山羊骨骼肌中miR-133及其靶基因的表達規(guī)律與功能研究

凌英會，王麗娟，王康巖，李運生，丁建平，張運海，章孝榮*

(1.安徽農業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036；2.安徽地方畜禽遺傳資源保護與生物育種省級實驗室，合肥 230036；3.安徽省羊繁育工程技術研究中心，合肥 230036)

山羊骨骼肌中miR-133及其靶基因的表達規(guī)律與功能研究

凌英會1，2，3，王麗娟1，2，王康巖1，2，李運生1，2，丁建平1，2，張運海1，2，章孝榮1，2，3*

(1.安徽農業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036；2.安徽地方畜禽遺傳資源保護與生物育種省級實驗室，合肥 230036；3.安徽省羊繁育工程技術研究中心，合肥 230036)

旨在研究miR-133及其靶基因SRF在山羊骨骼肌組織和細胞中的表達情況，并探討miR-133對SRF基因的靶向調控作用。首先利用qRT-PCR分別檢測miR-133及其靶基因在初生、7月齡、18月齡的安徽白山羊和波爾山羊8個組織(心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、背最長肌)以及不同代數的山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞(F6、F9、F12)中的表達變化；采用qRT-PCR及Western印跡法檢測miR-133對靶基因mRNA及蛋白質表達水平的影響。qRT-PCR檢測表明，miR-133在心肌和背最長肌中的表達水平明顯高于其它組織，其靶基因SRF的表達水平與其相反；miR-133在山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達水平隨著細胞代數的增多而表達量增加；qRT-PCR及Western印跡法證實，miR-133對SRF蛋白表達的調控發(fā)生在轉錄后水平。綜上表明，miR-133有望成為研究山羊骨骼肌生長發(fā)育的新型標志物；miR-133通過在轉錄后水平抑制SRF蛋白的表達參與調控山羊骨骼肌細胞增殖和分化，進而影響山羊骨骼肌的發(fā)育。

山羊；miR-133；靶向調控；基因表達

microRNAs(miRNAs)是一類生物中廣泛存在，長20～25 bp的小分子非編碼RNA，在進化過程中高度保守，轉錄后水平具有基因表達調控的作用[1]。miRNAs可以通過與靶基因mRNA分子的 3′UTR完全或不完全地互補配對，導致mRNA分子不穩(wěn)定而使其直接降解或抑制翻譯過程[2-3]。miRNAs對超過1/3的人類蛋白編碼基因進行調控，在生命活動的許多方面都發(fā)揮著巨大作用[4]。同時miRNAs對肌肉質量、肌肉纖維類型和肌肉相關疾病也有很大的影響[5]。有研究表明，許多miRNAs參與調控骨骼肌增殖與分化的過程[6-7]。miR-133是肌肉特異性的miRNAs，在小鼠、豬等物種中對骨骼肌的發(fā)育有重要調控作用[8-9]；miR-133能促進成肌細胞的增殖，抑制成肌細胞的分化[10]。血清反應因子(SRF)在肌肉的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。SRF能夠通過對一系列伴侶蛋白的招募從而控制肌肉相關基因的轉錄，包括轉錄共激活劑的促血管平滑肌細胞分化因子家族的成員，促進肌肉的分化，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠缺乏SRF將不能形成中胚層[11]。miR-133通過靶向作用血清反應因子(SRF)，降低體內外的肌肉分化，促進肌細胞增殖[10]。

