一種同時(shí)進(jìn)行牛囊胚差異染色和凋亡染色的方法

孫尉峻，于學(xué)穎，2，胡庭溪，3，郭芹芹，劉 巖，郝海生，趙學(xué)明，朱化彬，杜衛(wèi)華*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.河北工程大學(xué)，邯鄲 056000；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070)

一種同時(shí)進(jìn)行牛囊胚差異染色和凋亡染色的方法

孫尉峻1，于學(xué)穎1，2，胡庭溪1，3，郭芹芹1，劉 巖1，郝海生1，趙學(xué)明1，朱化彬1，杜衛(wèi)華1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.河北工程大學(xué)，邯鄲 056000；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070)

旨在優(yōu)化雙重?zé)晒馊旧椒ǖ幕A(chǔ)上，建立囊胚的三重免疫熒光染色方法，以期更經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確地評(píng)估胚胎質(zhì)量。三重免疫熒光染色方法分別用CDX2蛋白、caspase-3蛋白和Hochest 33342標(biāo)記囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和所有細(xì)胞的細(xì)胞核，共3種染色方案。雙重?zé)晒馊旧椒ú捎肞I染色滋養(yǎng)層細(xì)胞，或通過TUNEL法進(jìn)行凋亡細(xì)胞染色；而囊胚細(xì)胞的細(xì)胞核用Hochest33342染色。結(jié)果表明，三重免疫熒光染色方法獲得的圖像清晰，能準(zhǔn)確地標(biāo)記囊胚中的各類細(xì)胞。另外，比較3種染色方案的準(zhǔn)確性、復(fù)雜性及染色效果，確定兩種一抗或兩種二抗共同孵育的方案準(zhǔn)確度高、效果好、且用時(shí)最短，為最佳染色方案。綜上表明，在同一枚囊胚中，通過標(biāo)記CDX2和caspase-3蛋白來鑒定其滋養(yǎng)層細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，并進(jìn)行囊胚質(zhì)量的評(píng)估是可行的，而且較雙重?zé)晒馊旧休^大的優(yōu)勢(shì)。

囊胚質(zhì)量；三重免疫熒光染色；CDX2；caspase-3

隨著哺乳動(dòng)物胚胎生物技術(shù)的不斷發(fā)展，體外胚胎生產(chǎn)效率不斷提高，同時(shí)，體外胚胎質(zhì)量也同樣不容忽視。優(yōu)質(zhì)胚胎對(duì)非同步化環(huán)境的忍耐性較高，反之劣質(zhì)胚胎對(duì)非同步化環(huán)境的耐受性極低，因此胚胎質(zhì)量的好壞直接關(guān)乎胚胎移植后妊娠率、成活率及畸形率。目前評(píng)估胚胎質(zhì)量的方法有多種，但較為普遍使用的仍為胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估[1]。胚胎發(fā)育至桑椹胚階段，發(fā)生第一次分化：滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分化[2]。在囊胚階段，劣質(zhì)胚胎易發(fā)生不同程度的細(xì)胞凋亡、DNA斷裂等，以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此囊胚總細(xì)胞數(shù)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞比例成為真實(shí)反映胚胎質(zhì)量的參考指標(biāo)[3]。另外，細(xì)胞凋亡的檢測也逐漸成為評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，通常使用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色進(jìn)行檢測[4]。

目前較為常見的熒光染色方法為雙重?zé)晒馊旧从脙煞N不同染料分別標(biāo)記不同類型細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)各個(gè)類型細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)[5-6]。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，染色方法流程逐步簡化且準(zhǔn)確性提高。S.M.Hosseini等[7]使用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)分別標(biāo)記囊胚總細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞凋亡率，建立了非常快捷的染色方法；D.Strumpf等[8]證明尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子蛋白2(CDX2)在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)層細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵作用，且在滋養(yǎng)層細(xì)胞中特異性表達(dá)，因此通過標(biāo)記CDX2進(jìn)而可以區(qū)分出滋養(yǎng)層細(xì)胞。

