MDV感染B19、B21單倍型SPF雞外周血淋巴細(xì)胞BLec1、BNK及細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平比較

寧官保，田文霞，張園華，，張 鼎，張曉娜，韓凌霞*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)中心/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

MDV感染B19、B21單倍型SPF雞外周血淋巴細(xì)胞BLec1、BNK及細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平比較

寧官保1，田文霞1，張園華1，2，張 鼎3，張曉娜2，韓凌霞2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)中心/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

本研究旨在揭示BLec1、BNK及細(xì)胞因子在B21和B19兩種單倍型雞對(duì)馬立克病(MD)抗性差異中的可能機(jī)制。分別對(duì)B21和B19單倍型1日齡雞腹腔接種馬立克病毒(MDV)超強(qiáng)毒株，在攻毒后不同時(shí)間檢測(cè)雞外周血淋巴細(xì)胞中BLec1、BNK及IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-18的基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在第4、7 天，兩種雞BNK、BLec1和4種細(xì)胞因子水平表現(xiàn)出不同程度的降低。在第10天，B21單倍型雞中BNK、BLec1、IFN-γ、IL-4和IL-18基因轉(zhuǎn)錄量出現(xiàn)不同程度的升高，而B(niǎo)19單倍型雞中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平有所下降。在第13天，B21單倍型雞中BNK、BLec1、IL-18和IL-10基因轉(zhuǎn)錄量表現(xiàn)出不同程度的升高，而B(niǎo)19單倍型雞中則有所下降。以上結(jié)果總體表明，MD耐受型雞在感染沉默期BNK、BLec1和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄量高于敏感型，不同遺傳基因型雞對(duì)MD的抗性差異與耐受基因及細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄情況有著密切的關(guān)系。

細(xì)胞因子；BLec1；BNK；基因轉(zhuǎn)錄

雞馬立克病(MD)是由馬立克病毒(MDV)引起的淋巴組織增生性疾病。MD的發(fā)病過(guò)程涉及第一次溶細(xì)胞感染期(2～7 dpi)、潛伏期(7～10 dpi)、第二次溶細(xì)胞感染期(13～21 dpi)和腫瘤細(xì)胞增生期等四個(gè)階段。在第一次溶細(xì)胞感染期，MDV產(chǎn)生核內(nèi)包涵體并引起細(xì)胞崩解，形成漸進(jìn)性壞死，機(jī)體隨后出現(xiàn)淋巴器官的萎縮，引起免疫抑制。進(jìn)入潛伏期后，細(xì)胞出現(xiàn)免疫應(yīng)答，機(jī)體開(kāi)始產(chǎn)生免疫反應(yīng)。到第二次溶細(xì)胞感染期時(shí)，機(jī)體的免疫應(yīng)答效果主要取決于雞的遺傳背景，通常遺傳耐受雞不會(huì)從潛伏期發(fā)展到第二次溶細(xì)胞感染期。而遺傳易感雞則繼續(xù)發(fā)生溶細(xì)胞感染，使淋巴器官嚴(yán)重萎縮，引起持久的免疫抑制[1-2]。所以，宿主遺傳背景對(duì)MD感染雞的死亡率和腫瘤形成分布有著重要的影響[3]。研究表明，雞對(duì)MD的易感或耐受性與雞主要組織相容性復(fù)合體(MHC)有關(guān)[2]。雞MHC長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是影響疾病易感或耐受的免疫反應(yīng)系統(tǒng)[4]。BNK和BLec1基因位于雞MHC核心區(qū)域，參與C型凝集素區(qū)域的編碼[5]。BNK是被唯一證明表達(dá)于雞NK細(xì)胞上的C型凝集素樣蛋白，有可能是雞NK細(xì)胞的受體。不同MHC單倍型雞的BNK等位基因具有高度多態(tài)性，從序列特征上推論，BLec1編碼蛋白是雞BNK的配體。