為了進一步探討miR-133參與山羊肌肉細胞增殖與分化等生長發(fā)育機制，本研究通過進一步分析miR-133在山羊骨骼肌組織及山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達變化，篩選并驗證miR-133在山羊骨骼肌發(fā)育過程中的靶基因，并對miR-133在山羊骨骼肌發(fā)育過程中可能的調控機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以合肥博大牧業(yè)科技開發(fā)有限公司種羊場的兩個山羊群體24只個體作為試驗材料，選取初生、3月齡、7月齡、18月齡的安徽白山羊和波爾山羊各3只。山羊從出生～成年的不同階段的8個組織樣(心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、背最長肌)為樣本，每只山羊8個組織樣至少取3份，迅速放于1.5 mL無RNA酶的EP管中，并立即投入液氮速凍，然后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與RNA提取 采用常規(guī)方法分離山羊骨骼肌細胞，并采用差速貼壁法進行培養(yǎng)，收集貼壁細胞，對純化的山羊骨骼肌細胞采用免疫熒光方法檢測其特異標志蛋白Pax-7。用含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12細胞培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取處于對數生長期的細胞用于后續(xù)試驗。利用TRIzol 試劑盒(TaKaRa)提取各組織樣本以及細胞的總RNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SMA 1000 紫外分光光度計測定其濃度和純度后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計與cDNA反轉錄 根據前期Solexa測序獲取山羊的miR-133序列為靶序列。miR-133以及內參基因U6的莖環(huán)引物和特異性PCR引物由廣州銳博生物公司設計并合成。另外，根據GenBank數據庫中收錄的綿羊和牛SRF的mRNA序列(序列號：XM-004019222和NM-001206016)用Primer 5.0軟件設計目的基因的上、下游引物，引物由華大基因公司合成。各目的基因上、下游引物見表1。采用PrimerScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa Code：DRR037S)試劑盒，按照說明書中方法將各樣品總RNA反轉錄成cDNA。反應體系為20 μL：總RNA(1 μg·μL-1)2 μL、5×buffer 4 μL、PrimerScript RT Enzyme Mix I 1 μL、特異性引物(5 μmol·L-1)或者Oligo dT Primer(50 μmol·L-1)1 μL，RNase水補至20 μL；反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s終止反應。反應結束后，將反轉錄產物作10倍稀釋，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 miR-133及其靶基因SRF的擴增與測序 以1.2.2反轉錄產物(RT產物)為模板，利用real-time PCR引物(表1)擴增目標基因，PCR反應體系為特異RT產物2 μL，10 μmol·L-1引物2 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 2 μL，10×EXTaqbuffer 2.5 μL，5 U·μL-1TaKaRa EXTaqHS 0.15 μL，補ddH2O至25.0 μL。反應條件：94 ℃預變性30 s；94 ℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，回收，并送華大基因公司測序。

采用3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase試劑盒按說明書中方法將背最長肌組織總RNA進行反轉錄成cDNA。使用巢式PCR方法擴增HDAC4和SRF3′UTR，特異性引物見表1。PCR條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 μLPCR反應產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，確認3′RACE PCR擴增產物。將得到明亮條帶的PCR產物直接送華大基因公司測序。

表1 擴增及定量PCR引物

Table1 Primers used in the study

引物Primer序列(5′?3′)SequenceSRFForward：CAGACCTGCCTCAACTCGC，Reverse：GCCTGCTGCCCTATCACASRF3′UTR1stouterforward：AATGAGTGCCACCGGCTTTG，2stouterforward：CCCTCCTTTCCCATCACCSRFreal?timePCRForward：CCCTCCTTTCCCATCACC，Reverse：GCCGCTGCCTGTACTCTTGAPDHreal?timePCRForward：CACAGTCAAGGCAGAGAAC，Reverse：TACTCAGCACCAGCATCA

1.2.4 miR-133及其靶基因在山羊骨骼肌組織和細胞中表達水平檢測 使用標準SYBR Green 實時定量PCR檢測試劑盒(羅氏公司)。15 μL PCR反應體系：cDNA模板(RT產物)2 μL，real-time PCR 引物(10 μmol·L-1)0.9 μL，SYBR Green Mix 7.5 μL，ddH2O補至15 μL。PCR反應：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃復性和延伸1 min，40個循環(huán)； PCR產物熔解曲線的反應條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。

1.2.5 細胞轉染與Western blot檢測 設置4個梯度：50、100、150和200 nmol·L-1，對細胞轉染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染效果，確定轉染條件。在轉染前1 d，6孔板每孔接種3×105個山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞，轉染當天細胞密度約為50%。采用Promega公司FUGENHD轉染試劑進行miR-1和 miR-133 mimics、miRNA陰性對照mimics、FUGENHD轉染，轉染48 h，進行細胞總RNA和蛋白質抽提。

