黃芪對膿毒癥大鼠輔助性T細(xì)胞功能的影響及意義

涂丹娜，周小勤，舒俊華

（湖北省婦幼保健院兒內(nèi)科，武漢430070）

黃芪對膿毒癥大鼠輔助性T細(xì)胞功能的影響及意義

涂丹娜，周小勤，舒俊華

（湖北省婦幼保健院兒內(nèi)科，武漢430070）

目的探討黃芪對膿毒癥大鼠模型外周血單核細(xì)胞（PBMC）及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中Th1/Th2失衡的影響及意義。方法60只清潔級SD大鼠隨機(jī)分為對照組[C組，早期對照組（EC組）和晚期對照組（LC）]、膿毒癥組[S組，早期膿毒癥組（ES）和晚期膿毒癥組（LS）]及膿毒血癥黃芪干預(yù)組[H組，早期干預(yù)組（EH）和晚期干預(yù)組（LH）]，每組10只。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組大鼠PBMC及BALF中的干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）表達(dá)水平，并計算IFN-γ/IL-4的比值。結(jié)果S組大鼠PBMC和BALF中的IFN-γ表達(dá)均較C組和H組顯著下降，且在PBMC中這種下降趨勢呈時間依賴性，而IL-4表達(dá)水平顯著上升，IFN-γ/IL-4表達(dá)隨著時間延續(xù)進(jìn)行性下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。結(jié)論輔助性T細(xì)胞功能失衡參與了膿毒癥的進(jìn)展，黃芪可抑制膿毒癥大鼠中的炎性反應(yīng)，改善其免疫失衡。

膿毒癥； 黃芪； T淋巴細(xì)胞； 干擾素-γ； 白細(xì)胞介素4

兒童膿毒癥/嚴(yán)重膿毒癥是兒科重癥監(jiān)護(hù)病房中一種常見且病死率較高的疾病[1]。多器官功能衰竭是導(dǎo)致患兒死亡的主要原因，其中尤以呼吸系統(tǒng)功能障礙為常見[2]。大量研究表明，在膿毒癥的發(fā)病過程中，機(jī)體并不是處于穩(wěn)定的炎癥激活狀態(tài)，同時還伴免疫抑制，這可能是導(dǎo)致臨床抗炎治療失敗的原因之一[3]。黃芪是我國傳統(tǒng)的“扶正固本，補(bǔ)中益氣”的藥物，其作用與免疫調(diào)節(jié)息息相關(guān)。本研究采用黃芪注射液對膿毒癥大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，并檢測其外周血單核細(xì)胞（PBMC）及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）功能，探討黃芪對膿毒癥大鼠Th1/Th2失衡的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級SD雄性大鼠60只（武漢大學(xué)實驗動物中心提供），體質(zhì)量（250±30）g。大鼠染色編號，隨機(jī)分成三組，每組20只，每組根據(jù)術(shù)后留取樣本的時間又分為早期組（術(shù)后8~10 h）和晚期組（術(shù)后16~18 h）。C組（對照組）分為早期對照組（EC，n=10）和晚期對照組（LC，n=10）；S組（膿毒血癥組）分為早期膿毒血癥組（ES，n=10）和晚期膿毒血癥組（LS，n=10）；H組（膿毒血癥黃芪干預(yù)組）分為早期干預(yù)組（EH，n=10）和晚期干預(yù)組（LH，n=10）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型復(fù)制及給藥方法 實驗動物進(jìn)行試驗性飼養(yǎng)1周后，H組采用黃芪注射液按5mL/kg腹腔注射3周，每天1次，黃芪注射液購自正大青春寶藥業(yè)有限公司（20 g/10mL，批號：1306131），其余兩組采用等量生理鹽水腹腔注射3周，每天1次。各組大鼠術(shù)前禁食過夜，自由飲水。動物經(jīng)3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，行盲腸中遠(yuǎn)端1/3結(jié)扎術(shù)，并在盲腸末端用18號針頭穿孔，保留近端盲腸血供，逐層縫合腹壁切口，C組除不結(jié)扎盲腸和穿孔外，其余操作與其他實驗組一致。分別于術(shù)后即刻及術(shù)后7 h于大鼠背部皮下注射生理鹽水（4 mL/100g）以防脫水。