研究表明，MD耐受或易感雞在MDV感染過(guò)程中細(xì)胞因子表達(dá)情況存在差異。MDV感染雞脾中IFN-γ、IL-6、IL-18基因的表達(dá)水平與病毒在雞脾中的積聚有關(guān)[5]。B.J.Baaten等發(fā)現(xiàn)IFN-γ在MD耐受雞上的表達(dá)量會(huì)顯著增高[6]。P.Parvizi等研究也發(fā)現(xiàn)IL-10和IL-18在MD易感雞T細(xì)胞中的表達(dá)顯著上升，而IL-6在耐受雞中的表達(dá)非常高[7]。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所根據(jù)MHC-B 核心區(qū)域中的4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因[8]，在國(guó)內(nèi)首次選育成功B13、B15、B2、B5、B21 和 B19等六種單倍型無(wú)特定病原體(SPF)雞群[9]。其中B21單倍型雞對(duì)MD的抗性最強(qiáng)，B19單倍型雞對(duì)MD的抗性最弱。為了了解B21和B19單倍型雞對(duì)MD耐受差異的可能機(jī)制，選擇多種與雞疾病易感或耐受相關(guān)的基因，通過(guò)檢測(cè)MDV處理后B21和B19單倍型雞淋巴細(xì)胞中BNK、BLec1及多種細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平，揭示這些基因在雞MD抗性過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡B19、B21單倍型SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)為黑SCXK-2011。MDV Md5病毒由本課題組保存。T-IFN-γ、T-IL-4、T-IL-10、T-IL-18和T-28S rRNA重組質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；RNAiso Plus、M-MLV、Premix Ex TaqTM購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；雞外周血淋巴細(xì)胞分離液、Concanavalin A(ConA)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；改良型RPMI-1640 培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司。

1.2 MDV感染B19和B21單倍型SPF雞

1日齡B19單倍型和B21單倍型SPF雞各20羽，分為攻毒組和對(duì)照組，分別飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)。攻毒組腹腔感染MDV Md5細(xì)胞毒，每羽800 PFU；對(duì)照組雞接種等體積的無(wú)菌的PBS溶液。分別在攻毒后第4、7、10、13、19 天(dpi)時(shí)翅靜脈采集所有試驗(yàn)雞枸櫞酸鈉抗凝血，用于提取總RNA及細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄量的檢測(cè)。20 dpi結(jié)束試驗(yàn)。所有存活雞均按照本單位的動(dòng)物管理與使用委員會(huì)規(guī)定的要求采用安樂(lè)術(shù)致死。

1.3 雞外周血淋巴細(xì)胞總RNA的提取及cDNA合成

參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)分離雞外周血淋巴細(xì)胞。將淋巴細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL。2 h后向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終質(zhì)量濃度為25 μg·mL-1的ConA，置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，此期間每隔4 h晃動(dòng)培養(yǎng)板一次。參考RNAiso Plus試劑說(shuō)明書(shū)提取雞外周血淋巴細(xì)胞總RNA，參照M-MLV說(shuō)明書(shū)利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄、合成cDNA。

1.4 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立

根據(jù)GenBank 檢索的GallusGallusBLec1 基因序列(AM950193)，利用 Oligo 6 設(shè)計(jì)特異性引物。以雞外周血淋巴細(xì)胞cDNA為模板，分別擴(kuò)增BLec1、BNK19和BNK21基因。各基因引物和探針設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃20 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。參照pMD?18-T Simple Vector說(shuō)明書(shū)將回收產(chǎn)物克隆入pMD?18-T Simple Vector載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒T-ChBLec、T-BNK19、T-BNK21。參照AXYGEN質(zhì)粒提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取T-ChBLec、T-BNK19、T-BNK21、T-28S rRNA質(zhì)粒。將各質(zhì)粒分別與T-28S rRNA混勻，10倍倍比稀釋至1.0×101拷貝·μL-1，以101～109拷貝·μL-1的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以28S rRNA為內(nèi)參基因。目的基因/內(nèi)參基因混合質(zhì)粒模板2 μL，2×Premix ExTaq12.5 μL，上、下游引物各10 pmoL，探針8 pmoL，ddH2O 4.9 μL。使用Bio / Rad IQ5定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；94 ℃20 s，60 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)。IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-18等基因的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法按照先前建立的方法進(jìn)行[11]。

1.5 雞外周血淋巴細(xì)胞中各基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的定量PCR檢測(cè)

按照1.4建立的條件對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞中各目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。

