牛miR-320a的靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

郭云濤，張秀秀，苗向陽(yáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牛miR-320a的靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

郭云濤，張秀秀，苗向陽(yáng)*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

旨在對(duì)bta-miR-320a的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析，探索其影響牛脂肪沉積的作用機(jī)制。本試驗(yàn)利用Promoter Scan、TargetScan、DAVID、Cytoscape等生物信息學(xué)軟件和miRBase、Ensembl、NCBI、miRWalk等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)bta-miR-320a進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)、保守性分析、靶基因預(yù)測(cè)、基因本體論富集分析和信號(hào)通路富集分析。結(jié)果表明，miR-320(a)在各物種間非常保守，bta-miR-320a啟動(dòng)子區(qū)域有SP1等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，獲得的84個(gè)靶基因主要參與負(fù)調(diào)控細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，涉及p53、細(xì)胞周期和MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。由此推測(cè)，bta-miR-320a受到SP1等多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，它可能通過(guò)對(duì)MAPK、細(xì)胞周期和p53信號(hào)通路中靶基因TP53、MAPK1等的抑制作用調(diào)控牛脂肪細(xì)胞分化，進(jìn)而影響了牛的脂肪沉積。

牛；bta-miR-320a；靶基因；生物信息學(xué)

microRNA(miRNA，微RNA)是真核生物中廣泛存在的一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)約21～22 nt，它可以通過(guò)特異性堿基互補(bǔ)的方式與靶基因mRNA的3′-UTR結(jié)合，抑制靶mRNA翻譯或誘導(dǎo)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[1-3]。自從第一個(gè)miRNAlin-4在線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[4]，越來(lái)越多的miRNA被鑒定出來(lái)，目前最權(quán)威的miRbase(http：//www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的miRNA條目已達(dá)28 645條，并且數(shù)目在逐年增長(zhǎng)，庫(kù)中收錄了牛的808條miRNAs前體，793條成熟體。作為近年來(lái)研究的熱門(mén)，miRNA參與了各種生命過(guò)程的調(diào)控，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和新陳代謝等，在生物體生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病發(fā)生等過(guò)程中扮演著重要角色[5]。在肉牛生產(chǎn)中，胴體中的皮下和肌內(nèi)脂肪含量是肉品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，肌內(nèi)脂肪不足和皮下脂肪過(guò)多是對(duì)牛肉品質(zhì)的最大挑戰(zhàn)，研究肉牛脂肪沉積過(guò)程的分子機(jī)制對(duì)于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛肉至關(guān)重要。脂肪沉積伴隨著脂肪細(xì)胞體積增大和數(shù)目增加，脂肪細(xì)胞數(shù)目增加與脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，miRNA參與了脂肪細(xì)胞分化調(diào)控[6]，故研究脂肪細(xì)胞分化中的miRNA對(duì)于肉牛脂肪沉積研究有重要的理論和實(shí)際意義。

miR-320a屬于miR-320家族，家族內(nèi)有許多成員，如人的miR-320有5個(gè)高度同源的種類(lèi)：hsa-miR-320a/b/c/d/e，牛的miR-320(Bta-miR-320)有兩種高度同源的類(lèi)型：bta-miR-320a(MIMAT0003534)和bta-miR-320b(MIMAT0011991)。目前，關(guān)于miR-320家族的研究多集中在癌癥方面，miR-320可以抑制癌細(xì)胞增殖，在結(jié)腸直腸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌骨肉瘤等多種惡性腫瘤侵襲和遷移中，miR-320都出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)。H.Y.Ling等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-320在3T3-L1脂肪細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控胰島素-PI3-K信號(hào)通路調(diào)控了胰島素抵抗，miR-320可能參與了脂肪組織中的生物過(guò)程調(diào)控。D.Hamam等[8]在研究人骨骼肌多功能干細(xì)胞(Human mesenchymal stem cells，hMSCs)向脂肪細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-320家族發(fā)生了顯著上調(diào)，進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)hsa-miR-320c通過(guò)靶向抑制RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)影響了脂肪細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)不同脂肪沉積能力的兩個(gè)品種牛的皮下脂肪組織小RNA進(jìn)行了高通量測(cè)序，在分析結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，bta-miR-320a在脂肪沉積能力強(qiáng)的牛種中發(fā)生了顯著的下調(diào)表達(dá)(|log2FC|>1，P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)，且在兩個(gè)牛種中表達(dá)豐度都非常高(RPKM>500)，推測(cè)bta-miR-320a可能在脂肪沉積中發(fā)揮了重要作用。目前，最權(quán)威的miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)bta-miR-320a的功能沒(méi)有注釋?zhuān)琺iR-320a對(duì)牛脂肪細(xì)胞分化的影響機(jī)制尚不清楚，因此，本試驗(yàn)旨在利用生物信息學(xué)的方法對(duì)bta-miR-320a進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(Transcription factor binding site，TFBS)預(yù)測(cè)、同源性和進(jìn)化分析、靶基因預(yù)測(cè)、靶基因的基因本體論(Gene ontology，GO)和KEGG信號(hào)通路(KEGG Pathway)富集分析，以了解bta-miR-320a可能的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控位點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系及其參與調(diào)控的生物過(guò)程和信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)其在牛脂肪細(xì)胞分化中的功能進(jìn)行探索，為bta-miR-320a在牛脂肪沉積中的研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)預(yù)測(cè)

在Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出bta-miR-320a的兩條前體，取其上游10 kb的序列，利用Promoter Scan Version 1.7(http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)、JASPAR CORE Vertebrate(http：//jaspardev.genereg.net/)和PATCH public 1.0(http：//www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch.cgi)3個(gè)在線預(yù)測(cè)軟件做TFBS預(yù)測(cè)。

1.2 miR-320(a)序列保守性分析

從miRBase中檢索出牛(Bostaurus，bta)、大猩猩(Gorillagorilla，ggo)、人(Homosapiens，hsa)、獼猴(Macacamulatta，mml)、黑猩猩(Pantroglodytes，ptr)、婆羅州猩猩(Pongopygmaeus，ppy)、灰倉(cāng)鼠(Cricetulusgriseus，cgr)、大鼠(Rattusnorvegicus，rno)、小鼠(Musmusculus，mmu)、山羊(Caprahircus，chi)、狗(Canisfamiliaris，cfa)的miR-320(a)序列，分析其保守性。

1.3 Bta-miR-320a的靶基因預(yù)測(cè)和后續(xù)分析靶基因的獲得

選擇TargetScan 6.2(http：//www.targetscan.org/vert_61/)、PicTar(http：//pictar.mdc-berlin.de/)和miRanda(閾值mirSVR score<-1，http：//www.microrna.org/microrna/getDownloads.do)3種計(jì)算方法預(yù)測(cè)bta-miR-320a的靶基因，取3者預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，然后結(jié)合miRwalk(http：//www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/mirnatargetpub.html)上miR-320a的已驗(yàn)證靶標(biāo)以及文獻(xiàn)中已報(bào)道m(xù)iR-320a靶基因，共同組成bta-miR-320a的靶基因集合。

1.4 靶基因的GO富集分析

將bta-miR-320a的預(yù)測(cè)靶基因集合用Gene Ontology進(jìn)行富集分類(lèi)，選擇所有蛋白編碼基因作為背景基因，用DAVID[9-10]工具(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)對(duì)bta-miR-320a預(yù)測(cè)的靶基因集合進(jìn)行基于生物學(xué)過(guò)程(Biological process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)3個(gè)層面的Gene Ontology注釋層次分類(lèi)及富集分析，通過(guò)Fsiher Exact Test計(jì)算P值，以P<0.05為顯著性閾值得到基因集合相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)意義的GO條目，并對(duì)P值進(jìn)行校正，標(biāo)準(zhǔn)是Benjamini<0.05。

1.5 靶基因的KEGG Pathway富集分析

用DAVID工具對(duì)bta-miR-320a預(yù)測(cè)的靶基因集合進(jìn)行基于KEGG的生物通路富集分析，通過(guò)Fsiher Exact Test計(jì)算P值，以P<0.05為顯著性閾值得到基因集合相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)意義的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并對(duì)P進(jìn)行校正，標(biāo)準(zhǔn)是Benjamini<0.05。

1.6 TF-miRNA-靶基因作用網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子、靶基因和通路富集分析結(jié)果，使用Cytoscape3.2.0軟件對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖繪制。

