豬IRS4基因多態(tài)性、表達(dá)差異及其與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

馬煥班，劉先先，楊 杰，黃衛(wèi)兵，段艷宇，郭源梅，麻駿武

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

豬IRS4基因多態(tài)性、表達(dá)差異及其與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

馬煥班，劉先先，楊 杰，黃衛(wèi)兵，段艷宇，郭源梅*，麻駿武*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

本研究旨在檢測(cè)豬IRS4基因多態(tài)性及其在17種組織中的表達(dá)水平，尋找基因內(nèi)與脂肪沉積性狀QTL效應(yīng)相關(guān)的分子標(biāo)記。本研究采用比較測(cè)序方法搜尋到IRS4基因的3個(gè)SNPs，分別是在啟動(dòng)子上的g.96C>G，外顯子上的同義突變g.1829T>C和錯(cuò)義突變g.1794T>C(p.Phe432Leu)。RT-PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，IRS4基因在垂體、下丘腦中高度表達(dá)，在其他組織中弱表達(dá)或不表達(dá)。在白色杜洛克×二花臉F2資源家系、蘇太豬群體、二花臉群體、杜長(zhǎng)大三元雜商品豬及中國(guó)地方野豬中，用PCR-RFLP方法對(duì)IRS4的3個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行判型，然后分析它們的基因頻率及其與4點(diǎn)(肩、胸、腰、臀部)背膘厚、腹脂重、肌內(nèi)脂肪含量和眼肌面積的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，g.96C>G位點(diǎn)在F2家系(含有SSCX QTL)中分離程度很低，被首先排除作為潛在因果突變(QTN)的可能性。g.1794T>C和g.1829T>C位點(diǎn)在所有檢測(cè)的西方豬種(白色杜洛克和杜長(zhǎng)大)是均為TT基因型，而它們的CC基因型頻率在二花臉豬中分別為65%和100%。在不同群體中標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，g.1794T>C與F2個(gè)體所有脂肪沉積表型均極顯著相關(guān)(P<0.01)，但它在蘇太豬中僅與IMF顯著相關(guān)(P<0.05)，且與二花臉豬表型關(guān)聯(lián)不顯著(P>0.05)；g.1829T>C則不僅與F2個(gè)體所有脂肪沉積表型均極顯著相關(guān)(P<0.01)，而且與蘇太豬的4點(diǎn)膘厚和眼肌面積呈顯著或極顯著相關(guān)。此外，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，g.1794T>C錯(cuò)義突變可能對(duì)IRS4蛋白的功能影響不大。結(jié)果提示，該錯(cuò)義突變也不太可能是影響脂肪沉積的QTN，而g.1829T>C與F2和蘇太豬的脂肪沉積性狀都顯著關(guān)聯(lián)，故其可作為這些性狀選育的分子標(biāo)記，并值得深入研究。

豬；IRS4基因；QTL；多態(tài)性；表達(dá)差異；脂肪沉積性狀

脂肪沉積性狀是豬生產(chǎn)及育種中最為重要的經(jīng)濟(jì)性狀指標(biāo)之一。豬皮下脂肪的含量，如背膘厚度和腹脂重，主要決定胴體品質(zhì)；而肌內(nèi)脂肪含量(IMF)主要影響豬肉的嫩度、多汁性及加工后的風(fēng)味等肉質(zhì)特征。

國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究小組利用不同西方豬種和中國(guó)地方品種梅山豬為祖代雜交構(gòu)建的資源家系，先后在豬X號(hào)染色體近著絲粒區(qū)域上定位到了與豬脂肪沉積、生長(zhǎng)和胴體組成等性狀相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)。D.Milan等[1]利用所構(gòu)建的大白和梅山豬資源家系，在X染色體上標(biāo)記SW1994附近檢測(cè)到了顯著影響眼肌重和背膘重的QTL區(qū)域，該QTL效應(yīng)分別可以解釋36%(眼肌重)和41%(背膘重)的表型變異。H.Ai等[2]利用白色杜洛克(白杜)×二花臉資源家系F2群體，也在SW1994周邊定位到了與脂肪沉積性狀相關(guān)的QTL。J.Ma等[3]曾發(fā)現(xiàn)該QTL區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)較大的重組冷點(diǎn)區(qū)(約34 Mb)，這使得利用傳統(tǒng)的精細(xì)定位方法很難進(jìn)一步縮小QTL的置信區(qū)間。M.Perez-Enciso等[4]對(duì)來(lái)自6個(gè)品種(野豬、梅山、大白、長(zhǎng)白、伊比利亞、皮特蘭)和5個(gè)雜交系約3 000頭個(gè)體的合并分析，發(fā)現(xiàn)有利于脂肪沉積的基因起源于亞洲豬種，區(qū)間界定在SW1994～SW1943區(qū)域。S.Cepica等[5-7]對(duì)利用以野豬和梅山為基礎(chǔ)的資源家系通過(guò)增加標(biāo)記密度同樣將該QTL精細(xì)定位于SW1994～SW1943，且QTL最高峰位于IRS4和ACSL4基因周邊。本研究組與法國(guó)Milan組合作通過(guò)合并分析白杜×二花臉資源家系F2群體和法國(guó)INRA大白×梅山資源家系群體背膘厚QTL的置信區(qū)間縮小至6～7 cM，區(qū)域內(nèi)包含ACSL4、SERPINA7(TBG)、IRS4等幾個(gè)重要的位置候選基因[8]。