表1 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物及探針序列

2 結(jié) 果

2.1 B19和B21單倍型雞外周血淋巴細(xì)胞中BLec1轉(zhuǎn)錄水平的比較

10 dpi時(shí)，BLec21對(duì)照組高于BLec19對(duì)照組；7、13、19 dpi時(shí)，BLec21對(duì)照組極顯著低于BLec19對(duì)照組(P<0.01)。4 dpi時(shí)，BLec21攻毒組顯著高于BLec19攻毒組(P<0.05)；7、10、19 dpi時(shí)，BLec21攻毒組極顯著低于BLec19攻毒組(P<0.01)。B19單倍型在4、13 dpi時(shí)，BLec19對(duì)照組極顯著高于BLec19攻毒組(P<0.01)；10 dpi時(shí)，BLec19對(duì)照組極顯著低于BLec19攻毒組(P<0.01)；19 dpi時(shí)，BLec19對(duì)照組顯著高于BLec19攻毒組(P<0.05)。B21單倍型在7、19 dpi時(shí)，BLec21對(duì)照組極顯著高于BLec21攻毒組(P<0.01)；13 dpi時(shí)，BLec21對(duì)照組極顯著低于BLec21攻毒組(P<0.01)(圖1)。

a.BLec21對(duì)照組/BLec19對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；a*.BLec21對(duì)照組/BLec19對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；b.BLec21攻毒組/BLec19攻毒組差異顯著(P<0.05)；b*.BLec21攻毒組/BLec19攻毒組為極顯著(P<0.01)；c.BLec21對(duì)照組/BLec21攻毒組差異顯著(P<0.05)；c*.BLec21對(duì)照組/BLec21攻毒組差異極顯著(P<0.01)；d.BLec19對(duì)照組/BLec19攻毒組差異顯著(P<0.05)；d*.BLec19對(duì)照組/BLec19攻毒組差異極顯著(P<0.01) a.BLec21 control group/BLec19 control group，P<0.05；a*.BLec21 control group/BLec19 control group，P<0.01；b. BLec21 attack drug group/BLec19 attack group，P<0.05，b*. BLec21 attack drug group/BLec19 attack group was very significant，P<0.01；c. BLec21 control group/BLec21 attack drug group，P<0.05；c*. BLec21 control group/BLec21 attack group，P<0.01；d.BLec19 control group /BLec19 attack drug group，P<0.05；d*.BLec19 control group/BLec19 attack drug group，P<0.01圖1 B19和B21單倍型雞PBL在不同時(shí)間點(diǎn)BLec1轉(zhuǎn)錄水平的比較Fig.1 Comparison of BLec1 transcription of B19 and B21 haplotype PBL

2.2 B19和B21單倍型雞外周血淋巴細(xì)胞在不同時(shí)間BNK轉(zhuǎn)錄水平的比較

7、10、13、19 dpi時(shí)，BNK21對(duì)照組顯著低于BNK19對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)。4 dpi時(shí)，BNK21攻毒組極顯著高于BNK19攻毒組(P<0.01)；7、10 dpi時(shí)，BNK21攻毒組顯著低于BNK19攻毒組(P<0.05或P<0.01)。B19單倍型在4 dpi時(shí)，BNK19對(duì)照組顯著高于BNK19攻毒組(P<0.05)；10 dpi時(shí)，BNK19對(duì)照組顯著低于BNK19攻毒組(P<0.05)；13 dpi時(shí)，BNK19對(duì)照組極顯著高于BNK19攻毒組(P<0.01)。B21單倍型在7 dpi時(shí)，BNK21對(duì)照組極顯著高于BNK21攻毒組(P<0.01)；13 dpi時(shí)，BNK21對(duì)照組顯著低于BNK21攻毒組(P<0.05)(圖2)。

a.BNK21對(duì)照組/BNK19對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；a*.BNK21對(duì)照組/BNK19對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；b.BNK21攻毒組/BNK19攻毒組差異顯著(P<0.05)；b*.BNK21攻毒組/BNK19攻毒組為極顯著(P<0.01)；c.BNK21對(duì)照組/BNK21攻毒組差異顯著(P<0.05)；c*.BNK21對(duì)照組/BNK21攻毒組差異極顯著(P<0.01)；d.BNK19對(duì)照組/BNK19攻毒組差異顯著(P<0.05)；d*.BNK19對(duì)照組/BNK19攻毒組差異極顯著(P<0.01)a.BNK21 control group/BNK19 control group，P<0.05；a*.BNK21 control group/BNK19 control group，P<0.01；b. BNK21 attack drug group/BNK19 attack group，P<0.05，b*. BNK21 attack drug group/BNK19 attack group was very significant，P<0.01；c. BNK21 control group/BNK21 attack drug group，P<0.05；c*. BNK21 control group/BNK21 attack group，P<0.01；d.BNK19 control group /BNK19 attack drug group，P<0.05；d*.BNK19 control group/BNK19 attack drug group，P<0.01圖2 B19和B21單倍型雞PBL在不同時(shí)間點(diǎn)中BNK轉(zhuǎn)錄水平的比較Fig.2 Comparison of BNK transcription of B19 and B21 haplotype PBL