2 結(jié) 果

2.1 TFBS預(yù)測(cè)結(jié)果

使用3種在線軟件分別對(duì)兩條bta-miR-320a前體(表1)的上游10 kb區(qū)域TFBS進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們啟動(dòng)子區(qū)域有致癌基因JUN(Jun proto-oncogene，JUN或AP-1)、增強(qiáng)子激活結(jié)合蛋白2(Activating enhancer binding protein 2 alpha，AP-2)、轉(zhuǎn)錄因子SP1(Sp1 transcription factor，SP1)、八聚體結(jié)合蛋白(Major octamer-binding protein，OCT)、過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG)、成肌分化因子1(Myogenic differentiation 1，MYOD1)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中SP1、AP-2、PPARG、MYOD1和CREB參與了脂肪細(xì)胞增殖分化和脂代謝調(diào)控。

表1 bta-miR-320a的兩條前體信息

Table 1 Information of 2 bta-miR-320a precursors

名稱NameEnsembl登錄號(hào)EnsemblaccessionNo．染色體Chromosome位置/bpLocation長(zhǎng)度/bpLengthbta?mir?320a?1ENSBTAG00000029761870060384～7006046582bta?mir?320a?2ENSBTAG000000297602015213924～1521400582

2.2 保守性分析

從牛、大猩猩、人等11個(gè)物種的miR-320(a)序列(表2)可以看出，miR-320a在進(jìn)化中非常保守，成熟體序列完全一致。

表2 不同物種的miR-320a序列

Table 2 Sequences of miR-320a from different species

名稱Name登錄號(hào)AccessionNo．序列(5′?3′)Sequencebta?miR?320aMIMAT0003534AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAggo?miR?320aMIMAT0024080AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAhsa?miR?320aMIMAT0000510AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAmml?miR?320aMIMAT0006263AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAptr?miR?320aMIMAT0008093AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAppy?miR?320aMIMAT0015821AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAcgr?miR?320aMIMAT0023906AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGArno?miR?320?3pMIMAT0000903AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAmmu?miR?320?3pMIMAT0000666AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAchi?miR?320?3pMIMAT0036132AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGAcfa?miR?320MIMAT0006658AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA

2.3 靶基因預(yù)測(cè)

選擇TargetScan、PicTar和miRanda 3種計(jì)算方法預(yù)測(cè)bta-miR-320a的靶基因，取3者的交集共得40個(gè)基因，合并已經(jīng)證實(shí)為miR-320a的 30個(gè)來(lái)自miRwalk數(shù)據(jù)庫(kù)的靶基因和已發(fā)表研究證實(shí)的19個(gè)靶基因，除去5個(gè)重復(fù)，獲得共計(jì)84個(gè)靶基因作為后續(xù)GO和KEGG pathway分析的靶基因集合(圖1，表3)。

2.4 GO富集分析

通過(guò)對(duì)靶基因集合進(jìn)行GO富集分析(表4～表6)可知bta-miR-320a的靶基因集富集在負(fù)調(diào)控細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)、細(xì)胞發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育和細(xì)胞凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中，作用的位置主要在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞器內(nèi)腔中，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動(dòng)和酶結(jié)合的分子作用。其中生物學(xué)過(guò)程中的細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和分化條目下的基因可能會(huì)對(duì)脂肪細(xì)胞的增殖、分化產(chǎn)生影響。

圖1 3種靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)bta-miR-320a的靶基因預(yù)測(cè)情況Fig.1 The prediction results of bta-miR-320a target genes using 3 kinds of bioinformatics tools

表3 bta-miR-320a的靶基因統(tǒng)計(jì)