1.2.2 標(biāo)本收集 實驗結(jié)束時每只大鼠采血2mL，肝素鈉抗凝。大鼠左肺留取肺組織，右肺經(jīng)氣管切口使用生理鹽水進(jìn)行灌洗，每次5mL，共3次，回收率80%以上。BALF經(jīng)2 000 r/min離心15min，取上清液于離心管-70℃保存用以測定干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）的濃度。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，用含10%小牛血清的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106mL-1，加入植物血凝素（PHA）100mg/L，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清液儲存于-20℃用于細(xì)胞因子檢測。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）細(xì)胞因子檢測 采用ELISA方法，所用操作步驟均按照說明書進(jìn)行。IFN-γ和IL-4檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，IFN-γ最低檢測值15.625 pg/mL，IL-4最低檢測值8 pg/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ及IL-4濃度比較 與C組比較，S組和H組大鼠的PBMC中IFN-γ表達(dá)水平均明顯下降，H組大鼠IFN-γ表達(dá)水平較S組有明顯提升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；且LS及LH組分別較ES及EH組下降更顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；S組和H組的IL-4水平表達(dá)較C組明顯升高，而LH組的升高幅度較LS組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），ES組和EH組的IL-4表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IFN-γ/IL-4比值S組和H組均明顯低于C組，而H組IFN-γ/IL-4比值較S組呈明顯上升趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 各組PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ及IL-4濃度比較（±s）

表1 各組PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ及IL-4濃度比較（±s）

注：與C組同期比較，aP＜0.01；與S組同期比較，bP＜0.01，cP＜0.05。

組別EC組LC組ES組LS組EH組LH組n IFN-γ（pg/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ/IL-4 10 10 10 10 10 10 117.93±14.67 115.52±11.53 66.78±9.43a52.52±9.34a89.73±11.77ab73.80±12.44ab28.10±5.48 29.28±3.50 37.91±4.89a41.51±5.65a34.97±5.84a35.31±4.60ac4.24±0.71 3.96±0.64 1.77±0.42a1.26±0.39a2.58±0.63ab2.08±0.53ab

2.2 各組BALF中IFN-γ及IL-4濃度比較 S組和H組BALF中IFN-γ表達(dá)水平較C組均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或0.05）；H組的IFN-γ表達(dá)水平較S組有所提升，且LH較EH組下降更為顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或0.05）；而ES組與LS組IFN-γ表達(dá)水平比較，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與C組比較，IL-4的表達(dá)在S組和H組的BALF中明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。S組和H組中IFN-γ/IL-4的比值均明顯低于C組，而H組中IFN-γ/IL-4的比值與S組比較，呈明顯上升趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 各組BALF中IFN-γ及IL-4濃度比較（±s）

表2 各組BALF中IFN-γ及IL-4濃度比較（±s）

注：與C組同期比較，aP＜0.05；與S組同期比較，bP＜0.05；與EH組比較，cP＜0.05。

組別EC組LC組ES組LS組EH組LH組n IFN-γ（pg/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ/IL-4 3.84±0.73 3.75±0.77 1.38±0.35a1.14±0.21a2.12±0.47ab1.78±0.56ab10 10 10 10 10 10 84.33±9.87 83.59±11.77 50.51±7.79a44.75±9.48a71.96±13.18ab60.83±8.64abc21.99±2.79 22.39±3.17 36.68±5.88a39.08±6.23a33.87±5.43a34.37±6.45a

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征。尤其對于兒童，由于其各系統(tǒng)器官生理功能不健全、免疫功能低下等特點，膿毒癥的發(fā)病率及死亡率一直居高不下[4]。有研究表明，膿毒癥是炎性反應(yīng)、微循環(huán)障礙、凝血功能障礙、免疫抑制和神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)之間復(fù)雜作用的結(jié)果[5]。隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到“過度炎性反應(yīng)”及“過度免疫抑制”在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在膿毒癥的發(fā)病過程中，機(jī)體并不是處于穩(wěn)定的炎癥激活狀態(tài)，其病理生理狀態(tài)可隨時間而發(fā)生變化，呈現(xiàn)一種序貫反應(yīng)。最新研究證明，免疫抑制甚至在膿毒癥感染損傷初期即開始存在[6]，機(jī)體處于一種復(fù)雜的免疫紊亂和失衡狀態(tài)。因此，免疫治療的重點在于重建膿毒癥患者的免疫平衡穩(wěn)態(tài)[7]。Th在這一過程中執(zhí)行著重要功能，它是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞?，F(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為，活化的Th按其功能和分泌細(xì)胞因子的不同至少可以分為2群：Th1細(xì)胞可以分泌IFN-γ而不分泌IL-4，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞可以分泌IL-4而不分泌IFN-γ，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，通常以這2種細(xì)胞因子作為鑒別Th1和Th2的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠外周血單個核細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中，IFN-γ的表達(dá)水平顯著下降，而IL-4表達(dá)水平明顯上升，表明Th2功能亢進(jìn)，并且隨著時間的延續(xù)，IFN-γ表達(dá)水平持續(xù)下降，而IFN-γ/IL-4的比值亦呈下降趨勢，Th1向Th2發(fā)生進(jìn)行性偏移。