2.3 B19和B21單倍型雞外周血淋巴細(xì)胞在不同時(shí)間IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平的比較

IFN-γ轉(zhuǎn)錄在4、13 dpi時(shí)B21單倍型對(duì)照組極顯著高于B19單倍型對(duì)照組(P<0.01)，在7、10 dpi時(shí)顯著低于B19單倍型對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)；而攻毒后4、10和19 dpi時(shí)B21單倍型攻毒組高于B19單倍型攻毒組，7、13 dpi 時(shí)B21單倍型攻毒組低于B19單倍型攻毒組，其中4、7、10、13 dpi時(shí)具有顯著性(P<0.01)(圖3)。

2.4 B19和B21單倍型雞外周血淋巴細(xì)胞在不同時(shí)間IL-4轉(zhuǎn)錄水平的比較

IL-4轉(zhuǎn)錄在4 dpi時(shí)B21單倍型對(duì)照組極顯著高于B19單倍型對(duì)照組(P<0.01)，7、10、13和19 dpi時(shí)B21單倍型對(duì)照組顯著低于B19單倍型對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)；攻毒后4 dpi時(shí)B21單倍型攻毒組極顯著高于B19單倍型攻毒組(P<0.01)，7、13和19 dpi時(shí)顯著低于B19單倍型攻毒組(P<0.01或P<0.05)(圖4)。

a.B21對(duì)照組/B19對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；a*.B21對(duì)照組/B19對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；b.B21攻毒組/B19攻毒組差異顯著(P<0.05)；b*.B21攻毒組/B19攻毒組為極顯著(P<0.01) 。下圖同a.B21 control group/B19 control group，P<0.05；a*.B21 control group/B19 control group，P<0.01；b. B21 attack drug group/B19 attack group，P<0.05，b*. B21 attack drug group/B19 attack group was very significant，P<0.01.The same as below圖3 B19和B21單倍型PBL中IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 IFN-γ transcript levels in B19 and B21 haplotype PBL

圖4 B19和B21單倍型PBL中IL-4的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 IL-4 transcript levels in B19 and B21 haplotype

2.5 B19和B21單倍型雞外周血淋巴細(xì)胞在不同時(shí)間IL-10轉(zhuǎn)錄水平的比較

IL-10轉(zhuǎn)錄在4、10 dpi時(shí)B21單倍型對(duì)照組極顯著高于B19單倍型對(duì)照組(P<0.01)，13 dpi時(shí)B21單倍型對(duì)照組極顯著低于B19單倍型對(duì)照組(P<0.01)，而攻毒后4 dpi時(shí)B21單倍型攻毒組極顯著高于B19單倍型攻毒組(P<0.01)，7、13和19 dpi時(shí)極顯著低于B19單倍型攻毒組(P<0.01)(圖5)。

圖5 B19和B21單倍型PBL中IL-10的轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 IL-10 transcript levels in B19 and B21 haplotype PBL

2.6 B19和B21單倍型雞外周血淋巴細(xì)胞在不同時(shí)間IL-18轉(zhuǎn)錄水平的比較

IL-18轉(zhuǎn)錄在4 dpi時(shí)B21單倍型對(duì)照組極顯著高于B19單倍型對(duì)照組(P<0.01)，7、10、13和19 dpi時(shí)B21單倍型對(duì)照組顯著低于B19單倍型對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)；而攻毒后4和10 dpi時(shí)B21單倍型攻毒組顯著高于B19單倍型攻毒組(P<0.01或P<0.05)，7 dpi時(shí)極顯著低于B19單倍型攻毒組(P<0.01)(圖6)。

