雞肌肉組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western雜交內(nèi)參基因的篩選

王紅楊，劉冉冉，趙桂蘋，鄭麥青，李慶賀，李 鵬，劉 麗，文 杰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

雞肌肉組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western雜交內(nèi)參基因的篩選

王紅楊，劉冉冉，趙桂蘋，鄭麥青，李慶賀，李 鵬，劉 麗，文 杰*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

本研究對(duì)5種常用“持家基因”作為雞肌肉組織發(fā)育早期基因和蛋白檢測(cè)內(nèi)參基因的有效性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為雞肌肉發(fā)育相關(guān)分子檢測(cè)中內(nèi)參基因的選擇提供科學(xué)依據(jù)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot技術(shù)，分別檢測(cè)了雞12胚齡、17胚齡、1日齡和14日齡胸肌中β肌動(dòng)蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、TATA結(jié)合蛋白(TBP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和熱休克蛋白70(HSP70)的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，在雞發(fā)育早期胸肌組織中，僅HSP70 mRNA和蛋白在各階段間表達(dá)水平差異不顯著，GAPDH、TUBB、TBP和ACTB的mRNA和蛋白表達(dá)水平在檢測(cè)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間均差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。HSP70更適合作為雞肌肉發(fā)育早期基因和蛋白檢測(cè)的內(nèi)參基因。本結(jié)果為研究發(fā)育期雞肌肉組織相關(guān)功能基因和蛋白提供了必要的方法學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)其他物種的相關(guān)研究也有重要借鑒意義。

雞；肌肉組織；早期發(fā)育階段；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；Western雜交；內(nèi)參基因

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western雜交是相對(duì)定量組織或細(xì)胞中特定基因或蛋白表達(dá)水平的常用技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因功能等分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等方面[1-3]。在實(shí)際操作中，RNA或蛋白濃度測(cè)定、加樣、反轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)膜效率等都有可能導(dǎo)致RT-qPCR和Western雜交上樣量的差異，這就需要用內(nèi)參基因?qū)ι蠘恿窟M(jìn)行校正[4-7]。理想的內(nèi)參基因或蛋白是表達(dá)水平維持恒定或不受試驗(yàn)條件和機(jī)體發(fā)育變化影響的一類基因或蛋白，通常為持家基因或其所表達(dá)的蛋白。β肌動(dòng)蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、TATA結(jié)合蛋白(TBP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、核纖層蛋白B1(LMNB1)、組蛋白H3(H3)、ATP合成酶亞基(ATP1A)等持家基因因其在各種組織、細(xì)胞中均表達(dá)且表達(dá)水平相對(duì)恒定而常作為內(nèi)參基因。然而，部分持家基因的mRNA或蛋白表達(dá)水平可能會(huì)隨著機(jī)體發(fā)育變化而產(chǎn)生差異。M.Bionaz等[8]發(fā)現(xiàn)，不同泌乳階段奶牛乳房中ACTB和GAPDH的mRNA表達(dá)水平差異較大；S.Mamo等[9]發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外培養(yǎng)不同發(fā)育階段小鼠胚胎中ACTB的mRNA表達(dá)水平差異較大；M.Rocha-Martins等[10]發(fā)現(xiàn)，ACTB蛋白表達(dá)水平隨著大鼠視網(wǎng)膜的發(fā)育明顯下降。因此，特定試驗(yàn)條件下，內(nèi)參基因的選擇就成為試驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，有關(guān)雞肌肉組織不同發(fā)育時(shí)期基因及蛋白檢測(cè)內(nèi)參基因的研究尚未見報(bào)道，制約了肌肉發(fā)育分子機(jī)制等相關(guān)研究的開展。

本研究通過對(duì)北京油雞胚胎期至生長(zhǎng)早期胸肌4個(gè)時(shí)間點(diǎn)、5個(gè)持家基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較研究，旨在篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，為今后肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、肉質(zhì)性狀和疾病性狀相關(guān)功能基因及蛋白的挖掘和功能驗(yàn)證提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中的北京油雞種蛋和雛雞來自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗(yàn)基地。在12胚齡(Ed 12)、17胚齡(Ed 17)、1日齡(1 d)、14日齡(14 d)分別隨機(jī)選擇3只，取其雙側(cè)胸肌組織。所采集樣本迅速放入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取