IRS4基因編碼胰島素受體底物-4，并在下丘腦組織中高度表達(dá)[9]。有研究表明，胰島素受體底物-4會(huì)耦合到瘦素受體上，而瘦素和胰島素都能夠通過(guò)作用于下丘腦神經(jīng)元調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的能量消耗和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，從而參與控制食物攝入，長(zhǎng)期控制肥胖，促性腺激素的分泌以及繁殖性能的調(diào)控[10-11]。因此，IRS4基因的多態(tài)性可能引起脂肪沉積表型變異，是SSCX QTL區(qū)域內(nèi)值得研究的候選基因。

S.Cepica等[5-7]利用比較測(cè)序方法，在IRS4基因啟動(dòng)子區(qū)和外顯子區(qū)分別搜尋到g.96C>G和g.1829T>C(GenBank：FN424076.1)兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(SNPs)；并在梅山×大白資源家系F2群體中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNPs與背膘均存在極顯著關(guān)聯(lián)性，且1829T>C與眼肌深度存在顯著關(guān)聯(lián)性[12]。J.Ma等[8]在對(duì)脂肪沉積候選基因的研究中，檢測(cè)了這兩個(gè)位點(diǎn)在法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院(INRA)所構(gòu)建的大白×梅山家系F0和F1代個(gè)體中的基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，g.96C>G位點(diǎn)等位基因G僅來(lái)源于梅山豬，但其在祖代梅山豬的頻率很低(≤0.08)，而g.1829T>C位點(diǎn)在所檢測(cè)的梅山豬和大白豬分別只攜帶等位基因C和T。

豬IRS4基因與人IRS4基因(NM_003604)具有高度同源性，其編碼序列與人IRS4基因編碼序列相似度為87%，基因所編碼的含1 269個(gè)氨基酸的蛋白序列(CAZ66650.1)與人IRS4基因編碼的含1 257個(gè)氨基酸蛋白序列(AAC51738.1)具有92%的高度同源性。因此，分析候選基因IRS4與目標(biāo)QTL之間的關(guān)系，有助于揭示豬脂肪沉積性狀的分子遺傳機(jī)理，并為人類肥胖病遺傳研究提供一定的借鑒。

本研究以豬IRS4基因作為SSCX QTL位置候選基因，先通過(guò)比較測(cè)序，對(duì)豬IRS4外顯子區(qū)域進(jìn)行SNPs篩查，再在白杜×二花臉F2群體、蘇太豬(杜洛克和二花臉雜交18代以上的培育品種)及二花臉豬群體中分析該基因SNPs與豬脂肪沉積性狀的相關(guān)性，以期鑒別與豬脂肪沉積性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，為今后豬育種的標(biāo)記輔助選擇提供確切的遺傳學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物包括1個(gè)本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的白杜×二花臉資源家系F2群體、1個(gè)蘇太豬群體(522頭)和1個(gè)純種二花臉豬群體(336頭)。其中，F(xiàn)2資源家系群體是以2頭白杜公豬和17頭二花臉母豬雜交，產(chǎn)生9頭F1公豬和59頭F1母豬，再由這些F1代個(gè)體隨機(jī)交配(避免全同胞交配)產(chǎn)生1 912個(gè)F2個(gè)體而成的。蘇太豬群體和二花臉豬群體分別分批購(gòu)自于蘇州市蘇太豬育種中心和江蘇省常州市焦溪二花臉豬專業(yè)合作社，購(gòu)買時(shí)仔豬均在2～3月齡左右，之后被運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室租賃的豬場(chǎng)(位于江西省南昌市郊區(qū))，并配以相同的飼養(yǎng)模式進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。試驗(yàn)動(dòng)物在達(dá)到所要求的日齡后，均按生豬標(biāo)準(zhǔn)化屠宰程序進(jìn)行屠宰，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)表型的測(cè)定。

