GDF9下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠模型對繁殖與生長的影響

習(xí)欠云，焦 莉，肖 敏，張永亮

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642)

GDF9下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠模型對繁殖與生長的影響

習(xí)欠云，焦 莉，肖 敏，張永亮*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642)

本研究旨在對轉(zhuǎn)GDF9 shRNA基因小鼠進(jìn)行擴(kuò)群繁殖，統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)仔數(shù)及增重，檢測GDF9 shRNA、GDF9表達(dá)水平以及血清中FSH和GH的水平，以觀察GDF9的下調(diào)對轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖性能及生長發(fā)育的影響。通過RT-PCR方法，分別檢測了GDF9 shRNA在體內(nèi)的表達(dá)，以及下丘腦、垂體和卵巢中GDF9 mRNA表達(dá)水平；同時(shí)用ELISA檢測了血液中FSH和GH水平。結(jié)果表明，擴(kuò)群后得到16只GDF9 shRNA陽性小鼠，轉(zhuǎn)基因GDF9 shRNA在小鼠體內(nèi)廣泛表達(dá)，轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)仔數(shù)與野生型小鼠相比差異顯著(P<0.05)；轉(zhuǎn)GDF9 shRNA陽性公鼠的體重比陰性公鼠高，且在第7周差異顯著(P<0.05)，而母鼠間體重?zé)o顯著差異；與陰性小鼠相比，轉(zhuǎn)GDF9 shRNA陽性小鼠GDF9基因的表達(dá)量在下丘腦、垂體中分別下降35.4%和39.8%，差異顯著(P<0.05)，在母鼠卵巢中表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)；陽性母鼠血液中FSH水平比陰性母鼠高55%，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，GDF9基因下調(diào)可以提高動(dòng)物繁殖性能，為提高大型牲畜繁殖力提供了有利的素材和靶點(diǎn)參考。

GDF9；RNA干涉；繁殖；轉(zhuǎn)基因小鼠

GDF9為轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子組成。TGF-β超家族由一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長因子亞家族組成，其中包括TGF-β、活化素(Activin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、生長分化因子(GDF)等。TGF-β除了影響細(xì)胞的增殖、分化，同時(shí)在胚胎發(fā)育、胞外基質(zhì)形成、骨的形成和重建等方面也起著重要作用。近來研究發(fā)現(xiàn)TGF-β超家族中的兩個(gè)成員GDF9在促進(jìn)卵泡發(fā)育過程中起到了非常關(guān)鍵的作用[1]。

GDF9主要在卵泡中表達(dá)[2]，同時(shí)在非性腺組織中也有表達(dá)，能促進(jìn)始基卵泡的發(fā)育，抑制促黃體生成激素(LH)受體的表達(dá)，與FSH協(xié)同刺激卵泡生長，主要調(diào)控卵泡的生長發(fā)育和生殖功能。研究牛早期卵泡發(fā)育時(shí)，發(fā)現(xiàn)較小的卵泡中GDF9的表達(dá)高于稍大的卵泡，所以推測卵泡和顆粒細(xì)胞分泌的GDF9可顯著地促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞的增殖，同時(shí)又防止卵泡膜內(nèi)層過早的分化[3]。D.I.Vage等[4]發(fā)現(xiàn)，挪威白羊GDF9基因中，c.1111G>A SNP表現(xiàn)出比其他任何單個(gè)SNP都有較高的產(chǎn)仔數(shù)，人工授精公羊純合子c.1111A會(huì)產(chǎn)生后代比野生型多0.46～0.57的羔羊數(shù)。研究表明，GDF9刺激胸苷摻入顆粒細(xì)胞從竇前期到排卵前卵泡，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制FSH刺激孕酮和雌二醇生成，同時(shí)也可促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞的分化[5-6]。GDF9的重要靶細(xì)胞是顆粒細(xì)胞，其可刺激顆粒細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)竇前卵泡的發(fā)育，亦能調(diào)節(jié)FSH在顆粒細(xì)胞中的作用[7]。本研究擬通過RNA干涉的方法，制備GDF9 shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠模型，檢測下調(diào)GDF9基因的表達(dá)對動(dòng)物繁殖性能的影響，為進(jìn)一步探討提高大型牲畜的繁殖性能提供有利的素材和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)GDF9基因shRNA的FVB小白鼠，4只F0代公鼠，4周齡，健康無特定病原體(Specefic pathogen free，SPF)，由廣州賽業(yè)生物科技有限公司制備。飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，每天光照12 h，黑暗12 h，溫度21 ℃，同一飼料(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)，自由飲水。其中轉(zhuǎn)基因公鼠與野生型母鼠采取1∶3進(jìn)行擴(kuò)群繁殖；對這4只F0代公鼠、1只F1代母鼠(來自1號F0代公鼠)和2只F2代母鼠和1只F2代公鼠的后代，每只母鼠所產(chǎn)的前兩胎仔鼠數(shù)目進(jìn)行記錄，每周稱重，統(tǒng)計(jì)分析；3周齡時(shí)對仔鼠進(jìn)行PCR檢測，確定陰性或陽性。3～7周齡，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，繪制生長曲線。7周齡時(shí)將上述仔鼠眼球采血，置于高壓滅菌過1.5 mL離心管，4 ℃靜置2～3 h，3 000 r·min-14 ℃離心15 min，分離血清，-20 ℃保存。小鼠采血完后，立即頸椎脫臼處死，迅速取出卵巢、睪丸、下丘腦、垂體、心、肝、脾、肺、腎及肌肉，投入液氮中，然后置于-80 ℃保存，備用。