為了更全面、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地評(píng)估胚胎質(zhì)量，E.Wydooghe等[2]在同一枚囊胚使用3種熒光分別標(biāo)記囊胚總細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。其使用Hochest 33342和CDX2分別標(biāo)記囊胚總細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞，另外使用細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵蛋白caspase-3標(biāo)記凋亡細(xì)胞，可以較全面地評(píng)估囊胚質(zhì)量。但是該程序較為復(fù)雜且周期較長，本研究以E.Wydooghe等[2]研究為基礎(chǔ)，建立更為簡單快捷的三重免疫熒光染色方法，為胚胎質(zhì)量評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

所有試劑如無特殊說明均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。CDX2(鼠抗)一抗購自美國Biogenex公司，caspase-3(兔抗)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，Alexa Fluor 488(羊抗鼠)二抗和Alexa Fluor 594(羊抗兔)二抗均購自美國Life Technologies公司。

1.2 卵母細(xì)胞的采集和體外成熟

從屠宰場采集牛卵巢，置于37 ℃生理鹽水中，3 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。使用含青霉素和鏈霉素的溫?zé)嵘睇}水將卵巢清洗3～5次后，用真空蠕動(dòng)泵抽取5～8 mm卵泡中的卵泡液。在體視顯微鏡下挑選卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes，COCs)，用成熟液(含0.01 IU·L-1FSH、10 IU·L-1LH、1 μg·mL-1雌二醇、100 ng·mL-1IGF、50 ng·mL-1EGF、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清的TCM 199培養(yǎng)液)洗滌后，放入含有成熟液并覆蓋礦物油的四孔板中，每孔培養(yǎng)50枚COCs，在38.5 ℃、5% CO2和100%濕度條件下培養(yǎng)22～24 h。

1.3 體外受精

將COCs從成熟培養(yǎng)液中移入50 μL受精滴(含10 μg·mL-1肝素、4 mg·mL-1BSA的Brackett-Oliphant液[9])中，每滴15枚。38 ℃水浴解凍精液，使用5 mL洗精液(含10 μg·mL-1肝素、4 mg·mL-1BSA、10 mol·L-1咖啡因的Brackett-Oliphant液)在500 g離心5 min洗滌；棄上清，再加入5 mL洗精液離心5 min，棄上清，用洗精液調(diào)整精子濃度，使精子濃度約為2×107mL-1。取50 μL精液，與含有COCs的受精滴混合成100 μL液滴，38.5 ℃、5% CO2氣體和100%濕度條件下精卵共孵育。

1.4 胚胎的體外培養(yǎng)

精卵共孵育8 h后，取出受精卵，用1 mg·mL-1的透明質(zhì)酸酶處理3 min，然后用移液槍反復(fù)吹打，直至卵丘細(xì)胞基本脫落；用含10% FBS的TCM 199終止透明質(zhì)酸酶的消化，口吸管將受精卵在前期培養(yǎng)液(含109.5 mol·L-1NaCl、3.1 mol·L-1KCl、26.2 mol·L-1NaHCO3、0.8 mol·L-1MgCl2·6H2O、1.19 mol·L-1KH2PO3、0.4 mol·L-1丙酮酸鈉、1.5 mol·L-1葡萄糖、5 mol·L-1半乳糖酸鈣、6 mg·mL-1BSA、1 mol·L-1L-谷氨酰胺、2%必需氨基酸、1%非必須氨基酸)中洗3次后，放入前期培養(yǎng)液滴中進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后，將卵裂至4-～8-細(xì)胞的胚胎移至后期培養(yǎng)液(含109.5 mol·L-1NaCl、3.1 mol·L-1KCl、26.2 mol·L-1NaHCO3、0.8 mol·L-1MgCl2·6H2O、1.19 mol·L-1KH2PO3、0.4 mol·L-1丙酮酸鈉、1.5 mol·L-1葡萄糖、5 mol·L-1半乳糖酸鈣、10% FBS、1 mol·L-1L-谷氨酰胺、2%必需氨基酸、1%非必須氨基酸)滴中，48 h后半量更換胚胎培養(yǎng)液。第7天獲得囊胚。