前期的臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)，下呼吸道感染是膿毒癥感染的主要途徑，而多器官功能衰竭是導(dǎo)致兒童膿毒癥死亡的主要原因，其中尤以呼吸系統(tǒng)功能障最為常見[2]。BALF直接來源于下呼吸道，更能直觀地反映病灶局部的生理及病理生理改變情況。有研究表明，重癥支原體肺炎患兒BALF中存在Th1/Th2失衡，以Th2反應(yīng)占優(yōu)勢[8]。本研究結(jié)果顯示，在膿毒癥大鼠模型的肺組織中有大量的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，在膿毒癥大鼠的BALF中，IFN-γ和IL-4的表達(dá)水平呈與PBMC培養(yǎng)上清液中相同趨勢，Th2細(xì)胞功能隨著時間的進(jìn)展呈進(jìn)行性亢進(jìn)狀態(tài)，膿毒癥大鼠機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫失衡。

黃芪是我國的傳統(tǒng)中藥，其味甘，性微溫，具有益氣固表、托毒排膿、利尿和斂創(chuàng)生肌等功效[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中含有黃芪多糖、皂苷類、黃酮類、氨基酸等多種化學(xué)成分，其藥理作用廣泛。黃芪可作用于機(jī)體免疫系統(tǒng)的各個環(huán)節(jié)，對細(xì)胞免疫、體液免疫及固有免疫均具有調(diào)節(jié)作用。它可作用于多種免疫活性細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌和正常機(jī)體的抗體生成；能削弱或消除抑制性淋巴細(xì)胞（Ts）的活性；改善單核巨噬細(xì)胞的功能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，提高自然殺傷（NK）細(xì)胞的活性[10]。有文獻(xiàn)報道，在膿毒癥成年患者中，黃芪注射液能促進(jìn)其總淋巴細(xì)胞、CD4、CD4/CD8水平的上調(diào)[11]。本研究結(jié)果顯示，在膿毒癥大鼠模型 PBMC及BALF中，黃芪可明顯上調(diào)其IFN-γ的表達(dá)水平；對晚期膿毒癥大鼠PBMC培養(yǎng)上清液中的IL-4的表達(dá)亦有抑制作用，但對BALF及早期膿毒癥大鼠外周血中IL-4的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，這可能與感染損傷及黃芪干預(yù)時間的長短有關(guān)。但是就Th1/Th2比值而言，無論是膿毒癥大鼠模型感染的早期組還是晚期組，黃芪均能明顯促進(jìn)其Th2向Th1漂移，從而改善膿毒癥大鼠機(jī)體的免疫失衡狀態(tài)。

本研究尚存在一些不足之處，針對黃芪干預(yù)的時程及不同濃度黃芪干預(yù)后對膿毒癥大鼠的Th功能的影響尚需予以證實。進(jìn)一步的研究將對上述不足之處予以完善，并致力于通過對Th亞群功能的干預(yù)來延緩膿毒癥的進(jìn)程。

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Effectand significance of astragalusmembranaceus to helper T cells function of septic rats

Tu Danna，Zhou Xiaoqin，Shu Junhua
（Departmentof InternalPediatrics，HubeiProvincialMaternaland Children Health Care Hospital，Wuhan 430070，China）

ObjectiveTo approach the effectand significance ofastragalusmembranaceus to imbalance of Th1/Th2 in the peripheralbloodmononuclear cell（PBMC）and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）ofseptic rats.MethodsA totalof clean 60 SD ratswere randomly divided into the controlgroup[group C including group EC and group LC]，the sepsisgroup[group S including group ESand group LS]and astragalusmembranaceus intervening group[group H including group EH and group LH]，10 of each group.It adopted enzyme-linked immunosorbent assay to detect the expression level of IFN-γand IL-4 in PBMC and BALF in the ratsofeach group and calculate the ratio of IFN-γ/IL-4.ResultsCompared to the group Cand group H，the expression levelof IFN-γin the PBMC and BALFofgroup Swere significantly decreased.The downtrend in the PBMC showed time dependencewhile the IL-4 expression levelwere improved obviously.With the time prolonging，the expression of IFN-γ/IL-4 in the PBMCand BALFof septic ratswas dropped progressively.The difference had statistical significance（P＜0.01 or 0.05）.ConclusionThe imbalance of helper T cells function participates to the development of sepsis.Astragalusmembranaceusmay inhibit the inflammatory responseofastragalusmembranaceus to improve their immunologic imbalance.

Sepsis； Radix Astragali； T-lymphocytes； Interferon-gamma； Interleukin-4

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.003

：A

：1009-5519（2015）07-0964-03

2014-12-26）

涂丹娜（1979-），女，湖北武漢人，博士研究生，主治醫(yī)師，主要從事兒童感染與免疫方面的研究；E-mail：tdn_tutu@163.com。

周小勤（E-mail：62724838@163.com）。