膽紅素對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2分泌NO及細(xì)胞因子的影響

關(guān)小勇，高 干，楊興興，陳華干，于橋愛(ài)，李雪麗（柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西545001）

膽紅素對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2分泌NO及細(xì)胞因子的影響

關(guān)小勇，高 干，楊興興，陳華干，于橋愛(ài)，李雪麗
（柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西545001）

目的探討膽紅素對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2分泌NO及細(xì)胞因子的影響。方法體外培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2，加入不同濃度非結(jié)合膽紅素刺激，空白對(duì)照組非結(jié)合膽紅素濃度為0μmol/L，實(shí)驗(yàn)組分別為50、100、200μmol/L，觀察在不同濃度非結(jié)合膽紅素刺激下NO的產(chǎn)生情況；于膽紅素孵育的不同時(shí)間點(diǎn)（分別為2、4、8、12 h）收集細(xì)胞上清液，利用 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結(jié)果膽紅素含量為0～100μmol/L時(shí)，NO生成量呈增加趨勢(shì)，50、100、200μmol/L膽紅素濃度組NO生成量均高于對(duì)照組，且100、200μmol/L組高于50μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著膽紅素刺激作用的延長(zhǎng)，IL-6、TNF-α水平均有所增加，孵育4、8、12 h后IL-6、TNF-α水平均高于孵育2 h，且孵育8、12 h的IL-6、TNF-α水平與孵育4 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；孵育8 h后，IL-6、TNF-α水平趨于穩(wěn)定，且孵育8 h與12 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論膽紅素可能通過(guò)多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑刺激小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2分泌NO及細(xì)胞因子，在這些通路中實(shí)施干預(yù)可能成為治療新生兒高膽紅素血癥的途徑之一。

膽紅素； 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞； 一氧化氮； 細(xì)胞因子類； 小鼠

膽紅素是體內(nèi)含卟啉的化合物如血紅蛋白、肌紅蛋白等的代謝產(chǎn)物，主要以結(jié)合膽紅素和非結(jié)合膽紅素的形式存在[1]。新生兒高膽紅素血癥是由于血中膽紅素水平增加所導(dǎo)致，是新生兒常見(jiàn)病、多發(fā)病。我國(guó)不同程度新生兒黃疸的發(fā)生率在90%以上，且近年來(lái)呈增加趨勢(shì)，其中絕大多數(shù)是以血清非結(jié)合膽紅素水平升高為主[2-3]。新生兒高膽紅素血癥可引起膽紅素腦病，嚴(yán)重者甚至遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[4-6]。神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種，約占全部膠質(zhì)細(xì)胞的5%，相當(dāng)于腦和脊髓中的巨噬細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中的第一道也是最主要的一道免疫防線。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞不停地清除CNS中損壞的神經(jīng)、斑塊及感染性物質(zhì)，維護(hù)CNS的穩(wěn)定。本文使用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞研究小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2在非結(jié)合膽紅素作用下釋放NO及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）的情況，探討膽紅素引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2（上海橋社生物科技公司），二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Gibco公司），膽紅素（Fluka公司），清蛋白（Sigma公司），NO檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），IL-6、TNF-α試劑盒（博士德生物科技公司），上?？迫A酶標(biāo)儀和全自動(dòng)洗板機(jī)（ELISA法）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇BV-2細(xì)胞，置于RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素）中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞代謝情況，1～2 d換液，至指數(shù)生長(zhǎng)期備用。

1.2.2 硝酸還原酶法檢測(cè)膽紅素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，加入RPMI-1640培養(yǎng)液制備成5×105mL-1的細(xì)胞懸液，分別接種于24孔板中，每孔1mL，設(shè)空白對(duì)照組（膽紅素濃度為0μmol/L），不同膽紅素濃度組（50、100、200μmol/L），待細(xì)胞貼壁后，加入各濃度膽紅素孵育8 h后，檢測(cè)NO的生成量，按照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)膽紅素對(duì)IL-6、TNF-α的抑制作用 取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞配制成5×105mL-1的細(xì)胞懸液，分別接種于24孔板中，每孔1mL。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入膽紅素濃度為100μg/mL后，分別于0、2、4、8、12 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α的含量。按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；多個(gè)樣本間的兩兩比較使用單方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 硝酸還原酶法檢測(cè)膽紅素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 膽紅素含量為0～100μmol/L時(shí)，NO生成量呈增加趨勢(shì)，膽紅素濃度50、100、200μmol/L組NO生成量[（55.67±12.10）、（79.40±17.09）、（78.98±20.42）pg/mL]均高于對(duì)照組[（34.33±15.89）pg/mL]，且100、200μmol/L組高于50μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但200μmol/L組與100μmol/L組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 膽紅素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6、TNF-α產(chǎn)生的影響 隨著膽紅素刺激作用的延長(zhǎng)，IL-6、TNF-α的生成量均有所增加，孵育4、8、12 h后IL-6、TNF-α的生成量均高于2 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；孵育8、12 h與孵育4 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；孵育8 h后IL-6、TNF-α的生成量趨于穩(wěn)定，且孵育8 h與12 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 膽紅素作用下小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6、TNF-α水平的變化（±s，pg/mL）