1.5 胚胎的免疫熒光染色

固定和通透：培養(yǎng)7 d后獲得的牛體外受精囊胚用37 ℃、0.5% PBS-BSA(含有0.5%BSA的PBS溶液)清洗3次，每次2 min。2%多聚甲醛固定囊胚20 min，并于通透液(含0.5% Triton X-100和0.05% Tween-20的PBS溶液)中室溫處理30 min，按照每枚囊胚20 μL通透液。0.5%PBS-BSA于室溫清洗經(jīng)通透處理的囊胚3次，每次2 min。

囊胚CDX2蛋白的變性和封閉：取出囊胚，在1 mol·L-1HCl中室溫處理30 min，然后迅速轉(zhuǎn)移至100 mmol·L-1TrisHCl中，室溫處理20 min。處理后室溫下使用0.5% PBS-BSA中清洗3次，每次5 min。將囊胚移至封閉液(含10% 山羊血清和0.05% Tween-20的PBS溶液)中，4 ℃封閉過夜。

一抗孵育：取出囊胚放入1∶500封閉液稀釋的一抗中，37 ℃孵育2 h。二抗孵育：一抗孵育完成后，囊胚用0.5% PBS-BSA中洗3次，每次10 min以上。然后放入1∶500封閉液稀釋的二抗中，室溫避光孵育2 h。

囊胚細(xì)胞核染色：用0.5% PBS-BSA中清洗囊胚3次，每次10 min。然后將囊胚于20 μmol·L-1Hochest33342中室溫孵育10 min，取出囊胚并使用0.5% PBS-BSA中洗3次后備用，該過程需要在避光條件下完成，以防止熒光淬滅。

壓片及拍照：取抗淬滅劑DABCO 5 μL滴于載玻片，用口吸管將1～3枚囊胚放在DABCO液滴上，并且在液滴附近點(diǎn)少量凡士林以固定蓋玻片。將蓋玻片輕輕壓在液滴上，與凡士林充分接觸并適當(dāng)施加壓力使囊胚充分延展，切忌側(cè)向滑動(dòng)載玻片。將囊胚放于熒光顯微鏡下觀察，并用CCD系統(tǒng)拍照。藍(lán)色熒光使用UV光激發(fā)(EX 330-380，DM 400)、綠色熒光使用藍(lán)光激發(fā)(EX 450-490，DM 505)、紅色熒光使用綠光激發(fā)(EX 510-560，DM 575)。

1.6 PI/Hochest33342鑒定滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)

洗滌和通透：培養(yǎng)至7 d的囊胚室溫下使用含0.1%PVA的PBS溶液洗滌3次以上，然后將胚胎轉(zhuǎn)移至含有0.5%Triton X-100的PBS溶液中進(jìn)行通透，精確計(jì)時(shí)20 s后，迅速將囊胚移至含0.1% PVA的PBS溶液中洗滌。

PI/Hochest33342著色：將胚胎移入20 μg·mL-1PI溶液中進(jìn)行囊胚最外層細(xì)胞的染色，共染色50 s，迅速取出囊胚清洗3次以上，然后將囊胚于20 μmol·L-1Hochest 33342中室溫孵育10 min，進(jìn)行總細(xì)胞數(shù)染色。

壓片及拍照：方法同1.5。

1.7 TUNEL檢測凋亡細(xì)胞數(shù)

固定和通透：方法同1.5。

TUNEL 染色：將胚胎洗滌3次后，放入TUNEL工作液(InsituCell Death Detection Kit，Roche，瑞士)在38.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h。取出胚胎洗滌3次后，用20 μmol·L-1Hochest33342室溫孵育10 min，然后進(jìn)行壓片拍照，壓片拍照過程同1.5。