此外，本研究中還檢測(cè)了50頭杜長(zhǎng)大三元雜商品豬和15頭中國(guó)野豬個(gè)體的基因型，所檢測(cè)個(gè)體的DNA樣本均來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室基因庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 表型測(cè)定與DNA樣本制備 表型測(cè)定則由專人負(fù)責(zé)以減少系統(tǒng)誤差，詳細(xì)測(cè)定過(guò)程見(jiàn)參考文獻(xiàn)[13]。本研究所測(cè)定的肉質(zhì)性狀包括：4點(diǎn)背膘厚(Backfat depth)、肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)含量、眼肌面積(Loin eye area，LEA)、腹脂重(Abdomental weight)和后腿重(Ham weight)。用游標(biāo)卡尺測(cè)定240日齡屠宰個(gè)體右邊胴體4點(diǎn)背膘厚(肩部為頸椎與胸椎結(jié)合處，胸部為第6～7胸椎處，腰部為最后肋骨處，臀部為腰薦結(jié)合部)。肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定使用索氏脂肪抽提法進(jìn)行測(cè)定。眼肌面積的測(cè)量采用硫酸方格紙描繪、Leica軟件進(jìn)行計(jì)算的方法。腹脂重、后腿重采用電子天平進(jìn)行稱量。

屠宰個(gè)體樣本采集同樣按采樣規(guī)范操作，用耳號(hào)鉗夾取30～40 mg的耳組織樣本，裝在含1 mL 75%酒精的Eppendorf 離心管內(nèi)，-20 ℃保存。

采用苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法從耳組織中提取全基因組DNA，Nanodrop-1000用于檢測(cè)DNA樣本質(zhì)量。本試驗(yàn)中按20 ng·μL-1的濃度標(biāo)準(zhǔn)在96孔板中制成DNA模板備用。

1.2.2 SNPs的搜尋 參考NCBI所提供的豬IRS4基因序列(GenBank：FN424076.1)設(shè)計(jì)4對(duì)測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，擴(kuò)增片段覆蓋IRS4基因約3 300 bp的序列，引物的設(shè)計(jì)采用Premier5.0軟件，引物均由上海生工合成，引物序列、退火溫度等詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

選取2頭杜洛克和4頭二花臉個(gè)體的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用改良型的降落PCR(Touch down PCR)擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL：40 ng基因組DNA、0.2 mmol·L-1dNTPs、0.2 μmol·L-1的引物、1.5 mmol·L-1Mg2+，1×PCR緩沖液和2UTaqDNA聚合酶(TaKaRa)。降落PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)入PCR擴(kuò)增程序，94 ℃變性30 s，68～54 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，每降1 ℃循環(huán)2次，共28個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，19次循環(huán)；72 ℃延伸1 min，最后降至4 ℃。所得到的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAStar軟件包的Seqman程序進(jìn)行分析，通過(guò)序列比對(duì)鑒定該片段上存在的多態(tài)位點(diǎn)。

1.2.3 SNPs的基因型檢測(cè) 使用PCR-RFLP方法檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)基因型，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，在IRS4基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)附近區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，引物信息如表2所示。PCR反應(yīng)體系25 μL：40 ng基因組DNA、0.2 mmol·L-1dNTPs、0.2 μmol·L-1的引物、1.5 mmol·L-1Mg2+，1×PCR緩沖液和2 UTaqDNA聚合酶。PCR程序設(shè)計(jì)同樣為降落PCR：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，68～54 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，每降1 ℃循環(huán)2次；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，19次循環(huán)；72 ℃延伸1 min，最后降至4 ℃。

擴(kuò)增產(chǎn)物用于酶切基因判型。15 μL的酶切反應(yīng)體系中包含PCR產(chǎn)物5 μL，限制性內(nèi)切酶2 U，10×緩沖液1.5 μL和去離子水8.3 μL，37或65℃溫育6 h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)4.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，從而判斷這3個(gè)位點(diǎn)的基因型。PCR-RFLP中所使用的限制性內(nèi)切酶、溫育溫度和基因型片段大小如表2所示。

表1 SNP搜尋引物序列及相關(guān)信息

表2 PCR-RFLP方法判定IRS4基因SNPs基因型

1.2.4 組織表達(dá)分析 利用半定量RT-PCR(Semi-Quantitative RT-PCR)分析不同組織中IRS4基因表達(dá)情況，基因組織表達(dá)的17種組織：腎上腺、腎、肺、垂體、卵巢、板油、前列腺、睪丸、心、胸腺、附睪、小腸、胃、甘油、下丘腦、甲狀腺、膀胱。所設(shè)計(jì)的引物序列如表3所示，采用GAPDH看家基因作為反應(yīng)內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)IRS4基因在不同基因型母豬下丘腦組織表達(dá)差異情況，所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增區(qū)域包含外顯子的兩個(gè)突變位點(diǎn)，引物信息如表3所示。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用SAS軟件的MIXED過(guò)程確定分析模型中分別需要考慮的固定效應(yīng)和協(xié)變量，結(jié)果將性別和批次作為固定效應(yīng)，而將胴體重作為協(xié)變量，用基因型親緣系數(shù)剔除多基因效應(yīng)。對(duì)不同群體SNP多態(tài)性基因型及單倍型與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析模型為加性效應(yīng)模型，模型：

y=μ+sex+batch+Cw+gkin+snp/hapo+e

表3 RT-PCR引物信息

其中，y表示表型值，μ為群體平均值，sex和batch分別表示性別和批次，為固定效應(yīng)，C胴體重回歸系數(shù)，w為胴體重協(xié)變量，gkin表示基于基因型的個(gè)體間親緣關(guān)系，snp/hapo為候選基因SNP效應(yīng)或SNP所構(gòu)建的單倍型效應(yīng)，e表示殘差。基因位點(diǎn)與表型之間的關(guān)聯(lián)性是基于模型進(jìn)行判別，如果關(guān)聯(lián)性P值達(dá)到或超過(guò)顯著水平的臨界值，說(shuō)明該位點(diǎn)為顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 SNPs搜尋