Table 3 Statistics of target genes of bta-miR-320a

來(lái)源Source數(shù)目Number靶基因列表ListoftargetgenesPicTar(P)345TargetScan(T)669miRanda(M)396Research(R)19miRWalk(W)30P∩T∩M40(P∩T∩M)∪R∪W84ARF1，ARL8B，BANP，C14orf147，CDH20，CDK13，COPS2，DAZAP1，DBN1，DHX15，DNER，ELL2，F(xiàn)AM49B，F(xiàn)LRT3，GABPB1，GPBP1，KCNS3，KLHL36，LMO3，LPPR1，MLLT3，MN1，MSI2，PBX3，PCDHA1，PCDHA4，PLXNC1，PPP2R2C，RAI2，RAP1A，RASA1，SLITRK3，SPOPL，STAG2，TMEM108，TPM3，XPO1，YWHAZ，ZIC3，ZNF281，IL1A，BBC3，BRCA1，TAC1，MCL1，COX8A，TFRC，TP53，AQP1，TP73，AQP4，EZH2，ITCH，ETV6，EIF2C1，RCOR1，DICER1，LIN9，BCL2，BIRC5，POLR3D，REST，RUNX1，HSPB6，E2F1，HNF4A，PIK3R1，GNAI1，TFRC，RAC1，MAPK1，ITGB3，HSP20，F(xiàn)AS，ARPP19，RUNX2，NRP1，ETS2，CDKN1C，CDKN1A，MIB1，PAX6，YWHAH，ZWILCH，HSC70

P∩T∩M表示3種不同靶基因預(yù)測(cè)軟件PicTar、TargetScan和miRanda預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，(P∩T∩M)∪R∪W表示將3個(gè)預(yù)測(cè)軟件獲得的交集與已發(fā)表文獻(xiàn)和miRWalk已驗(yàn)證靶標(biāo)取并集作為后續(xù)分析的靶基因集合

P∩T∩M means the results of prediction using 3 different kinds of target gene prediction sofwares，(P∩T∩M)∪R∪W means the group of target genes used for the following analysis which come from the intersection of 3 target gene prediction softwares，target genes in papers published and those verified in miRWalk database

2.5 KEGG Pathway富集分析

為了獲取更多關(guān)于miR-320a在功能方面的信息，本試驗(yàn)在GO 注釋分類(lèi)的基礎(chǔ)上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)對(duì)基因集合中的84個(gè)基因進(jìn)行生物通路富集分析。結(jié)果顯示，在經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG中bta-miR-320a預(yù)測(cè)靶基因集合顯著富集于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、蛋白激酶(MAPK)5個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和10個(gè)疾病相關(guān)信號(hào)通路(圖2)，其中與生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系密切的MAPK信號(hào)通路也發(fā)生了顯著性富集(P<0.05，Benjamini=0.062)，可能具有假陽(yáng)性。

表5 bta-miR-320a靶基因集在細(xì)胞組分(CC)層面富集結(jié)果

Table 5 Function enrichment of bta-miR-320a predicted target genes in CC

GO條目GOterm數(shù)目CountsP值P?value誤判率Benjamini基因列表ListofgenesNuclearlumen190．00010．0110E2F1，COPS2，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BIRC5，BRCA1，POLR3D等Nucleoplasm140．00020．0140E2F1，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BRCA1，POLR3D，ELL2，MAPK1等Intracellularorganellelumen190．00080．0490E2F1，COPS2，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BIRC5，BRCA1，POLR3D等Organellelumen190．00100．0480E2F1，COPS2，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BIRC5，BRCA1，POLR3D等Membrane?enclosedlumen190．00130．0480E2F1，COPS2，XPO1，MCL1，LIN9，EZH2，TP53，BIRC5，BRCA1，POLR3D等

表6 bta-miR-320a靶基因集在分子功能(MF)層面富集結(jié)果

Table 6 Function enrichment of bta-miR-320a predicted target genes in MF

GO條目GOterm數(shù)目CountsP值P?value誤判率Benjamini基因列表ListofgenesTranscriptionregulatoractivity200．00010．0230E2F1，ZNF281，COPS2，EZH2，TP53，PAX6，REST，BRCA1，TP73，ELL2，CDKN1C等Enzymebinding110．00030．0280MAPK1，YWHAH，BCL2，RAC1，TP53，RAP1A，BIRC5，F(xiàn)AS，RASA1，BRCA1，PIK3R1

Y軸為-log2P-value，X軸為富集到的信號(hào)通路條目，Y越大，富集越顯著(P<0.05，Benjamini<0.05)The Y-axis means -log2P-value，X-axis means the pathway terms enriched(P<0.05，Benjamini<0.05)圖2 bta-miR-320a靶基因的KEGG 通路分析結(jié)果Fig.2 KEGG enrichment result of bta-miR-320a predicted target genes