1.8 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用體外受精方法獲得牛囊胚，在體外培養(yǎng)過程中分別統(tǒng)計(jì)囊胚的卵裂率和囊胚率。其中，卵裂率=卵裂胚胎/卵母細(xì)胞總數(shù)，囊胚率=囊胚個(gè)數(shù)/卵母細(xì)胞總數(shù)。然后分別對(duì)囊胚進(jìn)行傳統(tǒng)雙重?zé)晒馊旧腿孛庖邿晒馊旧町悾容^每種染色方法準(zhǔn)確性、染色效果和所需時(shí)間。雙重染色設(shè)計(jì)為兩組，一組為PI/Hochest33342鑒定滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)，另一組為TUNEL檢測凋亡細(xì)胞數(shù)。

三重免疫熒光染色共設(shè)計(jì)3個(gè)方案，方案A：分別孵育CDX2一抗與caspase-3一抗，再分別孵育Alexa Fluor 488二抗和Alexa Fluor 594二抗；方案B：共同孵育CDX2一抗與caspase-3一抗，再分別孵育Alexa Fluor 488二抗和Alexa Fluor 594二抗；方案C：共同孵育CDX2一抗與cleaved caspase-3一抗，然后共同孵育 Alexa Fluor 488二抗和Alexa Fluor 594二抗。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每次至少10個(gè)囊胚進(jìn)行染色。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例(ICM/TCN)=(總細(xì)胞數(shù)-滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)，凋亡細(xì)胞比例(Apoptotic cells ratio，ACR)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

囊胚細(xì)胞使用Photoshop CS5(Adobe，美國)計(jì)數(shù)功能進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SAS9.2(SAS Institute，美國)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牛體外受精囊胚的獲得

共采集50對(duì)牛卵巢，收集430枚卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，體外受精胚胎卵裂率為81%，囊胚率42%，從囊胚中挑選擴(kuò)張囊胚160枚，進(jìn)行后續(xù)的染色試驗(yàn)(圖1)。

2.2 牛擴(kuò)張囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)

免疫熒光染色，分別對(duì)牛囊胚總細(xì)胞(藍(lán)色)、滋養(yǎng)層細(xì)胞(綠色)和凋亡細(xì)胞(紅色)進(jìn)行計(jì)數(shù)，其中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)(ICM)=總細(xì)胞數(shù)(Total cell number，TCN)-滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)(TE)。結(jié)果(表1)顯示，不同染色方法獲得的囊胚總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞比例間差異均不顯著(P>0.05)；對(duì)于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例，PI/Hochest33342染色組顯著低于其余各組(P<0.05)，而其余各組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 牛卵母細(xì)胞、2-細(xì)胞胚胎及囊胚Fig.1 Bovine oocytes，2-cell stage embryos and blastocysts

表1 不同染色方法獲得的牛囊胚總細(xì)胞數(shù)、內(nèi)細(xì)胞比例和凋亡比例

Table 1 The TCN，ICM/TCN and ACR of bovine blastocysts using different methods

組別Groups囊胚數(shù)No．ofblastocysts染色用時(shí)/hStainingduration總細(xì)胞數(shù)TCN內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例/%ICM/TCN凋亡細(xì)胞比例?/%ACR方案AProtocolA301685．48±15．26a39．91±11．51a6．81±4．01a方案BProtocolB301487．67±16．15a42．65±10．91a5．81±3．12a方案CProtocolC301285．91±17．11a39．88±8．51a6．69±2．76aPI/Hochest3334230190．33±7．51a30．97±15．6b———TUNEL30283．67±6．03a———6．77±4．20a

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。*由于凋亡細(xì)胞比例均小于30%，服從二項(xiàng)分布，因此需要進(jìn)行反正弦代換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