1.2 G1小鼠鼠尾基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用Primer Premier 5.0 軟件根據(jù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)構(gòu)建的載體設(shè)計(jì)一對引物GFP，檢測轉(zhuǎn)基因是否為陽性，根據(jù)小鼠內(nèi)參基因和目的基因的序列設(shè)計(jì)PCR的引物。由上海生工生物公司合成。所用的引物序列見表1。采用Omega組織DNA提取試劑盒提取。PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，上下游引物GFP (10 μmol·L-1)各加0.5 μL，基因組DNA 2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.2 μL，補(bǔ)加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。分別取5 μL PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查目的基因擴(kuò)增效果。

1.3 GDF9 shRNA cDNA模板的制備及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol法提取組織總RNA，質(zhì)量和濃度檢測后，稀釋成1 μg·μL-1備用。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA(QIAGEN)，universal Tag的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物。針對轉(zhuǎn)入鼠體內(nèi)的GDF9的shRNA設(shè)計(jì)特異性引物：5′-AAGTCAGTCTTGCTATATACT-3′，并由生工合成。Oligo-dT為通用引物，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，上下游引物 (10 μmol·L-1)各0.2 μL，模板cDNA 2 μL，DreamTaq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，補(bǔ)加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃1 min；95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；4 ℃ 保存。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.4 血清中FSH和GH的測定

血清中FSH和GH的測定應(yīng)用ELISA試劑盒(武漢華美公司)，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 G1代轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR陽性檢測

G1代小鼠通過PCR檢測確定陰性或陽性，用于體重分析及分子檢測。在29只小鼠中PCR檢測結(jié)果如圖1，其中陽性小鼠16只，陰性小鼠13只。

表1 引物序列

H.H2O；M.DL 2000 marker；3～8、10～14、16～18、20、29.小鼠檢測為陽性；其他小鼠檢測為陰性H.H2O；M.DL 2000 marker；3-8，10-14，16-18，20，29.Mice are positive；other mice are negative圖1 G1代小鼠的PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR results of electrophoresis for G1 mice

2.2 GDF9-shRNA轉(zhuǎn)基因鼠產(chǎn)子數(shù)及體重的統(tǒng)計(jì)分析

8只親代鼠，對每只前2胎轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖2所示。GDF9-shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)仔數(shù)比野生型小鼠的產(chǎn)仔數(shù)高27.5%，差異顯著(P<0.05)；對小鼠各周的體重?cái)?shù)據(jù)按性別進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。陰性母鼠與陽性母鼠的體重在各周齡均無差異；陰性公鼠在各周齡體重均比陽性公鼠高，且在第7周時(shí)高6.7%，差異顯著(P<0.05)。各組小鼠的生長率也幾近相同。轉(zhuǎn)基因小鼠未出現(xiàn)體重異常。

*.差異顯著 (P<0.05)，下同。n=8*.Significant difference(P<0.05)，The same as below.n=8圖2 轉(zhuǎn)GDF9 shRNA小鼠產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Statistical analysis of litter size of GDF9 shRNA transgenic mice

2.3 GDF9-shRNA在小鼠組織中的RT-PCR檢測

RT-PCR檢測GDF9-shRNA小鼠各組織樣表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。各組織均有83 bp的目的條帶，該片段膠回收產(chǎn)物與pMD18T載體連接、轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，測序正確。表明GDF9 shRNA在體內(nèi)成功表達(dá)，且分布廣泛。

表2 GDF9 shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠體重的統(tǒng)計(jì)分析

H.H2O；M1.DL 2000 marker；M2.DL 50 marker；1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.下丘腦；7.垂體；8.肌肉；9.卵巢；10.睪丸H.H2O；M1.DL 2000 marker；M2.DL 50 marker；1.Heart；2.Liver；3.Spleen；4.Lung；5.Kidney；6.Hypothalamus；7.Pituitary；8.Muscle；9.Ovary；10.Testis圖3 GDF9 shRNA在不同組織中的RT-PCR檢測Fig.3 RT-PCR analysis of GDF9 shRNA expression in different tissues