提取細胞總蛋白質，定量，與上樣緩沖液按比例混勻，100 ℃加熱變性5 min；8%和12%SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌2次，TBS洗滌1次，每次10 min。加入二抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌2次，TBS洗滌1次，每次10 min，在暗室中顯色、壓片、顯影、定影。

1.2.6 統(tǒng)計分析 利用ABI Step-one software v2.2對數據進行比較分析。定量PCR，miR-133及其靶基因是以U6為內參基因來校正cDNA模板的質量。利用2-△△Ct法[12]計算目的基因在不同組織中的相對表達量：△Ct=Ct Target-CtU6；△△Ct=△Ct Target-△CtCalibrator。每個定量PCR反應均進行4次生物學重復，數據以“平均值±標準誤(mean±SE)”表示。利用SPSS 17.0 軟件對miR-1和miR-133以及靶基因HDAC4和SRF在不同時期組織中的相對表達量進行差異顯著性分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 miR-133以及靶基因(SRF)的獲得

山羊骨骼肌特異性RT產物為模板，目的基因的引物進行PCR擴增山羊骨骼肌miR-133和SRF基因，并利用3′RACE方法擴增，以目的基因的引物進行套式PCR擴增山羊骨骼肌SRF3′UTR基因，并用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。依據本課題組前期采用Solexa測序方法獲得miR-133的成熟序列[13]，進行分析顯示，PCR產物測序發(fā)現(xiàn)SRF3′UTR與miR-133種子序列的結合位點為UGGUC(5′ UUGGUCCCCUUCAACCAGCUGU3′)。

2.2 miR-133及其靶基因(SRF)在山羊不同時空中的表達規(guī)律

2.2.1 miR-133在安徽白山羊和波爾山羊不同時空中的表達規(guī)律 試驗數據經SPSS 17.0 單因素方差分析，LSD和Duncan多重比較。miR-133在不同月齡安徽白山羊和波爾山羊中的表達數值見圖1，圖1表明，miR-133在心和骨骼肌組織中有較高的表達量，而和其他組織中的表達相比有極顯著的差異(P<0.01)。

1.心；2.肝；3.脾；.4.肺；5.腎；6.小腸；7.脂肪；8.背最長肌。下同1.Heart；2.Liver；3.Spleen；4.Lung；5.Kidney；6.Small intestine；7.Fat；8.Longissimus dorsi.The same as below圖1 miR-133在安徽白山羊(A)和波爾山羊(B)不同組織中的表達譜Fig.1 miR-133 expression in different tissues of Anhui White goats(A)and Boer goats(B)

2.2.2SRF在安徽白山羊和波爾山羊不同時空中的表達規(guī)律SRF在不同月齡安徽白山羊和波爾山羊兩個山羊品種心、肝、脾、肺和腎、小腸、脂肪和背最長肌8個組織的表達情況見圖2。從圖2可以看出，SRF在不同月齡安徽白山羊和波爾山羊各組織中廣泛表達，但在同一時期不同組織的表達存在差異。在安徽白山羊和波爾山羊的8種組織中，表達量較低的為背最長肌和心，這與miR-133在兩種山羊的背最長肌和心中的表達是相反的。

圖2 SRF在安徽白山羊(A)和波爾山羊(B)不同組織中的表達譜Fig.2 SRF expression in different tissues of Anhui White goats(A) and Boer goats(B)

2.2.3 miR-133在安徽白山羊和波爾山羊骨骼肌發(fā)育過程中的表達分析 如圖3所示，miR-133在安徽白山羊和波爾山羊骨骼肌發(fā)育過程中呈現(xiàn)不同的表達模式。從出生～18月齡，miR-133在波爾山羊中的表達量顯著高于安徽白山羊(P<0.05)。

2.3 miR-133及其靶基因(SRF)在山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達規(guī)律