通過(guò)序列比對(duì)，搜尋到了3個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中兩個(gè)位點(diǎn)(啟動(dòng)子上的g.96C>G位點(diǎn)和一個(gè)同義突變位點(diǎn)g.1829T>C)與此前報(bào)道相一致；第3個(gè)位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)，它位于同義突變位點(diǎn)g.1829T>C的5′端上游35 bp處，是一個(gè)錯(cuò)義突變g.1794T>C(p.Phe432Leu)，該位點(diǎn)突變導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸由苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼帷?/p>

2.2 多態(tài)位點(diǎn)的判型與基因型分布頻率

使用PCR-RFLP方法判定IRS4基因3個(gè)SNPs的基因型。使用限制性核酸內(nèi)切酶Fnu4HI、AluI和BsmFI分別對(duì)g.96C>G、g.1794T>C和g.1829T>C這3個(gè)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，各位點(diǎn)基因型判定結(jié)果見(jiàn)圖1。

A.限制性內(nèi)切酶Fnu4HI對(duì)g.96C>G分型結(jié)果：7、8.CC；1、3、6.GG；2、4、5.CG。B.AluI對(duì)g.1794T>C分型結(jié)果：2、3.CC；1、6、7、8.TT；4、5.CT。C.BsmFI對(duì)g.1829T>C分型結(jié)果：1、3、4.CC；5、8.TT；2、6、7.CT。M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A.Genotyping results for g.96C>G were obtained by Fnu4HIrestriction enzyme digestion：CC.7，8；GG.1，3，6；GG.2，4，5.B.Genotyping results for g.1794T>C were obtained by AluIrestriction enzyme digestion：CC.2，3；TT.1，6，7，8；CT.2，6，7.C.Genotyping results for g.1829T>C were obtained by BsmFIrestriction enzyme digestion：CC.1，3，4；TT.5，8；CT.2，6，7.M.50 bp ladder DNA marker圖1 IRS4基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)酶切分型結(jié)果Fig.1 The RCR-RFLP-based genotyping results for the 3 IRS4 SNPs

基于上述標(biāo)準(zhǔn)，分別在各研究群體中對(duì)這3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行判型，各群體中多態(tài)位點(diǎn)的等位基因型頻率統(tǒng)計(jì)信息見(jiàn)表4。其中，g.96C>G位點(diǎn)在資源家系F0代個(gè)體中分離程度較低，僅有2頭二花臉母豬為CG型，另外2頭白杜公豬和15頭二花臉母豬均為CC型，所檢測(cè)的15頭野豬個(gè)體也全為CC型。g.1794T>C位點(diǎn)等位基因C在資源家系F0代中僅來(lái)源于二花臉母豬，2頭白杜公豬和另外檢測(cè)的50頭杜長(zhǎng)大三元雜商品肉豬全為TT型。g.1829T>C位點(diǎn)在所有檢測(cè)的純種二花臉豬中都為CC型；而在F0代白杜和杜長(zhǎng)大三元雜商品豬中都為TT型，野豬群體中沒(méi)有檢測(cè)出TT基因型。

表4 3個(gè)SNP位點(diǎn)在不同群體中的基因型分布頻率

2.3IRS4在17種不同組織中表達(dá)差異性分析

試驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，在豬的17種不同組織cDNA樣品中，IRS4基因在垂體、下丘腦高度表達(dá)，在卵巢、板油、睪丸、甲狀腺中弱表達(dá)，在其它組織中微弱或不表達(dá)。

1.腎上腺；2.腎；3.肺；4.垂體；5.卵巢；6.板油；7.前列腺；8.睪丸；9.心；10.胸腺；11.附睪；12.小腸；13.胃；14.肝；15.下丘腦；16.甲狀腺；17.膀胱；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.Adrenal；2.Kidney；3.Lung；4.Pituitary；5.Ovary；6.White adipose tissue；7.Prostate；8.Testis；9.Heart；10.Thymus；11.Epididymis；12.Small intestine；13.Stomach；14.Liver；15.Hypothalamus；16.Thyroid；17.Bladder；M.50 bp ladder DNA marker圖2 IRS4基因在豬17種組織中的表達(dá)差異Fig.2 The expression pattern of IRS4 gene in 17 porcine tissues