3 討 論

本研究主要通過(guò)檢測(cè)不同單倍型雞外周血淋巴細(xì)胞中BNK、BLec1及多種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄水平，揭示這些基因在介導(dǎo)B21和B19單倍型雞MD抗性過(guò)程中的作用。C型凝集素是免疫應(yīng)答中具有多種功能的蛋白質(zhì)，它參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，與細(xì)胞因子一樣在機(jī)體的免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用。而B(niǎo)NK和BLec1是C型凝集素上的兩個(gè)受體[10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，B19和B21單倍型MD雞在第一次溶細(xì)胞感染期內(nèi)BNK和BLec1的轉(zhuǎn)錄量均低于正常組，這可能就是由于患雞淋巴器官萎縮導(dǎo)致的免疫抑制引起的。MD患雞常伴隨著大面積的淋巴器官萎縮，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫抑制，這一過(guò)程尤其在第一次溶細(xì)胞感染期和第二次溶細(xì)胞感染期表現(xiàn)最為明顯。研究表明，MD耐受品系雞通常不會(huì)從第一溶細(xì)胞感染期發(fā)展到第二期，而且可能在攻毒后8～14 d淋巴器官得到逐漸恢復(fù)[11]。本試驗(yàn)中10、13 dpi兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)B21型MD患雞BNK和BLec1的分泌量出現(xiàn)上升，這可能是因?yàn)锽21單倍型雞屬于MD耐受雞，患雞在度過(guò)第一溶細(xì)胞期后淋巴器官功能逐漸恢復(fù)，機(jī)體免疫抑制減弱，免疫力得到增強(qiáng)。而B(niǎo)19屬于MD敏感型雞，B19單倍型雞在感染MDV后總體持續(xù)保持免疫抑制，BNK和BLec1的轉(zhuǎn)錄量未出現(xiàn)增加。從以上研究結(jié)果可以看出，BLec1和BNK的表達(dá)與雞MD耐受性有著密切的關(guān)系，但對(duì)其調(diào)控機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步深入展開(kāi)。

機(jī)體免疫應(yīng)答主要是通過(guò)Th1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子來(lái)保持動(dòng)態(tài)平衡[12-13]。本研究中，IFN-γ和IL-18屬于Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要功能是促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和促炎癥因子表達(dá)，最終引起機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。IL-4和IL-10屬于Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要功能是抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，產(chǎn)生抗免疫反應(yīng)作用。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，B19和B21單倍型雞在受到MDV攻毒后，4種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄水平在第一次溶細(xì)胞感染期時(shí)明顯低于正常組，這可能與病雞淋巴器官萎縮有關(guān)。MDV攻毒10、13 d后B21單倍型MD雞細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄量均高于對(duì)照組，這又可能得益于病雞淋巴器官功能的恢復(fù)。B21單倍型雞感染MDV后細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)與BLec1、BNK基因基本一致，這提示B21單倍型雞是通過(guò)提高病雞免疫系統(tǒng)功能，進(jìn)而引起增加機(jī)體免疫應(yīng)答來(lái)對(duì)抗MDV感染。

特別值得注意的是，MDV感染后10 d時(shí)(潛伏期)，B21單倍型雞外周血淋巴細(xì)胞中IFN-γ(19%)、IL-4(5%)和IL-18(32%)的轉(zhuǎn)錄水平均有所增加，而在B19單倍型中上述3種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄量都表現(xiàn)出不同程度的降低(-16%、-29%、-23%)。這與其他文獻(xiàn)中描述的在感染后8～14 d內(nèi)抗性雞淋巴組織功能逐漸恢復(fù)、細(xì)胞因子表達(dá)量出現(xiàn)上升的結(jié)論相吻合[11]。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了細(xì)胞因子的分泌量與遺傳背景有一定的關(guān)系，并共同影響著雞的疾病耐受性。

4 結(jié) 論

基因轉(zhuǎn)錄水平的研究表明B21單倍體型MD抗性雞在MDV感染過(guò)程中BLec1、BNK以及細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-18)轉(zhuǎn)錄量總體高于B19型MD敏感雞。不同遺傳基因型雞耐受基因及細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄情況與雞的MD抗性差異有著密切的關(guān)系。后續(xù)階段可以就每個(gè)MDV感染階段這些基因在雞免疫應(yīng)答中所起的作用展開(kāi)進(jìn)一步研究。

[1] CALNEK B W.Pathogenesis of Marek’s disease virus infection[M]//Marek’s Disease.Springer Berlin Heidelberg，2001：25-55.

[2] 高彩霞.不同 MHC 單倍型 SPF 雞 MHC I 類(lèi)和 II 類(lèi)分子的差異表達(dá)與 MD 致病性的相關(guān)研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012. GAO C X.The association study of differential expression of MHC class I and II molecules with pathogenicity of MD in SPF chickens carrying different MHC haplotypes[D].Lanzhou：Gansu Agricultural University，2012.(in Chinese)

[3] MILLER M M，BACON L D，HALA K，et al.Nomenclature for the chicken major histocompatibility (B and Y) complex[J].Immunogenetics，2004，56(4)：261-279.

[4] TAYLOR R L Jr.Major histocompatibility (B) complex control of responses against Rous sarcomas[J].PoultSci，2004，83(4)：638-649.