2.6 轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-靶基因作用網(wǎng)絡(luò)

轉(zhuǎn)錄因子SP1、AP-2、PPARG、MYOD1和CREB調(diào)控了bta-miR-320a基因的轉(zhuǎn)錄，bta-miR-320a通過(guò)TP53、MAPK1等靶基因參與了MAPK、p53和細(xì)胞周期信號(hào)通路(圖3)。

三角代表轉(zhuǎn)錄因子，圓形代表bta-miR-320a，方塊表示靶基因The triangles represent transcription factors，the center is bta-miR-320a，the squares means target genes圖3 轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-靶基因作用關(guān)系圖Fig.3 TF-miRNA-target gene network

3 討 論

在生物體內(nèi)，1個(gè)miRNA可能作用于多個(gè)靶基因，也可能是多個(gè)miRNA調(diào)控1個(gè)靶基因，這種作用構(gòu)成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在某些信號(hào)的刺激下，從整體上調(diào)控有機(jī)體的生命活動(dòng)。 因此，miRNA的作用是通過(guò)其復(fù)雜的靶基因協(xié)同調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，僅僅靠試驗(yàn)手段來(lái)研究miRNA已變得相當(dāng)困難。靶基因數(shù)量和種類(lèi)較多，生物信息學(xué)在miRNA的研究中扮演的角色越來(lái)越重要。生物信息學(xué)方法可以對(duì)海量和復(fù)雜信息進(jìn)行分析和處理，為下一步試驗(yàn)提供指導(dǎo)，包括編碼miRNA基因上游的TFBS預(yù)測(cè)、miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及靶基因的GO分析、信號(hào)通路分析等。miRanda、TargetScan和PicTar是目前較流行的3種miRNA靶基因預(yù)測(cè)計(jì)算方法。miRanda是最早的一種預(yù)測(cè)算法，有較好的檢出率，預(yù)測(cè)的靶基因數(shù)量較多，但假陽(yáng)性率也較高；TargetScan和PicTar作為第二代預(yù)測(cè)算法，其預(yù)測(cè)靶基因的數(shù)量相對(duì)減少，但同時(shí)也增加了預(yù)測(cè)的精確度，降低了假陽(yáng)性率。雖然這3種不同的軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果不一樣，但同時(shí)采用這3種預(yù)測(cè)算法進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后取其交集部分，就能提高預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，減少假陽(yáng)性率。本試驗(yàn)在利用miRanda對(duì)bta-miR-320a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)將閾值設(shè)定為mirSVR score<-1，減少了假陽(yáng)性率，然后采用上述3種靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集部分，使靶基因的預(yù)測(cè)更加準(zhǔn)確。在進(jìn)行后續(xù)功能分析之前，綜合了miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)(2011)和近幾年來(lái)關(guān)于miR-320家族的研究中所確定的靶標(biāo)作為后續(xù)分析的靶基因集合，靶基因預(yù)測(cè)是進(jìn)行miRNA功能研究的基礎(chǔ)，采用上述策略鑒定出的靶基因保證了后續(xù)功能分析的全面和可靠性。

關(guān)于miR-320家族的功能研究多集中在癌癥方面。C.Shang等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-320a通過(guò)靶向抑制整合素β3(Integrin，beta 3，ITGB3)介導(dǎo)了膀胱癌的侵襲；miR-320a/c/d可靶向抑制G蛋白α抑制性多肽1(G protein alpha inhibiting activity polypeptide 1，GNAI1)表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的遷移和遷徙[12]；miR-320a亦可通過(guò)靶向抑制Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1)影響結(jié)腸直腸癌的發(fā)展[13]；在重癥肌無(wú)力病人中miR-320a下調(diào)表達(dá)，通過(guò)靶作用于絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[14]；在血紅素介導(dǎo)的紅細(xì)胞分化研究[15]中，miR-320a通過(guò)抑制其靶基因BTG3相關(guān)核蛋白(BTG3 associated nuclear protein，BANP)發(fā)揮了調(diào)控作用。由這些研究可以得知miR-320a是癌細(xì)胞和紅細(xì)胞分化中的抑制因子，推測(cè)它在牛脂肪細(xì)胞分化中可能也起到了抑制作用。