2.4 GDF9 mRNA在小鼠下丘腦、垂體、卵巢中的表達(dá)水平檢測

卵巢GDF9與FSH的分泌有關(guān)，且GDF9在下丘腦、垂體中也有表達(dá)量。通過RT-PCR檢測這些組織中GDF9的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在下丘腦中的GDF9的表達(dá)量，陽性小鼠與陰性小鼠相比下降35.4%(圖4A)，差異顯著(P<0.05)；在垂體中GDF9的表達(dá)量，陽性小鼠與陰性小鼠相比下降39.8%，差異顯著(P<0.05)(圖4B)；在卵巢中GDF9的表達(dá)量，陽性母鼠比陰性母鼠低，但差異不顯著(P=0.153)(圖4C)。

A.下丘腦，n=11；B.垂體，n=6；C.卵巢，n=6 A.Hypothalamus， n=11；B.Pituitary， n=6；C.Ovary，n=6，respectively圖4 GDF9在不同組織相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of GDF9 in different tissues

2.5 小鼠血液中GH和FSH的水平檢測

利用試劑盒檢測血液中GH和FSH的水平。結(jié)果表明，陽性母鼠比陰性母鼠高45.9%，差異顯著(P<0.05)(圖5A)；陽性公鼠GH水平比陰性公鼠低28.4%，差異不顯著(P>0.05)(圖5B)；陽性母鼠FSH水平比陰性母鼠高55%，差異極顯著(P<0.01)(圖5C)。

**.差異極顯著 (P<0.01)，陽性與陰性樣本數(shù)均為13只(6♂，7♀)**.Extreme significant difference (P<0.01)，positive and negative samples are all 13 (6♂，7♀)，respectively 圖5 血清中GH和FSH水平的檢測Fig.5 Detection of GH and FSH levels in serum

3 討 論

RNA干擾技術(shù)在活體水平應(yīng)用廣泛。 D.A.Rubinson等[8]將表達(dá)siRNA的慢病毒載體通過顯微注射的方法成功地建立了CD8和p53下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠，這兩種轉(zhuǎn)基因小鼠其體內(nèi)相應(yīng)基因的表達(dá)都顯著降低。M.A.Carmell等[9]通過轉(zhuǎn)基因的方法將siRNA整合到基因組中穩(wěn)定表達(dá)，成功地沉默了轉(zhuǎn)基因小鼠中GFP的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室針對GDF9與繁殖性能的相關(guān)性，利用RNA干擾技術(shù)，篩選并構(gòu)建了GDF9基因最佳慢病毒干擾質(zhì)粒，并成功制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型。在此基礎(chǔ)上，本研究通過轉(zhuǎn)基因小鼠的擴(kuò)繁及分析，探討GDF9基因下調(diào)對動(dòng)物生長繁殖的影響。

首先，通過PCR對轉(zhuǎn)GDF9 shRNA的小鼠及子代進(jìn)行檢測。結(jié)果表明GDF9 shRNA成功整合到小鼠基因組，轉(zhuǎn)基因小鼠模型成功建立。RT-PCR結(jié)果也表明在轉(zhuǎn)基因小鼠的各個(gè)組織中均有shRNA表達(dá)。本研究中表達(dá)shRNA的載體為慢病毒干涉載體，表明該載體具有良好的轉(zhuǎn)移外源基因的能力。這與已有報(bào)道結(jié)果一致。慢病毒載體對分裂和非分裂的細(xì)胞均具有高效感染能力，并將外源基因有效地整合到宿主染色體上，進(jìn)而可以持久表達(dá)[8]。B.Dieckhoff等利用慢病毒載體在制備的轉(zhuǎn)基因豬中，也檢測到shRNA在豬的心、肝、脾、肺、腎、肌肉組織中都有表達(dá)[10]。其次，為了檢測shRNA在活體水平上對GDF9的干擾效果，本研究檢測了與FSH分泌相關(guān)的卵巢，GDF9-shRNA水平較高的下丘腦以及垂體中GDF9的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與陰性小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠下丘腦中GDF9的表達(dá)量下降35.4%，差異顯著(P<0.05)；垂體中GDF9的表達(dá)量下降39.8%，差異顯著(P<0.05)；卵巢中GDF9的表達(dá)量稍有下調(diào)，但差異不顯著(P>0.05)。表明shRNA在不同組織表達(dá)量不同，對GDF9的干擾效果也可能不同。由于RNAi技術(shù)只是下調(diào)特定的基因表達(dá)，并不是完全敲除靶基因。M.Semaan等[11]對慢病毒載體介導(dǎo)的PERV shRNA轉(zhuǎn)基因豬的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)，shRNA在不同個(gè)體及同一個(gè)體的不同的組織器官中表達(dá)量也是不同的。A.Nagao等[12]為了提高shRNA對XPA基因的干擾效率，將多個(gè)針對該基因的shRNA串聯(lián)在同一表達(dá)載體，其干擾效果與穩(wěn)定性顯著增加。O.Ter Brake等[13]針對HIV-1的不同區(qū)域構(gòu)建了新的由4個(gè)shRNA串聯(lián)的慢病毒載體，比只有1個(gè)shRNA的慢病毒載體對HIV-1的抑制效應(yīng)強(qiáng)。