數據經生物統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0 方差分析，LSD和Duncan多重比較，miR-133及其靶基因(SRF)在不同代數(F6、F9和F12)的山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達規(guī)律見圖4。miR-133在山羊骨骼衛(wèi)星細胞中的表達量隨細胞代數的增多表達量也隨之增多，這與其在不同月齡的背最長肌中的表達趨勢相似。而它的靶基因SRF在不同代數的山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達趨勢與miR-133相似。

2.4 miRNA mimics轉染條件的摸索

本研究對miR-133 mimics的轉染條件進行摸索。轉染細胞48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染效果，結果發(fā)現(xiàn)當miRNA 陰性對照轉染的最終濃度為100 nmol·L-1時，轉染效率最高(表2)。在Fu-GENE HD轉染試劑的使用量為10 μL，miRNA mimics終濃度為100 nmol·L-1，熒光顯微鏡下可以觀察到轉染FAM-NC的山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中有大量細胞顯示為紅色，表明miRNA mimics的轉染效果較好。

Table 2 The transfecting efficiency of FAM-NC in SSC

濃度/(nmol·L-1)Concentration染色細胞數No．ofstainedcells熒光細胞數No．offluorescentcells50401±5．07214±7．42250±3．81239±4．18161±3．92128±2．74100338±6．45466±9．85173±4．14273±5．92271±5．02117±2．93150571±10．04534±8．73520±8．14249±5．17276±4．62243±3．97200419±9．16423±8．72453±4．09202±4．78221±2．94209±5．16濃度/(nmol·L-1)Concentration染色平均細胞數Averageofstainedcells熒光平均細胞數Averageofstainedcells轉染效率/%Transfectionefficiency50288±5．43176±4．0361．1100326±6．81220±4．6267．5150542±8．97256±4．5947．2200432±7．32211±4．2948．8

圖3 miR-133在安徽白山羊和波爾山羊不同生長階段骨骼肌中的比較分析Fig.3 Comparative analysis of miR-133 expression in skeletal muscle between Anhui White goats and Boer goats at different developmental stages

圖4 miR-133(A)和SRF(B)在骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達Fig.4 The expression level of miR-133 and SRF in SSC

2.5 miR-133 mimics瞬時轉染結果

與其它對照組相比，miR-133 mimics轉染組山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中的miR-133的表達量明顯上升，而NC組細胞中的miR-133未上升，從而充分說明了miR-133 mimics轉染至山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中能成功的表達miR-133(圖5)。

2.6 miR-133抑制山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞SRF蛋白表達

Western印跡法結果表明，與其它組相比，采用miR-133 mimics上調山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞miR-133表達水平后，其SRF蛋白表達水平明顯下降，提示miR-133能抑制山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞SRF蛋白表達(圖6)。

1.miR-133 mimics;2.NC;3.Mock;4.Blank.The same as below圖5 SSC轉染miR-133 mimics后miR-133的表達變化Fig.5 The expression of miR-133 in SSC after transfecting miR-133 mimics by real-time PCR

圖6 SSC轉染miR-133 mimics后SRF蛋白的變化Fig.6 Regulation of SRF protein expression by transfecting miR-133 mimics in SSC

2.7 miR-133對山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞SRFmRNA表達影響

miRNA能通過抑制靶基因的翻譯或介導靶基因mRNA的降解，從而對靶基因蛋白表達發(fā)揮調控作用，為進一步明確miR-133在何種水平對SRF蛋白發(fā)揮調控作用，采用qRT-PCR方法進一步檢測miR-133 mimics或miRNA陰性對照mimics轉染后山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞SRFmRNA表達水平。qRT-PCR結果表明，上調miR-133表達水平對山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞SRFmRNA表達水平無明顯影響(圖7)。結合上述Western blot檢測結果表明，miR-133通過抑制山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞SRF基因的翻譯而非誘導SRFmRNA的降解抑制SRF蛋白的表達，即miR-133在轉錄后水平抑制SRF蛋白表達。

圖7 轉染miR-133 mimics后SRF mRNA水平的表達變化Fig.7 The expression of SRF mRNA in SSC after transfecting miR-133 mimics by real-time PCR