In the same column，values with same letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)，while with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05).*ACR was less than 30%，which obey the binomial distribution and so the arcsine transformation should be done before statistics

2.3 牛擴(kuò)張囊胚不同熒光染色效果的比較

采用不同熒光染色方法，囊胚細(xì)胞均清晰可辨(圖2)。在三重和雙重染色方法中，均采用Hochest33342進(jìn)行囊胚總細(xì)胞數(shù)的標(biāo)記，呈現(xiàn)藍(lán)色。對(duì)于滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)，三重染色方法用攜帶Alexa Fluor 488熒光基團(tuán)的二抗進(jìn)行標(biāo)記而呈現(xiàn)綠色；雙重染色方法中滋養(yǎng)層細(xì)胞被通透打孔后,PI染料進(jìn)入胞內(nèi)而呈現(xiàn)紅色，但TUNEL方法則不能區(qū)分滋養(yǎng)層細(xì)胞。對(duì)凋亡細(xì)胞TUNEL染色方法中，采用攜帶有FITC的dUTP進(jìn)入胞內(nèi)呈現(xiàn)綠色，而三重染色方法則Alexa Fluor 594熒光基團(tuán)而呈現(xiàn)紅色；而PI/Hochest33342方法則不能標(biāo)記凋亡細(xì)胞?？梢?，三重免疫熒光染色可在同一枚胚胎顯示3種顏色，標(biāo)記3類細(xì)胞。另外，通過三重染色方法可明確凋亡細(xì)胞的發(fā)生位置，即確定凋亡發(fā)生在滋養(yǎng)層細(xì)胞還是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，對(duì)胚胎的后期發(fā)育和胚胎質(zhì)量的評(píng)估是非常重要的；而TUNEL方法雖可以判斷凋亡細(xì)胞在整個(gè)囊胚所處位置，但無法區(qū)分其屬于滋養(yǎng)層細(xì)胞還是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。

圖2 不同染色方案獲得的牛囊胚細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞和凋亡細(xì)胞(比例尺：100 μm)Fig.2 Bovine blastocysts cells，TE and apoptotic cells using different stain methods(The scale bar：100 μm)

3 討 論

CDX2蛋白是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物囊胚中僅存在于滋養(yǎng)層細(xì)胞。CDX2蛋白含有一個(gè)易被酸溶解的基團(tuán)，且該基團(tuán)由組蛋白和非組蛋白組成，因此，有必要對(duì)CDX2蛋白進(jìn)行酸處理以暴露CDX2的抗原決定簇[10]。另外，堿性溶液對(duì)于細(xì)胞核單克隆抗體的抗原修復(fù)作用明顯[11]，F(xiàn).D′Amico等[12]研究證明，TrisHCl對(duì)于抗原修復(fù)的作用是最理想的，因此，本試驗(yàn)使用1 mol·L-1HCl處理以暴露CDX2的抗原決定簇，用pH約為8.4的TrisHCl進(jìn)行抗原修復(fù)。

caspase-3蛋白為caspase蛋白家族中的一員，與caspase-8和caspase-9蛋白互作[13]。caspase-3在程序性凋亡細(xì)胞中可通過外在(程序性死亡配體)和內(nèi)在(線粒體)兩條途徑進(jìn)行激活[14-15]，caspase-3一般以未激活酶原形式存在，經(jīng)水解加工，保守的天冬氨酸殘基形成一大一小兩個(gè)亞基，進(jìn)而被激活成為cleaved caspase-3，而激活狀態(tài)下的caspase-3正是細(xì)胞程序性凋亡的標(biāo)志，因此選用cleaved caspase-3抗體來標(biāo)記凋亡細(xì)胞。