Bta-miR-320a靶基因集的GO注釋富集在負(fù)調(diào)控細(xì)胞分化、細(xì)胞周期等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程條目中，由此推測(cè),bta-miR-320a對(duì)牛脂肪細(xì)胞分化產(chǎn)生了負(fù)調(diào)控作用，從而抑制脂肪沉積。脂肪沉積能力強(qiáng)的牛種中bta-miR-320a下調(diào)表達(dá)，減弱了這種抑制作用，這與人們的預(yù)期相符。bta-miR-320a對(duì)牛脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控作用是通過(guò)對(duì)其靶基因如抑癌基因53(Tumor suppressor53，TP53或p53)、MAPK1等的抑制作用實(shí)現(xiàn)的。TP53編碼了一種具有轉(zhuǎn)錄激活、DNA結(jié)合功能的腫瘤抑制蛋白，介導(dǎo)了細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡、衰老、DNA損傷修復(fù)等生物過(guò)程，參與了MAPK、細(xì)胞周期和p53等多個(gè)信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。MAPK1屬于蛋白激酶家族，是MAPK信號(hào)通路中的重要成員，參與了細(xì)胞的增殖分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等廣泛的生物學(xué)過(guò)程。牛脂肪細(xì)胞由前體脂肪細(xì)胞增殖分化而來(lái)，前體脂肪細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂克隆增殖、生長(zhǎng)停滯和終末分化形成成熟的脂肪細(xì)胞，在這一過(guò)程中pRB-E2F、MAPK、SMAD/TGFβ、Wnt等信號(hào)通路發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本試驗(yàn)中，bta-miR-320a的靶基因富集在細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路、MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和10個(gè)疾病相關(guān)信號(hào)通路，其中細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路在真核生物有絲分裂細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要功能，MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路在真核生物中是一個(gè)高度保守的通路，它調(diào)控了包括細(xì)胞增殖、分化和遷移等各種功能，MAPK作為上游的通路也會(huì)對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生作用。靶基因之一的TP53參與了上述3條通路，在信號(hào)傳導(dǎo)中占據(jù)著樞紐位置，它在G1、S和 G2時(shí)相轉(zhuǎn)換中發(fā)揮調(diào)控作用。Q.Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠3T3L1前體脂肪細(xì)胞分化的有絲分裂克隆增殖階段，miR-17-92簇上調(diào)表達(dá)，激素誘導(dǎo)的miR-17-92過(guò)表達(dá)加速了3T3L1前體脂肪細(xì)胞分化，增加了甘油三脂積聚。針對(duì)這些現(xiàn)象，他們提出了一個(gè)模型：在激素誘導(dǎo)后3T3L1前體脂肪細(xì)胞中，miR-17-92表達(dá)量升高，抑制了其靶基因成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤樣2(Retinoblastoma-like 2，RB2/P130)表達(dá)，導(dǎo)致沒(méi)有足夠的RB2/P130與轉(zhuǎn)錄因子E2F(E2F transcription factor，E2F)形成二聚體來(lái)抑制E2F，活化狀態(tài)的E2F4和E2F5增加，激活了成視網(wǎng)膜瘤蛋白pRB-E2F信號(hào)通路，啟動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)周期。因此，miR-17-92簇在克隆增殖階段的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)了前體脂肪細(xì)胞分化。L.Chen等[17]用芯片技術(shù)研究大鼠脂肪組織來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞(Adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs)向成熟脂肪細(xì)胞分化時(shí)miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-363發(fā)生了最顯著的下調(diào)，ADSCs中過(guò)表達(dá)miR-363會(huì)引起克隆增殖和終末分化抑制，進(jìn)而確定miR-363是脂肪生成中的一個(gè)負(fù)調(diào)控者，可以靶向抑制E2F3的轉(zhuǎn)錄后翻譯水平，通過(guò)激活pRB-E2F抑制周期蛋白E(Cyclin E，CYCE)的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞從G1向S期的轉(zhuǎn)變也就抑制了前體脂肪細(xì)胞克隆增殖，從而抑制了細(xì)胞終末分化。C.Esau和L.Chen等[6，18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143能通過(guò)對(duì)其在MAPK信號(hào)通路中靶基因絲裂原活化蛋白激酶5(Mitogen-activated protein kinase 5，MAPK5)的抑制作用調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。miR-17-92、miR-363和miR-143等通過(guò)pRB-E2F和MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)了脂肪細(xì)胞分化，而pRB-E2F信號(hào)通路中的RB、E2F也是細(xì)胞周期通路的作用元件，因此推測(cè)，在牛脂肪細(xì)胞分化中，miR-320a通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期和p53信號(hào)通路中相關(guān)靶基因如TP53的靶向抑制，影響了這些通路信號(hào)的傳遞，進(jìn)而導(dǎo)致前體脂肪細(xì)胞有絲分裂克隆擴(kuò)增中G1-S-G2相位轉(zhuǎn)變的時(shí)序發(fā)生變化，從而影響了前體脂肪細(xì)胞分化。同時(shí)，它也對(duì)MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路中相關(guān)的分子組件進(jìn)行靶向抑制，對(duì)MAPK下游信號(hào)通路產(chǎn)生影響，調(diào)控脂肪細(xì)胞分化。bta-miR-320a基因啟動(dòng)子區(qū)域具有SP1、PPARG和MYOD1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這些轉(zhuǎn)錄因子與脂肪細(xì)胞增殖分化、脂代謝關(guān)系密切，可能會(huì)對(duì)miR-320a調(diào)控牛脂肪細(xì)胞分化產(chǎn)生影響。