根據(jù)錯(cuò)義突變位點(diǎn)g.1794T>C的分型結(jié)果，選取CC和CT基因型F2母豬各6頭(無(wú)TT型母豬樣品)，分析IRS4基因在下丘腦組織中的表達(dá)差異情況。結(jié)果顯示(圖3)，CC基因型個(gè)體IRS4平均表達(dá)量高于CT型，分別為(2.07±4.45)和(0.95±0.43)，但兩者差異不顯著(P=0.15)。這可能是由于檢測(cè)個(gè)體數(shù)偏少，且同種基因型個(gè)體基因表達(dá)差異也較大的緣故。

2.4 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

由于g.96C>G位點(diǎn)在資源家系F0代個(gè)體中分離程度較低，白杜和二花臉的主等位基因都為G，這與SSCX上脂肪沉積性狀QTL等位基因在兩個(gè)祖代品種各自趨近純合估計(jì)不符，因此排除了該位點(diǎn)作為影響豬脂肪沉積因果突變位點(diǎn)(QTN)的可能性。在后續(xù)的分析中，集中探討了g.1794T>C和g.1829T>C與脂肪沉積性狀的相關(guān)性。

圖3 比較g.1794T>C位點(diǎn)CC和CT基因型個(gè)體的下丘腦組織中IRS4基因的表達(dá)差異Fig.3 The difference in expression level of IRS4 gene in porcine pituitary tissue between pigs with CC and CT genotypes for g.1794T>C

2.4.1 多態(tài)位點(diǎn)g.1794T>C和g.1829T>C與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析 在資源家系F2群體、蘇太豬群體和純種二花臉豬群體中，分析了IRS4基因多態(tài)位點(diǎn)g.1794T>C和g.1829T>C與脂肪沉積性狀的相關(guān)性(表5)，結(jié)果表明，錯(cuò)義突變g.1794T>C與F2群體所有脂肪沉積性狀均極顯著相關(guān)(P<0.01)，僅與蘇太豬群體IMF顯著相關(guān)(P<0.05)，但與二花臉豬群體所有脂肪沉積性狀相關(guān)性均不顯著；g.1829T>C與F2群體所有脂肪沉積性狀均極顯著相關(guān)(P<0.01)，且與蘇太豬群體4點(diǎn)膘厚、眼肌面積和后腿重顯著或極顯著相關(guān)。因g.1829T>C在純種二花臉中不分離，所以無(wú)法在二花臉豬中檢測(cè)該位點(diǎn)的效應(yīng)。

2.4.2 F2與蘇太群體中IRS4單倍型關(guān)聯(lián)分析 根據(jù)g.1794T>C和g.1829T>C在資源家系F0代中的基因型判定結(jié)果，推出兩個(gè)位點(diǎn)的相互強(qiáng)連鎖(r2= 0.91)，并構(gòu)建了C-C、T-T、T-C共3種單倍型。其中T-C、C-C單倍型來(lái)源于二花臉母豬，頻率分別為0.18和0.82，T-T單倍型則全部來(lái)源于白杜公豬。在蘇太群體F0代中，共構(gòu)建出了G-T-C、C-T-T、C-T-C、C-C-C 4種單倍型，其中G-T-C、C-C-C、C-T-C及C-T-T單倍型來(lái)源于二花臉母豬，頻率分別為0.29、0.15、0.13和0.43，C-T-T及C-T-C來(lái)源于白杜。

在F2群體中，對(duì)上述3種單倍型與四點(diǎn)膘厚、腹脂重和肌內(nèi)脂肪含量做相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表6)，二花臉起源的單倍型T-C與C-C效應(yīng)相近(P> 0.05)，且均與杜洛克起源的T-T單倍型效應(yīng)差異顯著(P<0.05)，提示在F2群體中g(shù).1829T>C位點(diǎn)比g.1794T>C位點(diǎn)更符合QTL等位基因分離特征或與QTN的連鎖不平衡程度更高。在蘇太群體中，根據(jù)4種單倍型與四點(diǎn)背膘、腹脂重和肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表7)，單倍型主要對(duì)臀部膘厚與肌內(nèi)脂肪含量是有顯著影響的。

3 討 論

有關(guān)豬脂肪沉積性狀的基因定位和候選基因研究，國(guó)內(nèi)外已有大量的報(bào)道[13-16]。已知的影響豬脂肪沉積性狀的QTL主要集中在2、4、6、7、X染色體上，但迄今為止僅少數(shù)主效基因(如IGF2)被證實(shí)[17]。X染色體上與豬脂肪沉積、生長(zhǎng)和胴體組成等性狀相關(guān)的QTL大多定位在近著絲粒區(qū)域，但是由于在該區(qū)域存在重組冷點(diǎn)區(qū)，使得利用傳統(tǒng)的精細(xì)定位方法很難進(jìn)一步縮小QTL區(qū)間。而且，X染色體存在失活、異質(zhì)性和性染色體劑量補(bǔ)給等現(xiàn)象，這使得對(duì)哺乳動(dòng)物性染色體的QTL和功能基因研究比常染色體更加困難。目前，X染色體上影響豬脂肪沉積性狀QTL的幾個(gè)候選基因(包括AR、SERPINA7、ACSL4等[18-21])的研究相對(duì)較多，但有關(guān)豬IRS4基因的研究相對(duì)較少。而在人類研究中，IRS4基因多與Ⅱ型糖尿病、代謝紊亂、精神分裂癥等疾患相聯(lián)系。據(jù)報(bào)道，缺乏IRS4的小鼠會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)、繁殖和糖代謝輕度缺陷[22-24]。