囊胚質(zhì)量是囊胚冷凍與移植后成活率的重要因素[16]，因此測定囊胚總細(xì)胞數(shù)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例及凋亡細(xì)胞比例有著重要的意義。本試驗(yàn)選取同批次生產(chǎn)的囊胚，且染色所用胚胎均選擇擴(kuò)張囊胚，在理論上各個(gè)囊胚在形態(tài)學(xué)上是非常接近的。本試驗(yàn)結(jié)果中，擴(kuò)張囊胚的總細(xì)胞數(shù)為85.48～87.67，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例為39.88%～42.65%，凋亡細(xì)胞比例為5.81%～6.81%，這與S.Iwasaki染色結(jié)果接近，符合牛擴(kuò)張囊胚的正常指標(biāo)[17]。

本研究中，三重?zé)晒馊旧碗p重?zé)晒馊旧褂肏ochest33342進(jìn)行總細(xì)胞數(shù)的標(biāo)記[18]，且各組之間差異不顯著(P>0.05)。根據(jù)染色效果，使用Hochest33342能清晰辨別出單個(gè)細(xì)胞，因此使用Hochest33342能準(zhǔn)確對(duì)囊胚總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。比較內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例，PI/Hochest33342染色結(jié)果顯著低于其余各組(P<0.05)，其余各組之間差異不顯著(P>0.05)，這是因?yàn)镻I/Hochest33342染色原理是破壞囊胚最外層細(xì)胞膜的完整性，并使用PI進(jìn)行標(biāo)記成紅色，Hochest33342用來標(biāo)記所有細(xì)胞[19]。該方法能快速鑒別滋養(yǎng)層細(xì)胞，但由于該方法受通透時(shí)間、PI染色時(shí)間和囊胚細(xì)胞數(shù)多少的影響，染色的效果不穩(wěn)定，重復(fù)性差。本試驗(yàn)中，使用PI/Hochest33342進(jìn)行染色，結(jié)果顯示內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例顯著低于其他組(P<0.05)，這可能是由于通透時(shí)間過長，PI染色時(shí)間過長造成的，該方法雖然能夠縮短操作時(shí)間，但并不能反映囊胚的真實(shí)形態(tài)，且不能鑒定囊胚的凋亡細(xì)胞，也成為PI/Hochest33342染色的一大缺陷。

比較凋亡細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)各組間差異不顯著(P>0.05)。W.R.Duan等[20]研究表明，激活狀態(tài)下的caspase-3和TUNEL分別在不同層面體現(xiàn)細(xì)胞的程序性死亡，但激活后的caspase-3與真實(shí)的細(xì)胞凋亡有更好的相關(guān)性，caspase-3應(yīng)是最優(yōu)選擇。但試驗(yàn)方法上，二者均可作為細(xì)胞凋亡檢測使用。雖然TUNEL染色時(shí)間較短，但基于雙重?zé)晒馊旧腡UNEL染色法并不能體現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例，也不能確定凋亡細(xì)胞的具體位置，而凋亡發(fā)生在滋養(yǎng)層細(xì)胞還是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞則是體外胚胎后期發(fā)育能力和質(zhì)量評(píng)估的重要因素。因此通過比較，三重免疫熒光染色方案在鑒定牛胚胎質(zhì)量方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。