本試驗(yàn)篩選出的靶基因還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。另外，在進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和功能分析時(shí)使用的條件比較嚴(yán)格，可以有效減少假陽(yáng)性率，提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，但同時(shí)會(huì)有一些漏篩率，還需找到更加準(zhǔn)確全面的方法對(duì)bta-miR-320a進(jìn)行后續(xù)分析?？傊驹囼?yàn)對(duì)miR-320a在牛脂肪沉積中的功能進(jìn)行了探索，挖掘出了SP1等多種轉(zhuǎn)錄因子、TP53和MAPK1等關(guān)鍵靶基因以及p53等重要信號(hào)通路，為后續(xù)的試驗(yàn)驗(yàn)證提供參考。

4 結(jié) 論

Bta-miR-320a受到SP1等多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，它可能通過(guò)對(duì)MAPK、細(xì)胞周期和p53信號(hào)通路中靶基因TP53、MAPK1等的抑制調(diào)控了牛脂肪細(xì)胞分化，進(jìn)而影響了牛的脂肪沉積。

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(編輯 郭云雁)

Target Gene Prediction and Bioinformatics Analysis of bta-miR-320a

GUO Yun-tao，ZHANG Xiu-xiu，MIAO Xiang-yang*

(InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

The prediction and analysis of bta-miR-320a target genes by bioinformatics were performed to explore its effect on the fat deposition in bovine.In this study，bioinformatics tools such as Promoter Scan，TargetScan，DAVID，Cytoscape and databases for example miRBase，Ensemble，NCBI，miRWalk，et al were used to perform the prediction of the transcription factor binding site and the analysis of its target genes，involved Gene ontology and KEGG pathway.As a result，miR-320(a) was very conservative among various species.There were many different transcription factor binding sites in the bta-miR-320a promoter area.Eighty-four target genes were obtained in total which involved in multiple biological processes such as negative regulation of cell differentiation，regulation of cell cycle and negative regulation of growth and participated in p53，cell cycle and MAPK signal pathways.We assumed that bta-miR-320a is regulated by different transcription factors，and it can also regulate the adipocyte differentiation and fat deposition in bovine by post transcriptional inhibiting of its target genes involved in p53，cell cycle and MAPK signal pathways.

bovine；bta-miR-320a；target gene；bioinformatics

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.006

2014-12-24

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2013ywf-yb-5；2013ywf-zd-2)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(ASTIP-IAS05)；轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2009ZX08008-004B；2008ZX08008-003)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z140)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30571339)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2004-院-1)

郭云濤(1988-)，男，河南南陽(yáng)人，碩士，主要從事轉(zhuǎn)基因與細(xì)胞工程研究，E-mail：yuntao008@126.com

*通信作者：苗向陽(yáng)，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事基因工程與功能基因組學(xué)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究，E-mail：mxy32@sohu.com

S823；S813.3

A

0366-6964(2015)11-1952-09