal repeat sequence[J].ChineseJournalofVirology，2009，25(5)：376-381.(in Chinese)

[10] GONG Z，ZHANG L，WANG J，et al.Isolation and analysis of a very virulent Marek’s disease virus strain in China[J].VirolJ，2013，10：155.

[11] 張麗娟，龔振華，管遠(yuǎn)紅，等.一種用于馬立克氏病病原檢測的PCR技術(shù)研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36(1)：216-220. ZHANG L J，GONG Z H，GUAN Y H，et al.Studies of PCR detection technology on Marek’s disease pathogen[J].ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis，2014，36(1)：216-220.(in Chinese)

[12] 張 康，龔振華，林祥超，等.對一株超強(qiáng)馬立克氏病毒株的檢測和研究[J].中國動(dòng)物檢疫，2015，32(4)：14-17，31. ZHANG K，GONG Z H，LIN X C，et al.Detection and analysis of a very virulent Marek’s disease virus strain[J].ChinaAnimalHealthInspection，2015，32(4)：14-17，31.(in Chinese)

[13] WITTER R L，LEE L F，F(xiàn)ADLY A M.Characteristics of CVI988/Rispens and R2/23，two prototype vaccine strains of serotype 1 Marek’s disease virus[J].AvianDis，1995，39(2)：269-284.

[14] DAVISON F，NAIR V.Use of Marek’s disease vaccines：could they be driving the virus to increasing virulence?[J].ExpertRevVaccines，2005，4(1)：77-88.

[15] 賀君君.馬立克氏病病毒在不同抗性雞體內(nèi)的復(fù)制動(dòng)力學(xué)研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2011. HE J J.Marek’s disease virus replication kinetics in different resistant chickens[D].Nanning：Guangxi University，2011.(in Chinese)

[16] 賀君君，滕麗瓊，韋 平，等.馬立克氏病病毒體內(nèi)復(fù)制動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[J].中國家禽，2011，33(5)：47-51. HE J J，TENG L Q，WEI P，et al.Research progress of Marek’s disease virus replication kinetics[J].ChinaPoultry，2011，33(5)：47-51.(in Chinese)

[17] CHANG K S，OHASHI K，ONUMA M.Diversity (polymorphism) of themeqgene in the attenuated Marek’s disease virus (MDV) serotype 1 and MDV-transformed cell lines[J].JVetMedSci，2002，64(12)：1097-1101.

[18] LEE L F，WU P，SUI D，et al.The complete unique long sequence and the overall genomic organization of the GA strain of Marek’s disease virus[J].ProcNatlAcadSciUSA，2000，97(11)：6091-6096.

[19] 鄭永勝，張艷萍，李志杰，等.雞馬立克氏病病毒疫苗株對強(qiáng)毒株的復(fù)制抑制作用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36(1)：7-10. ZHENG Y S，ZHANG Y P，LI Z J，et al.Inhibition of Marek’s disease vaccine virus on replication of the virulent virus strain[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2014，36(1)：7-10.(in Chinese)

[20] 陳瑞愛.常用馬立克氏病疫苗的評價(jià)及免疫失敗原因分析[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004. CHEN R A.Analysis of the failure of Marek’s disease vaccine evaluation and immune cause[D].Guangzhou：South China Agricultural University，2004.(in Chinese)

(編輯 白永平)

Studies on Pathogenicity of a Very Virulent Marek’s Disease Virus Strain

GONG Zhen-hua1，ZHANG Kang1，2，WANG Li-ping3，GUO Guang-li4，LI Jin-ping1，YU Jian-min1，LI Lei1，HOU Guang-yu1，WANG Jian-lin2*，SHAN Hu2

(1.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032，China；2.Collegeofanimalscienceandtechnology，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China；3.QingdaoYebioBioengineeringCo.，Ltd，Qingdao266032，China；4.LinquAnimalHusbandryandVeterinaryAdministration，Linqu262600，China)

In this study，the pathogenicity of a very virulent Marek’s disease virus (MDV) SD2012-1 strain was analyzed.sixty SPF chickens were randomly divided into 3 groups：non-immunized group，HVT immunized group and CVI988 immunized group.Chickens were vaccinated with different types of MD vaccine at 1-day-old，and were challenged with SD2012-1 strain at 10-day-old.The challenged chickens were housed in separate isolators，and were sampled for clinic，histopathology and PCR detection of MDV.Clinical and histopathologic lesions in the infected chickens showed：slight histopathologic lesions were developed at 2 weeks post challenge，characteristic histopathologic lesions with scattered clumps of tumor cells were developed at the 6th weeks post challenge，and grossly obvious tumor lesions with large number of tumor cell aggregates were developed at the 9th weeks post challenge；SD2012-1 could break through the protection of CVI988 vaccine，causing MD with up to 30% rate in immunized chickens.PCR tracking of MDV in the infected chickens showed：MDV could be detected in non-immunized group and HVT group at 5 days post challenge；the positive rates of MDV were 100% in non-immunized and HVT group，30% in CVI988 group，at 10 days post challenge；the positive rates in the three groups were all 100% at 20 days post challenge；samples，including liver，kidney，muscular stomach，mesentery，duodenum，heart and bursa of Fabricius collected from clinical chickens，were all MDV positive by PCR，feather pulp samples collected from the infected living chickens were all MDV positive by PCR.When infected with MDV SD2012-1，chickens immunized with HVT hardly had protective effect on this virus，and the long-term existence of SD2012-1 in chickens immunized with CVI988 vaccine could break through its immune protection，which proposed a severe challenge for Marek’s disease prevention and control.

very virulent Marek’s disease virus；immune；challenge；tumor

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.016

2015-04-03

山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CL022)；青島市科技計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(11-2-4-5-<11>-jch)

龔振華(1968-)，男，湖南岳陽人，副研究員，主要從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研究，E-mail：gzh1832@126.com，Tel：0532-85652282

*通信作者：王建琳(1976-)，女，山西沁源人，副教授，博士，主要從事禽病發(fā)生機(jī)制的研究，E-mail：bjsxxw@126.com

S852.659.1

A

0366-6964(2015)07-1191-10