在三重?zé)晒馊旧母鱾€(gè)方案中，方案A采用一抗分別孵育，二抗分別孵育，整個(gè)染色過程持續(xù)約16 h；方案B采用兩種一抗按照1∶1比例混合后共同孵育，然后分別與兩種二抗孵育，整個(gè)染色過程持續(xù)約14 h；方案C采用兩種一抗按照1∶1比例混合后共同孵育，兩種二抗按照1∶1比例混合后共同孵育，整個(gè)染色過程持續(xù)12 h。方案A過程較為繁瑣，持續(xù)時(shí)間也較長，同時(shí)也可能造成熒光淬滅而導(dǎo)致熒光照片不清晰。方案C則縮短了染色時(shí)間，染色程序也進(jìn)行了簡化。方案B介于二者之間。據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，方案A、B和C均能很好地標(biāo)記囊胚內(nèi)各類細(xì)胞。另外，將兩種抗體同時(shí)孵育在Western blot試驗(yàn)中已有應(yīng)用[21]，在Western blot過程中，可將兩種分子量差距較大且來源不同的兩種抗體共同孵育，以節(jié)省時(shí)間并保證染色效果。本研究中，方案B均將兩種一抗混合后共同孵育，均很好地顯示顏色，且沒有非特異性結(jié)合，這可能是由于兩種一抗來源不同，其中CDX2一抗來源于鼠，cleaved caspase 3 一抗來源于兔，且CDX2蛋白已經(jīng)過抗原決定簇暴露和抗原修復(fù)，兩種一抗均很好地與目的蛋白結(jié)合，然后分別孵育兩種二抗，降低二抗發(fā)生非特異性結(jié)合的概率。在方案C中，按照1∶1比例混合Alexa Fluor 488(羊抗鼠)和Alexa Fluor 594(羊抗兔)，兩種二抗均很好地與一抗結(jié)合，且無非特異性結(jié)合，這證明對(duì)于可靠性較強(qiáng)的二抗來說，均能很好地與一抗識(shí)別并結(jié)合，能有效降低二抗的非特異性結(jié)合，因此也能顯示出較好的染色效果。

綜上表明，通過標(biāo)記同一枚囊胚的CDX2蛋白及caspase-3來鑒別滋養(yǎng)層細(xì)胞和凋亡細(xì)胞并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估是可行的；結(jié)合染色方案的準(zhǔn)確性、染色效果及染色程序復(fù)雜程度等因素綜合分析，認(rèn)為兩種一抗或兩種二抗共同孵育的染色方法準(zhǔn)確性較高、染色效果較好且用時(shí)最短，極大地節(jié)省了人力物力，為最佳方案。

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(編輯 程金華)

A Method Used for Differential Staining and Apoptosis Cell Staining in Bovine Blastocyst

SUN Wei-jun1，YU Xue-ying1，2，HU Ting-xi1，3，GUO Qin-qin1，LIU Yan1，HAO Hai-sheng1，ZHAO Xue-ming1，ZHU Hua-bin1，DU Wei-hua1*

(1.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；2.HebeiUniversityofEngineering，Handan056000，China；3.GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

To evaluate the quality of bovine blastocysts efficiently and accurately，a triple immunofluorescence staining method was established in bovine blastocyst.The trophectoderm(TE) cells and apoptotic cells were identified with labeling of CDX2 protein and caspase-3 protein，respectively.All of nuclei in blastocyst cells were stained with Hochest 33342.Triple staining was designed as 3 schemes.PI was used to stain nuclei of TE cells and apoptotic cells were detected by TUNEL method in double staining.The results showed that the triple immunofluorescence staining，with 3 schemes，could distinguish the TE and apoptotic cells accurately.Additionally，co-incubation of 2 first antibodys/second antibodys was the most optimal method to triple staining in terms of accuracy，efficiency and stain duration.Therefore，in same blastocyst，identification the TE and apoptotic cells by labeling CDX2 and caspase-3 protein respectively was available to evaluate the quality of bovine blastocysts.Also，there were great advantages in triple staining compared with double staining.

blastocyst quality；immunofluorescence triple-staining assay；CDX2；caspase-3

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.008

2015-02-16

基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目(2013ywf-zd-2)；國家科技支撐項(xiàng)目(2012BAD12B01-2)；家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(ASTIP-IAS06-2015)

孫尉峻(1989-)，男，河北張家口人，碩士生，主要從事家畜胚胎工程研究，E-mail：sunweijunet@163.com

*通信作者：杜衛(wèi)華，博士，副研究員，E-mail：dwh@iascaas.net.cn

S823；S813

A

0366-6964(2015)11-1967-07