3 討 論

miRNAs是一類存在較廣泛且可以對基因表達進行微調控的小RNA分子，它對生物體一系列重要生命進程進行調控，包括胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡以及脂類代謝等[14-17]，對發(fā)育過程的調控發(fā)揮著重要作用。miRNAs主要是通過與靶基因mRNA的3′UTR堿基完全或不完全互補配對，導致mRNA直接被降解，或阻斷mRNA翻譯進而對基因表達進行調控[18]。

miRNAs的定量表達主要有莖環(huán)反轉錄引物和3′端加接頭兩種方法，其中由于莖環(huán)反轉錄引物法簡便、快捷、特異性好和準確性高，而被廣泛運用于對miRNAs的表達研究[19-20]。而miRNA的作用機制，關鍵是miRNA及其靶基因的相互作用，目前主要利用生物信息學和生物學試驗方法尋找并驗證miRNA的靶基因[1]。采用TargetScan和PicTar預測軟件，對miR-1和miR-133潛在靶基因進行預測，結果發(fā)現(xiàn)HDAC4和SRF基因同時被TargetScan和PicTar預測為miR-1和miR-133的靶基因。通過3′RACE試驗，發(fā)現(xiàn)HDAC4 3′UTR有個miR-1結合位點，而SRF3′UTR有兩個miR-133結合位點。另外，上調miR-1和miR-133表達水平則能下調山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞HDAC4和SRF蛋白表達水平，對HDAC4和SRFmRNA表達水平無影響。鑒于miRNA發(fā)揮作用的機制為通過翻譯抑制和影響mRNA的穩(wěn)定性，使其降解來下調蛋白表達，筆者認為miR-1和miR-133是在轉錄后水平抑制HDAC4和SRF蛋白表達。

M.Lagos-Quintana等[21]從小鼠和人的肌肉組織中克隆并鑒定出miR-1和miR-133，兩個肌肉特異性表達的miRNAs[22]。miR-1和miR-133是源于同一個miRNA多順反子，且被共同轉錄，但miR-1和miR-133兩者發(fā)揮的作用卻是相反的，miRNAs可能在調控細胞增殖和分化的平衡中起著十分重要的作用。J.F.Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1和miR-133對骨骼肌細胞的分化成熟過程進行調控，其中miR-1能夠促進骨骼肌細胞的分化過程，而miR-133卻抑制分化促進成肌細胞的增殖過程。另外，Z.P.Koutsoulidout等[23]認為在骨骼肌的生長發(fā)育過程中，miR-1和miR-133的表達豐度與骨骼肌的成熟有關。miR-1和miR-133在安徽白山羊和波爾山羊骨骼肌中的表達量較高，可能對維持骨骼肌的正常功能起重要作用。另外，miR-1在安徽白山羊和波爾山羊中的表達量有隨個體成熟表達減少的趨勢，說明miR-1對肌肉的快速增長有著重要的作用，且有利于纖維細胞的大量復制表達，成體肌細胞的增殖和分化都衰弱時，表達量則相對減少。而miR-133隨著個體的發(fā)育，表達量一直在增加，到成體時表達量最高，在成體肌細胞中發(fā)揮相當大的作用，說明成體肌細胞存在著增長的現(xiàn)象，需要有較高表達量的miR-133來促進其增殖。在本試驗中，miR-133在安徽白山羊和波爾山羊骨骼肌發(fā)育過程中的表達變化說明miR-133可能與山羊骨骼肌的發(fā)育有關。