表5 豬IRS4基因兩個(gè)SNPs位點(diǎn)與3個(gè)試驗(yàn)群體公豬的脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

表6 在F2群體中IRS4單倍型與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

表7 在蘇太群體中IRS4單倍型與脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析

本試驗(yàn)采用DNA比較測(cè)序方法，對(duì)IRS4基因外顯子區(qū)域約3 300 bp片段進(jìn)行了多態(tài)位點(diǎn)搜查。結(jié)果除搜尋到了1個(gè)S.Cepica等[5-7]所報(bào)道同義突變位點(diǎn)g.1829T>C，還搜尋到了1個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)g.1794T>C，該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致該蛋白質(zhì)第432位氨基酸由苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?Phe432Leu)。然而，這兩個(gè)位點(diǎn)均位于該基因外顯子非保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

組織表達(dá)差異分析結(jié)果顯示IRS4基因在垂體、下丘腦高豐度表達(dá)、在卵巢、板油、睪丸以及甲狀腺弱表達(dá)，在其它組織中微弱或不表達(dá)，提示IRS4可能與垂體和下丘腦激素分泌有關(guān)，從而影響神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。由于錯(cuò)義突變可能通過(guò)影響蛋白質(zhì)的翻譯機(jī)制來(lái)影響基因的表達(dá)，本研究根據(jù)錯(cuò)義突變位點(diǎn)g.1794T>C的分型結(jié)果，選擇了資源家系F2母豬CC、CT兩種基因型個(gè)體的下丘腦組織分析其表達(dá)差異情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)個(gè)體間的基因表達(dá)差異均較大?？赡艿脑蚴腔虻谋磉_(dá)本身存在一定的時(shí)空性，或者，由于屠宰時(shí)個(gè)體的應(yīng)激程度不同，體內(nèi)激素水平的差異也可能會(huì)引起基因的表達(dá)差異。另外，除結(jié)構(gòu)突變，基因調(diào)節(jié)元件突變、甲基化和miRNA等其它變異也可能導(dǎo)致基因表達(dá)差異，甚至影響表型。

本研究還在不同群體中分析IRS4基因3個(gè)SNPs的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子上的g.96C>G突變?cè)谥形鞣截i種中其主等位基因相同(表4)，這不符合先前對(duì)SSCX QTL兩個(gè)等位基因在F0代白杜和二花臉品種各自趨近純合的判斷，因此它不被視作潛在的QTN，可以被首先排除。錯(cuò)義突變位點(diǎn)g.1794T>C在所檢測(cè)的資源家系F0白杜及杜長(zhǎng)大商品豬種中均為TT基因型，在蘇太豬和二花臉群體中則表現(xiàn)出偏態(tài)分布；其中，蘇太豬TT基因型頻率達(dá)到0.84，接近其祖代杜洛克的TT基因型頻率，提示該位點(diǎn)可能與表型存在一定的關(guān)聯(lián)性，并在品種培育過(guò)程中受到了一定強(qiáng)度選擇。在同義突變位點(diǎn)g.1829T>C上，西方豬種均為TT基因型，而二花臉豬均為CC基因型，這與QTL等位基因在中西豬種中分離特征相近?；诖?，作者進(jìn)一步對(duì)IRS4基因這兩個(gè)位點(diǎn)與脂肪沉積性狀開(kāi)展關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，在資源家系F2群體中，這兩個(gè)位點(diǎn)均與脂肪沉積表型極顯著相關(guān)，表明在該群體中它們與QTL因果突變(QTN)強(qiáng)連鎖。然而，在蘇太和二花臉群體中，錯(cuò)義突變g.1794T>C對(duì)它們的脂肪沉積性狀影響基本不顯著。反而是，同義突變g.1829T>C與蘇太公豬多數(shù)脂肪沉積性狀呈顯著相關(guān)，所以今后需要進(jìn)一步研究分析它是否具有調(diào)節(jié)功能。同時(shí)，我們根據(jù)這兩個(gè)位點(diǎn)在資源家系中的分型結(jié)果，構(gòu)建了來(lái)源于F0代杜洛克公豬的T-T單倍型和來(lái)源于二花臉母豬的C-C、T-C兩種單倍型。在資源家系F2群體中，通過(guò)單倍型關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)T-C單倍型與C-C單倍型效應(yīng)相近，都能增加脂肪沉積，類似于QTL等位基因“Q”，而T-T單倍型則作用相反，可減少脂肪沉積，相當(dāng)于QTL等位基因“q”。因此，這一結(jié)果提示，同義突變位點(diǎn)g.1829T>C與QTL等位基因分離更一致。此外，T-C單倍型表型值略高于C-C單倍型(P>0.05，表6)，這說(shuō)明最好是利用兩個(gè)突變位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型作為脂肪沉積性狀分子育種標(biāo)記。