利用總RNA提取試劑盒(天根，北京)提取各日齡胸肌組織總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性，并經(jīng)核酸定量?jī)xNanoDrop2000(Thermo scientific，美國(guó))測(cè)定濃度及根據(jù)A260 nm/A280 nm值確定RNA純度。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0軟件，分別設(shè)計(jì)ACTB、TUBB、TBP、GAPDH和HSP70等5個(gè)候選內(nèi)參基因的定量PCR引物，并由華大基因科技有限公司合成。引物信息如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所用5個(gè)候選內(nèi)參基因的引物信息

1.4 cDNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

cDNA反轉(zhuǎn)錄參照PrimerScriptTM RT Master Mix(Perfect Real time)試劑盒(TaKaRa，美國(guó))操作說明進(jìn)行，-20 ℃保存?zhèn)溆谩T-qPCR參照KAPA SYBR?FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal(KAPA，美國(guó))試劑盒說明書進(jìn)行。每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.5 總蛋白提取和濃度測(cè)定

取100 mg左右胸肌組織，加入20倍體積的RIPA裂解液(碧云天，上海)，用干凈剪刀將組織剪碎，然后置于2 mL玻璃勻漿器中進(jìn)行勻漿，勻漿后冰上靜置30 min，不時(shí)搖晃。4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液。所得樣品總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo scientific，美國(guó))測(cè)定蛋白濃度，并用1×PBS緩沖液將蛋白濃度均一化為2 μg·μL-1，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(康為世紀(jì)，北京)制備分離膠濃度為12%、濃縮膠濃度為5%、厚度為1.5 mm的配制膠。將蛋白樣品與5×還原型SDS-PAGE上樣緩沖液(康為世紀(jì)，北京)以4∶1進(jìn)行混合，95 ℃金屬浴10 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液并分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μL即32 μg總蛋白上樣，樣品依次為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Thermo scientific，美國(guó))，Ed 12、Ed 17、1 d和14 d胸肌總蛋白樣品。初始電壓80 V，約30 min后樣品壓成一條細(xì)線，提高電壓至120 V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)泳出分離膠下緣。

1.7 轉(zhuǎn)膜和封閉

將大小適中的PVDF膜(0.22 μm，Millipore，美國(guó))無水甲醇浸泡5 min；膠純水浸泡5 min，然后將PVDF膜、膠、濾紙、夾子和海綿(Bio-Rad，美國(guó))在轉(zhuǎn)膜液中浸泡10 min。按照黑板→海綿→濾紙→膠→膜→濾紙→海綿→白板的順序制作“三明治”，確保每層之間沒有氣體。200 mA轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜后采用5%脫脂奶粉(BD，美國(guó))室溫?fù)u床封閉1 h。TBST洗膜2次，TBS洗膜1次，每次5 min。

1.8 抗體孵育和顯影

ACTB(abcam，ab8227，英國(guó)，1∶3 000)、TUBB(abcam，ab6046，英國(guó)，1∶500)、TBP(Millipore，MAB3658，美國(guó)，1∶3 000)、GAPDH(abcam，ab22555，英國(guó)，1∶10 000)、HSP70(abcam，ab69412，英國(guó)，1∶2 000)4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜4次，TBS洗膜2次，每次5 min。羊抗兔二抗-HRP(康為世紀(jì)，北京)或羊抗鼠二抗-HRP(碧云天，上海)室溫?fù)u床孵育1 h。TBST洗膜4次，TBS洗膜2次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(Millipore，美國(guó))孵育2 min，于ImageQuant LAS 4000 mini儀器(GE，美國(guó))自動(dòng)曝光，采集Western雜交圖像。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)公式Q=E△Ct計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量Q。其中E為基因擴(kuò)增效率(一般情況下將基因擴(kuò)增視為理想擴(kuò)增，擴(kuò)增效率E默認(rèn)為2)，△Ct=Ctmin-Ct樣品(Ctmin為每個(gè)基因不同樣品中最小Ct值，Ct樣品為每個(gè)樣品的Ct值)[11-12]。應(yīng)用BestKeeper軟件分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度[13]。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析Western雜交條帶累積光密度值(IOD)，利用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 RNA樣品和總蛋白質(zhì)量檢測(cè)

總RNA瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，RNA樣品均有完整帶型的5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。核酸定量?jī)x檢測(cè)時(shí)A260 nm/A280 nm在2.0左右，A260 nm/A230 nm在2.0～2.4，總RNA提取質(zhì)量和純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Total RNA agarose gel electrophoresis