[5] ROGERS S L，KAUFMAN J.High allelic polymorphism，moderate sequence diversity and diversifying selection for B-NK but not B-lec，the pair of lectin-like receptor genes in the chicken MHC[J].Immunogenetics， 2008，60(8)：461-475.

[6] BAATEN B J，STAINES K A，SMITH L P，et al.Early replication in pulmonary B cells after infection with Marek’s disease herpesvirus by the respiratory route[J].ViralImmunol，2009，22(6)：431-444.

[7] PARVIZI P，READ L R，ABDUL-CAREEM M F，et al.Cytokine gene expression in splenic CD4+ and CD8+ T cell subsets of genetically resistant and susceptible chickens infected with Marek’s disease virus[J].VetImmunolImmunopathol，2009，132(2-4)：209-217.

[8] GAO C X，HAN L X，QU L D，et al.Specific TaqMan probed real-time quantitative RT-PCR methods and their application to differentiate the transcripts of duplicated BF or BLB genes in chicken MHC[J].VetImmunolImmunopathol，2012，145(3-4)：590-596.

[9] GAO C，HAN L，HAN J，et al.Establishment of six homozygous MHC-B haplotype populations associated with susceptibility to Marek’s disease in Chinese specific pathogen-free BWEL chickens[J].InfectGenetEvol， 2015，29：15-25.

[10] ROGERS S L，KAUFMAN J.High allelic polymorphism，moderate sequence diversity and diversifying selection for B-NK but not B-lec，the pair of lectin-like receptor genes in the chicken MHC[J].Immunogenetics，2008，60(8)：461-475.

[11] 常 爽.非主要組織相容性復(fù)合體宿主遺傳變異對(duì)馬立克氏病疫苗效力的影響[D].吉林：吉林大學(xué)，2010. CHANG S.Assessment of non-MHC host genetic variation effects on Marek’s disease vaccine efficacy[D].Jilin：Jilin University，2010.(in Chinese)

[12] COOK A L，ROCHE M，RAMADAS R，et al.The role of carma1 in Th1 and Th2 polarization of T lymphocytes[J].AmJRespirCritCareMed，2014，189：A4182.

[13] TORRES-MORALES E，TABORDA L，CARDONA N，et al.Th1 and Th2 immune response to P30 and ROP18 peptides in human toxoplasmosis[J].MedMicrobiolImmunol，2014，203(5)：315-322.

(編輯 白永平)

Gene Transcription Comparison ofBLec1，BNKand Cytokines in PBLs of B19 and B21 Haplotype SPF Chickens Infected with MDV

NING Guan-bao1，TIAN Wen-xia1，ZHANG Yuan-hua1，2，ZHANG Ding3，ZHANG Xiao-na2，HAN Ling-xia2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.UnitofLaboratoryAnimalandComparativeMedicine，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

This study was undertaken to reveal the possible resistance mechanism of B19 and B21 haplotype SPF chickens against MDV.One day-old B19 and B21 haplotype chickens were infected with MDV Md5 strain by intramuscular as 800 PFU per feather.The transcription levels of targets genes includingBNK，BLec1，IFN-γ，IL-4，IL-10 andIL-18 were measured at different time points after MDV treatment.Results showed that gene transcription levels ofBNK，BLec1 and the four cytokines in B19 and B21 chickens decreased compared to the control group on the 4th and 7th day post infection (dpi).On the 10th dpi，BNK，BLec1，IFN-γ，IL-4 andIL-18 gene transcriptions highly increased in B21 chicken in different levels，while decreased in B19 chickens.On the 13th dpi，gene transcriptions ofBNK，BLec1，IL-18 andIL-10 in MDV treated B21 chickens also rose in different levels compared to the control group，while decreased in MDV treated B19 chickens.In conclusion，the present study demonstrate that B21 haplotype SPF chickens express high levels ofBNK，BLec1 and cytokines than B19 ones and the resistant difference against MD between MD tolerant and sensitive chickens is related to the gene transcriptions ofBNK，BLec1 and cytokines.

cytokines；BLec1；BNK；gene transcription

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.015

2015-01-26

山西省自然科學(xué)基金(2014011028-1)；科技部支撐項(xiàng)目(2013BAK11B02)

寧官保(1961-)，男，山西聞喜人，副教授，主要從事生物技術(shù)在動(dòng)物傳染病學(xué)與免疫中的應(yīng)用研究，E-mail：ningguanbao034@163.com

*通信作者：韓凌霞，E-mail：hlx1993@126.com

S852.659.1;S813.2

A

0366-6964(2015)07-1184-07