表1 膽紅素作用下小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6、TNF-α水平的變化（±s，pg/mL）

注：與孵育2 h比較，aP＜0.05；與孵育4 h比較，bP＜0.05。

孵育時(shí)間2 h 4 h 8 h 12 h TNF-α IL-6 53.20±11.53 159.33±16.01a102.65±17.09ab93.45±20.42ab33.66±16.84 202.67±26.10a427.84±75.22ab396.75±19.62ab

3 討 論

膽紅素是血紅蛋白的終末代謝產(chǎn)物，屬于非酶類抗自由基系統(tǒng)。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的血清膽紅素是重要的自由基清除劑，對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，正常新生兒血中膽紅素水平顯著高于成年人和年長(zhǎng)兒，可彌補(bǔ)其酶類抗自由基的不足，這可能是新生兒黃疸的生理意義[7]。高濃度血清膽紅素有顯著的細(xì)胞毒性，不僅可引起CNS不可逆的損傷，而且對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能也有影響。膽紅素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用，濃度過(guò)高可顯著抑制免疫系統(tǒng)功能，使黃疸患兒易于感染，加重病情。認(rèn)識(shí)膽紅素的免疫作用，對(duì)于高膽紅素血癥患兒的治療有重要意義[8]。作為腦內(nèi)主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞具有類似巨噬細(xì)胞的功能，在受到刺激時(shí)易被激活，分泌大量的炎癥細(xì)胞因子。NO雖然是多種生理功能的重要調(diào)節(jié)分子，大量NO是造成神經(jīng)細(xì)胞損傷死亡的重要炎癥因子之一，可導(dǎo)致宿主細(xì)胞和鄰近細(xì)胞的損傷[9-10]。在膽紅素等多種神經(jīng)毒性物質(zhì)刺激下，NO生成量增加。因此，直接抑制NO的產(chǎn)生，可能是治療炎癥的有效手段之一。從膽紅素作用后IL-6、TNF-α的產(chǎn)生情況來(lái)看，膽紅素可引起小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，其可能是通過(guò)多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如轉(zhuǎn)錄因子、絲裂原活化蛋白激酶等，最終誘導(dǎo) NO、IL-6、TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生[11]。在這些通路中實(shí)行干預(yù)，是新生兒高膽血癥治療時(shí)的手段之一，而具體作用機(jī)制，還需進(jìn)一步研究探討。

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The effects of bilirubin on the secretion of NO and cytokines in themurinem icroglial cells BV-2

Guan Xiaoyong，Gao Gan，Yang Xingxing，Chen Huagan，Yu Qiaoai，Li Xueli
（Department of Clinical Laboratory，Liuzhou Municipal Maternity and Child Health CareHospital，Guangxi545001，China）

ObjectiveTo approach the effectsofbilirubin on the secretion of NO and cytokines in themurinemicroglia cellsBV-2.MethodsThemurinemicroglia cell line BV-2 were cultured in vitro，adding different concentrationsofunconjugated bilirubin for stimulation.The concentrations of the control group and the experimental group were set as 0μmol/L and 50，100，200μmol/L accordingly.Itwas observed the production ofNO under the stimulation of different concentration unconjugated bilirubin.Itwascollected the cellssupernatantatdifferent time pointsof2nd，4th，8th，and 12th hour for the detection of IL-6 and TNF-αconcentrationsby ELISA assay.ResultsThe production contentof NOwasorientated to increasewhen the bilirubin ranged 0-100μmol/L.The production contentofNO in the experimentalgroupwith bilirubin concentration being 50μmol/L，100μmol/L，200μmol/Lwas higher than thatof the control group，in which，The production contentof NO in the experimental group with bilirubin concentration being 100μmol/L，200μmol/Lwashigher than thatwith 50μmol/L group，the difference had statisticalsignificance（P＜0.05）.With the prolongingofbilirubin stimulation，the concentrationsof IL-6 and TNF-αwere increased. The concentration of IL-6 and TNF-αafter the incubation for 4h，8 h and 12 h washigher than those for 2 h.Compared the concentration of IL-6 and TNF-αthe incubation for8 h，12 h and 4 h respectively，the difference had statisticalsignificance（P＜0.05）. After8-h incubation，the concentrations of IL-6 and TNF-αwas tended to be stable.Therewasno statistical significance between the incubation for 8 h and 12 h（P＞0.05）.ConclusionBilirubinmay stimulate themurinemicroglial cells BV-2 to secrete NO and cytokinesviamultiple signal transduction pathways.The implementation of the intervention in these pathwaysmightbe one of the treatmentmethodsofneonatalhyperbilirubinemia

Bilirubin； Microglia； Nitric oxide； Cytokines； Mice

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.004

：A

：1009-5519（2015）07-0967-02

2014-11-11）

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（Z2013601）。

關(guān)小勇（1969-），男，廣西梧州人，副主任醫(yī)師，主要從事臨床生物化學(xué)與免疫學(xué)研究；E-mail：gxy6688@163.com。

李雪麗（E-mail：xuelyly@163.com）。