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用DNA比較測(cè)序方法，對(duì)豬IRS4基因外顯子區(qū)域約3 300 bp片段進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果在IRS4基因外顯子區(qū)域鑒別到一個(gè)錯(cuò)義突變g.1794T>C和一個(gè)同義突變g.1829T>C。IRS4基因在垂體、下丘腦組織中高豐度表達(dá)，而且不同個(gè)體下丘腦組織中IRS4基因表達(dá)量差異也較大。PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果表明g.96C>G在中西方豬種中其主等位基因相同，g.1794T>C和g.1829T>C位點(diǎn)在中西方豬種中存在一定的偏態(tài)分布，在中外雜交豬群中這兩個(gè)位點(diǎn)與脂沉積表型存在顯著的相關(guān)性，因此，可以將兩者構(gòu)成的單倍型應(yīng)用于脂肪沉積性狀的分子育種中。

[1] MILAN D，BIDANEL J P，IANNUCCELLI N，et al.Detection of quantitative trait loci for carcass composition traits in pigs[J].GenetSelEvol，2002，34(6)：705-728.

[2] AI H，REN J，ZHANG Z，et al.Detection of quantitative trait loci for growth- and fatness-related traits in a large-scale White Duroc×Erhualian intercross pig population[J].AnimGenet，2012，43(4)：383-391.

[3] MA J，IANNUCCELLI N，DUAN Y，et al.Recombinational landscape of porcine X chromosome and individual variation in female meiotic recombination associated with haplotypes of Chinese pigs[J].BMCGenomics，2010，11：159.

[4] PEREZ-ENCISO M，MERCADE A，BIDANEL J，et al.Large-scale，multibreed，multitrait analyses of quantitative trait loci experiments：the case of porcine × chromosome[J].JAnimSci，2005，83(10)：2289-2296.[5] CEPICA S，BARTENSCHLAGER H，GELDERMANN H.Mapping of QTL on chromosome X for fat deposition，muscling and growth traits in a wild boar × Meishan F2family using a high-density gene map[J].AnimGenet，2007，38(6)：634-638.

[6] CEPICA S，MASOPUST M，KNOLL A，et al.Linkage and RH mapping of 10 genes to a QTL region for fatness and muscling traits on pig chromosome X[J].AnimGenet，2006，37(6)：603-604.

[7] CEPICA S，ROHRER G A.Linkage and radiation hybrid mapping of the porcine PIK3R1 gene to chromosome 16[J].AnimGenet，2003，34(4)：313-315.

[8] MA J，GILBERT H，IANNUCCELLI N，et al.Fine mapping of fatness QTL on porcine chromosome X and analyses of three positional candidate genes[J].BMCGenet，2013，14：46.

[9] FANTIN V R，WANG Q，LIENHARD G E，et al.Mice lacking insulin receptor substrate 4 exhibit mild defects in growth，reproduction，and glucose homeostasis[J].AmJPhysiol-EndocM，2000，278(1)：E127-133.

[10] VALASSI E，SCACCHI M，CAVAGNINI F.Neuroendocrine control of food intake[J].NutrMetabCardiovas，2008，18(2)：158-168.

[11] WAUMAN J，DE SMET A S，CATTEEUW D，et al.Insulin receptor substrate 4 couples the leptin receptor to multiple signaling pathways[J].MolEndocrinol，2008，22(4)：965-977.

[12] MASOPUST M，VYKOUKALOVA Z，KNOLL A，et al.Porcine insulin receptor substrate 4 (IRS4) gene：cloning，polymorphism and association study[J].MolBiolRep，2011，38(4)：2611-2617.

[13] REN J，GUO Y，MA J，et al.Growth and meat quality QTL in pigs with special reference to a very large white Duroc×Erhualian resource population[C].In：Proceedings of the 8th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production，Belo Horizonte，Minas Gerais，Brazil，2006：13-11.

[14] 蘇玉虹，熊遠(yuǎn)著，張 勤，等.豬胴體脂肪沉積性狀的QTL定位[J].遺傳學(xué)報(bào)，2002，29(8)：681-684. SU Y H，XIONG Y Z，ZHANG Q，et al.Mapping quantitative trait loci for fat deposition in carcass in pigs[J].ActaGeneticaSinina，2002，29(8)：681-684.(in Chinese)

[15] BIDANEL J P，MILAN D，IANNUCCELLI N，et al.Detection of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs[J].GenetSelEvol，2001，33：289-309

[16] CEPICA S，ROHRER G A，KNOLL A，et al.Linkage mapping of four genes (OTC，SERPINA7，SLC25A5 and FMR1) on porcine chromosome X[J].AnimGenet，2001，32：106-109.