研究發(fā)現(xiàn)，GDF9純合缺失的雌性小鼠早期卵泡發(fā)育停止導(dǎo)致不育，但是雄性小鼠無影響[14]。GDF9的FecGH突變(G8突變)同樣能提高雜合綿羊的排卵率[15]。本研究轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖性能結(jié)果顯示，GDF9 shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)仔數(shù)顯著高于陰性小鼠(P<0.5)，而且小鼠出生后并未出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，這與GDF9在卵巢、垂體、下丘腦表達(dá)量下降結(jié)果一致。同時(shí)，在第7周齡陽性公鼠體重顯著低于陰性公鼠(P<0.5)；而陽性母鼠與陰性母鼠體重在各周齡均無顯著差異。目前對GDF9基因研究主要還是在繁殖方面，對后期個(gè)體生長增重方面尚未見相關(guān)報(bào)道。由于GDF9基因在下丘腦、垂體中也表達(dá)，shRNA下調(diào)GDF9基因的表達(dá)可能對動(dòng)物生長軸的調(diào)控造成影響，并具有一定的性別依賴性。針對該現(xiàn)象的原因，在后續(xù)試驗(yàn)中還需要做深入探討。

動(dòng)物生長繁殖是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程，受遺傳、激素、營養(yǎng)、環(huán)境等多因素的影響。本研究通過篩選最優(yōu)干涉效果的GDF9 shRNA序列，在小鼠模型上獲得驗(yàn)證。綜上表明，GDF9基因下調(diào)可以提高動(dòng)物繁殖能力，為今后提高大型動(dòng)物的繁殖性能提供了良好的素材和途徑。

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(編輯 程金華)

The Effect of Transgenic Mice Model Down-regulatedGDF9 on Reproduction and Growth

XI Qian-yun，JIAO Li，XIAO Min，ZHANG Yong-liang*

(CollegeofAnimalScience，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

This experiment aims to detect the effect of down-regulation ofGDF9 on reproduction and growth inGDF9 shRNA transgenic mice through statistical analysis of the litter size and weight gain of transgenic mice and detection of biomolecular and blood biochemical indexes such asGDF9 shRNA，GDF9 and serum FSH and GH level after reproduction.The levels ofGDF9 shRNA andGDF9 mRNA expression were detected in hypothalamus，pituitary and ovary via RT-PCR，and serum FSH and GH level were examined using ELISA.The results showed that 16GDF9 shRNA transgenic mice obtained were positive，andGDF9 shRNA in transgenic mice was widely expressed in various tissues.Litter sizes between transgenic and wild mice were significantly different (P<0.05)；Body weight of transgenic male mice was higher than that of control mice with significant difference (P<0.05) in the seventh week，and body weight of female mice did not show significant difference.Compared with the negative mouse，GDF9 gene expression in transgenic mice in hypothalamus and pituitary were decreased by 35.4% and 39.8% (P<0.05)，respectively.In transgenic female mice，GDF9 expression in ovaries was not significantly decreased (P>0.05)，but its serum FSH level was 55% higher than the control (P<0.01).The present study showed down-regulation expression ofGDF9 gene can improve the ability of animal reproduction.It may provide a favorable material and molecular target for producing transgenic large livestock with high reproduction.

GDF9；RNAi；reproduction；transgenic mice

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.011

2014-11-26

國家科技重大專項(xiàng)(2013ZX08007003-004)；轉(zhuǎn)基因重點(diǎn)專項(xiàng)(2014ZX08009-48B)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013010013215)

習(xí)欠云(1973-)，男，江西樟樹人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物生物化學(xué)與營養(yǎng)研究，E-mail：xqy0228@163.com；Tel：020-85284937

*通信作者：張永亮，教授，博導(dǎo)，主要從事動(dòng)物生物化學(xué)與營養(yǎng)研究，E-mail：zhangyl@scau.edu.cn

S814.8

A

0366-6964(2015)07-1157-06