目前，大多數miRNAs的功能尚不清楚。因為每個miRNA靶基因的數量很多，且多個miRNAs可以同時調控1個基因的表達，因此快速且準確的預測以及鑒定miRNA的靶基因對于研究miRNA的功能至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以通過調控一些轉錄因子和信號傳導因子來調節(jié)細胞的增殖和分化[24-25]。已有報道證明miR-1和miR-133能夠通過調節(jié)靶基因的表達參與細胞的增殖和分化過程[10]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-1和miR-133在骨骼肌細胞的分化成熟過程中呈現(xiàn)一定的時空表達特異性，其中miR-1是以HDAC4 為靶點促進肌生成，而miR-133是通過抑制SRF而促進成肌細胞的增殖[14]。最新研究結果顯示[26]，HDAC4 被磷酸化后可以解除對肌細胞增強因子2(MEF2) 的抑制作用，從而使MEF2 的轉錄活性增強，有利于骨骼肌細胞代謝相關基因的轉錄，進而對骨骼肌 IR 的發(fā)生和發(fā)展產生影響。而SRF是一種轉錄因子，在多個物種中廣泛存在，并對細胞的生長、分化、形成和維持以及神經系統(tǒng)的形成等過程進行調控，尤其是在細胞骨架的構建過程中起到重要的作用[27-29]。在本研究中，HDAC4和SRF在安徽白山羊和波爾山羊的心和骨骼肌中表達量較低，而在其它組織中表達量較高，這與miR-1和miR-133在安徽白山羊和波爾山羊中表達量趨勢是相反的。說明miR-1和miR-133可能是通過抑制它們的靶基因來調控骨骼肌的發(fā)育，這與J.F.Chen等[10]的觀點一致。HDAC4和SRF在安徽白山羊和波爾山羊中的表達趨勢與miR-1和miR-133類似，這說明miR-1和miR-133表達量的差異會影響靶基因的表達進而影響動物骨骼肌的生長與發(fā)育。另外，miR-1和miR-133在不同月齡的波爾山羊中的表達量均較高，從這些數據推測miR-1和miR-133與山羊生長發(fā)育可能具有一定的相關性。

4 結 論

本研究通過對波爾山羊和安徽白山羊不同組織中miR-133及其靶基因的表達譜分析以及在細胞和蛋白水平檢測miR-133對SRF的影響，發(fā)現(xiàn)miR-133通過對其靶基因SRF的調控，參與山羊骨骼肌細胞增殖和分化，從而影響山羊骨骼肌的發(fā)育。

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(編輯 程金華)

The Expression Profiles and Function Analysis of miR-133 in Goat Skeletal Muscle Tissue and Cell

LING Ying-hui1，2，3，WANG Li-juan1，2，WANG Kang-yan1，2，LI Yun-sheng1，2，DING Jian-ping1，2，ZHANG Yun-hai1，2，ZHANG Xiao-rong1，2，3*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China；2.LocalAnimalGeneticResourcesConservationandBiobreedingLaboratoryofAnhuiProvince，Hefei230036，China；3.EngineeringResearchCenterofReproductionandBreedinginSheepofAnhuiProvince，Hefei230036，China)

The purpose of this experiment was to study the expression of miR-133 and its target gene SRF in skeletal muscle tissue and cells in goat，and the effects of miR-133 on target gene(SRF).The qRT-PCR was used to detect different expression of miR-133 and its target gene in different tissues of newborn，7 months and 18 months old Anhui white goat and Boer goat(heart，liver，spleen，lung，kidney，small intestine，fat，longissimusdorsi) and different goat skeletal muscle satellite cells(F6，F(xiàn)9，F(xiàn)12)；qRT-PCR and the Western blot was used to detect the mRNA of target gene and protein expression level.The results of qRT-PCR showed that the expression level of miR-133 in myocardium andlongissimusdorsimuscle was higher than that in other tissues，the expression level of the target geneSRFwas different from miR-133 in goat；The expression level of miR-133 in skeletal muscle satellite cells increased with the cell generations；That regulation of miR-133 onSRFprotein expression occurred at the post transcriptional level by qRT-PCR and Western blot.The results showed that miR-133 was expected to become a new marker of goat skeletal muscle growth and development；miR-133 was involved in the regulation of proliferation and differentiation of goat by inhibiting the expression ofSRFprotein in the post transcriptional level，thereby affecting the goat skeletal muscle development.

goat；miR-133；target regulating；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.005

2015-05-04

國家自然科學基金項目(31301934；31372310)；安徽省自然科學基金(1308085QC54))

凌英會(1981-)，男，安徽安慶人，副教授，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：caaslyh@163.com

*通信作者：章孝榮，教授，博士生導師，主要從事動物生殖調控研究，E-mail：zhangxiaorong01@163.com

S827.2

A

0366-6964(2015)11-1944-08