[17] ROTHSCHILD M F，HU Z L，JIANG Z.Advances in QTL mapping in pigs[J].IntJBiolSci，2007，3(3)：192-197.

[18] MERCADE A，ESTELLE J，PEREZ-ENCISO M，et al.Characterization of the porcine acyl-CoA synthetase long-chain 4 gene and its association with growth and meat quality traits[J].AnimGenet，2006，37(3)：219-224.

[19] NONNEMAN D，ROHRER G A，WISE T H，et al.A variant of porcine thyroxine-binding globulin has reduced affinity for thyroxine and is associated with testis size[J].BiolReprod，2005，72(1)：214-220.

[20] PONSUKSILI S，MURANI E，SCHELLANDER K，et al.Identification of functional candidate genes for body composition by expression analyses and evidencing impact by association analysis and mapping[J].BiochimicaetBiophysicaActa，2005，1730(1)：31-40.[21] TRAKOOLJUL N，PONSUKSILI S，SCHELLANDER K，et al.Polymorphisms of the porcine androgen receptor gene affecting its amino acid sequence and expression level[J].BiochimicaetBiophysicaActa，2004，1678(2-3)：94-101.

[22] MELKERSSON K，PERSSON B.Association between body mass index and insulin receptor substrate-4 (IRS-4) gene polymorphisms in patients with schizophrenia[J].NeuroEndocrinolLett，2011，32(5)：634-640.

[23] SESTI G.Insulin receptor substrate polymorphisms and type 2 diabetes mellitus[J].Pharmacogenomics，2000，1(3)：343-357.

[24] SESTI G，F(xiàn)EDERICI M，HRIBAL M L，et al.Defects of the insulin receptor substrate (IRS) system in human metabolic disorders[J].FASEBJ，2001，15(12)：2099-2111.

(編輯 郭云雁)

PorcineIRS4 Gene：Polymorphism，Differential Expression and Its Associations with Fat Deposition Traits

MA Huan-ban，LIU Xian-xian，YANG Jie，HUANG Wei-bing，DUAN Yan-yu，GUO Yuan-mei*，MA Jun-wu*

(NationalKeyLaboratoryforSwineGenetics,BreedingandProductionTechnology，JiangxiAgriculturalUniversity，Nanchang330045，China)

This study aimed to detect polymorphisms of porcineIRS4 gene and its expression pattern in 17 tissues，and to identify gene markers associated with the QTL for fat deposition traits.Comparative sequence analysis of theIRS4 revealed 3 SNPs，including g.96C>G in the promoter region，a synonymous substitution g.1829T>C and a missense substitution g.1794T>C (p.Phe432Leu).Through RT-PCR assay，we found thatIRS4 gene was abundantly expressed in hypothalamus and pituitary，but weakly expressed in other tissues.Furthermore，we genotyped the 3 SNPs in White Duroc×Erhualian F2intercross，Sutai pigs，Erhualian pigs and DLY[Duroc×(Landrace×Yorkshire)]three-way crossbred pigs and Chinese local wild boar by PCR-RFLP，then calculated allele frequencies and estimated the associations between those SNPs and backfat thicknesses (BFTs) at shoulder，chest，waist and hip，abdominal fat weight (AFW)，intramuscular fat content (IMF) and loin eye area (LEA) in these populations.The SNP g.96C>G was almost fixed in the F2intercross，so it was first excluded as a causative mutation (QTN) underlying this QTL.For both SNPs g.1794T>C and g.1829T>C，all western breeds (White Duroc and DLY) only had TT genotype，while，in the Erhualian population，the frequencies of CC genotypes at g.1794T>C and g.1829T>C were 65% and 100%，respectively.The results of association analysis showed that g.1794T>C was highly associated with all investigated traits in the F2intercross (P<0.01)，but associated only with IMF in Sutai pigs(P<0.05)and had no significant effect on Erhualian’s phenotypes；g.1829T>C was significantly associated with several fatness traits (e.g.BFT and LEA) in the F2intercross and Sutai pigs.Moreover，bioinformatics analysis demonstrated that the potential influence of the missense variant g.1794T>C on IRS4 protein function was limited.The results suggest that the SNP g.1794T>C is unlikely to be QTN，and the SNP g.1829T>C associated with fat deposition traits across populations could be used as marker for selection of these traits.

pig；IRS4 gene；QTL；polymorphism；differential expression；fat deposition traits

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.002

2014-10-16

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB124702)；江西省重大科技項(xiàng)目(20114ACB01100)

馬煥班(1990-)，男，江西上饒人，碩士，主要從事豬肉質(zhì)性狀的遺傳解析工作，E-mail：jiangximhb@sina.com

*通信作者：麻駿武，副教授，Tel/Fax：0791-83813080，E-mail：ma_junwu@hotmail.com；郭源梅，副研究員，Tel/Fax：0791-83813080，E-mail：gyuanmei@hotmail.com

S828.2

A

0366-6964(2015)07-1084-11