總蛋白SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖2所示。各泳道蛋白條帶清晰，無高豐度蛋白和雜質(zhì)，同一時(shí)間點(diǎn)樣本生物學(xué)重復(fù)性較好，但在同一分子量位置蛋白沉積量明顯不同，說明4個(gè)時(shí)間點(diǎn)因發(fā)育變化而蛋白表達(dá)模式可能存在較大差異。

圖2 總蛋白考馬斯亮藍(lán)染色膠圖Fig.2 Total protein Coomassie blue-stained gel

2.2 候選內(nèi)參基因的引物檢測(cè)

以胸肌cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示，各內(nèi)參基因擴(kuò)增片段大小與引物設(shè)計(jì)預(yù)期片段大小一致，無雜帶，引物特異性較好。

1.ACTB；2.TBP；3.HSP70；4.GAPDH；5.TUBB；M.DL2000 DNA marker圖3 胸肌候選內(nèi)參基因RT-qPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of RT-qPCR products of candidate reference genes in breast muscle

2.3 候選內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)水平及表達(dá)穩(wěn)定度評(píng)價(jià)

以Ed 12胸肌mRNA表達(dá)水平為參照，候選內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)水平如表2所示。在發(fā)育早期不同日齡胸肌組織中，ACTB、TBP、TUBB和GAPDH的mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異極顯著(P<0.01)，僅HSP70的mRNA相對(duì)表達(dá)水平在各日齡間差異不顯著(P>0.05)。

BestKeeper軟件根據(jù)各樣品候選內(nèi)參基因Ct值對(duì)樣品進(jìn)行配對(duì)相關(guān)分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、變異系數(shù)(CV)及各基因間的泊松相關(guān)系數(shù)。根據(jù)SD評(píng)估內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度，SD越小，基因表達(dá)穩(wěn)定度越高，反之，穩(wěn)定度越低。發(fā)育早期雞胸肌組織5個(gè)候選內(nèi)參基因中，ACTB、TBP、TUBB的SD較大，并高于HSP70和GAPDH(圖4)。從基因相對(duì)表達(dá)水平和表達(dá)穩(wěn)定度兩方面考慮，HSP70更適合作為發(fā)育早期雞胸肌組織的內(nèi)參基因。

表2 發(fā)育早期胸肌候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)水平

圖4 發(fā)育早期胸肌候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定度(BestKeeper)Fig.4 Stability of candidate reference genes in the early developmental stages of breast muscle by BestKeeper

2.4 Western blot結(jié)果

在預(yù)測(cè)分子量42 ku(ACTB)、33 ku(TBP)、50 ku(TUBB)、36 ku(GAPDH)和69 ku(HSP70)處分別檢測(cè)到5種蛋白的Western雜交圖像，如圖5(A、C、E、G、I)所示。以Ed 12 IOD為對(duì)照，構(gòu)建柱狀圖(圖5B、D、F、H、J)。胸肌中ACTB、TBP和TUBB蛋白表達(dá)水平隨機(jī)體發(fā)育顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；GAPDH蛋白表達(dá)水平隨機(jī)體發(fā)育逐漸升高，且在14 d的表達(dá)極顯著高于1 d(P<0.01)；僅HSP70蛋白表達(dá)水平隨機(jī)體發(fā)育未呈現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)。

A、C、E、G和I分別為ACTB、TUBB、TBP、GAPDH和HSP70的Western blot結(jié)果；B、D、F、H和J分別為相應(yīng)IOD分析結(jié)果。**.P<0.01；*.P<0.05Western blot results for ACTB (A)，TUBB (C)，TBP (E)，GAPDH (G) and HSP70 (I)；IOD analysis for ACTB (B)，TUBB (D)，TBP (F)，GAPDH (H) and HSP70 (J).** .P<0.01；*.P<0.05圖5 Western blot及IOD分析結(jié)果Fig.5 Results of Western blot and IOD analysis

3 討 論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)是定量基因或蛋白表達(dá)水平的常用檢測(cè)技術(shù)[14-15]。對(duì)于Western blot而言，雖然麗春紅染色、Sypro Ruby染色、考馬斯亮藍(lán)染色等總蛋白染色法為校正蛋白上樣量提供了一些選擇，但是這些方法存在著效果差、耗時(shí)間、靈敏度低和背景高等缺陷[16-18]。因此，選擇合適的內(nèi)參基因或蛋白對(duì)上樣量進(jìn)行校正是不可或缺的。

本研究表明，HSP70和GAPDH基因表達(dá)穩(wěn)定度較高，ACTB等其他3個(gè)基因表達(dá)穩(wěn)定度較差；ACTB、TUBB、TBP和GAPDH在雞不同日齡胸肌組織中mRNA和蛋白表達(dá)水平均存在顯著性變化，HSP70 mRNA和蛋白表達(dá)水平則無顯著性變化。可能的原因是，對(duì)于哺乳動(dòng)物及家禽骨骼肌發(fā)育而言，胚胎期是肌肉細(xì)胞數(shù)量增加(Hyperplasia)的時(shí)期，至出生(出雛)時(shí)肌纖維數(shù)量已經(jīng)固定；生長(zhǎng)早期則主要是肌肉細(xì)胞肥大(Hypertrophy)，即體積增大的時(shí)期[19]。此外，隨著胸肌的發(fā)育，肌纖維直徑增加，密度減小，IIB型快速酵解纖維比例升高，肌肉的酵解性增強(qiáng)，最終胸肌完全由IIB型快速酵解纖維組成[20-21]，這也可能與ACTB、TUBB、TBP和GAPDH等肌纖維發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)不穩(wěn)定和蛋白表達(dá)水平存在發(fā)育性變化相關(guān)。

HSP70在所有細(xì)胞內(nèi)均能表達(dá)，環(huán)境中存在高溫、缺氧、饑餓等應(yīng)激原的情況下，HSP基因即被激活，高效表達(dá)[22]。S.Greer等[2]研究發(fā)現(xiàn)，HSP90在不同細(xì)胞培養(yǎng)密度情況下可以作為內(nèi)參蛋白。雞是恒溫動(dòng)物，本研究雞從胚胎發(fā)育、出雛到14日齡的過程中，并未受到冷熱應(yīng)激。雖然HSP70在14日齡胸肌組織中的蛋白分子量大小與其他時(shí)間點(diǎn)稍有不同，這可能是蛋白翻譯后修飾原因造成的，但是其蛋白表達(dá)水平與其他時(shí)間點(diǎn)差異不顯著，相比較其他常規(guī)內(nèi)參蛋白而言，是用于雞發(fā)育早期肌肉組織目標(biāo)蛋白Western blot檢測(cè)相對(duì)理想的內(nèi)參基因。

4 結(jié) 論

本研究從mRNA和蛋白水平證實(shí)HSP70更適合作為發(fā)育早期雞胸肌組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western雜交的內(nèi)參基因。

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(編輯 郭云雁)

Identification of Reference Genes by Real-Time Quantitative PCR and Western Blot in Chicken Muscle Tissues

WANG Hong-yang，LIU Ran-ran，ZHAO Gui-ping，ZHENG Mai-qing，LI Qing-he，LI Peng，LIU Li，WEN Jie*

(StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

This research evaluated the availability of 5 “housekeeping genes”as reference genes for gene expression detection in different early developmental stages of muscle tissues in chicken，which would provide scientific evidences for selecting reference genes in the molecules detection related to muscle development of chicken.Real-Time quantitative PCR (RT-qPCR) and Western blot were used to test the mRNA and protein levels of β-actin (ACTB)，β-tubulin (TUBB)，TATA-binding-protein (TBP)，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and Heat shock 70 kDa protein (HSP70) in breast muscle of chicken at embryonic day 12 and 17，day 1 and day 14 post-hatch，respectively.The results showed that，only mRNA and protein levels of HSP70 didn’t significantly change in the early developmental stages of breast muscle in chicken，while that of other genes significantly altered (P<0.05 orP<0.01).HSP70 was more suitably used as reference gene for gene or protein expression detection in the early developmental stages of muscle tissues in chicken.This study provides methodological basis for functional genes and proteins studies of muscle development in chicken.It also could play a referential role in other species.

chicken；muscle tissues；early developmental stages；Real-Time quantitative PCR；Western blot；reference gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.005

2014-10-10

國(guó)家自然基金青年基金項(xiàng)目(31201797)；國(guó)家“863”項(xiàng)目(2011AA100301)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS04)

王紅楊(1991-)，女，河南人，碩士，主要從事單胃動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究，E-mail：wanghy0112@163.com

*通信作者：文 杰，E-mail：wenjie@caas.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)07-1107-07