miRNA153反義核酸上調(diào)肺癌細(xì)胞對(duì)輻射敏感性的體外實(shí)驗(yàn)

高 蕊，馮 帆，賈 輝，張 帆，王 濤，董國(guó)福，馬德賓，馬宏達(dá)，韓雅玲，劉 蕾沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧沈陽 006；沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，遼寧沈陽 006；解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 0085；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京 00850

GAO Rui1, FENG Fan2, JIA Hui2, ZHANG Fan3, WANG Tao4, DONG Guofu4, MA Debin1, MA Hongda2, HAN Yaling1, LIU Lei11Department of Respiratory Diseases, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;2Department of Pharmacy, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;3Department of Medical Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;4Military Medical Science Academy of the Chinese PLA, Beijing 100850, China

基礎(chǔ)研究論著

miRNA153反義核酸上調(diào)肺癌細(xì)胞對(duì)輻射敏感性的體外實(shí)驗(yàn)

高 蕊1，馮 帆2，賈 輝2，張 帆3，王 濤4，董國(guó)福4，馬德賓1，馬宏達(dá)2，韓雅玲1，劉 蕾1
1沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧沈陽 110016；2沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，遼寧沈陽 110016；3解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；4軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京 100850

目的探討反義核酸沉默microRNA 153(miRNA153)對(duì)電離輻射殺傷肺癌細(xì)胞株的影響。方法利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA153的反義核酸；使用60Co-γ射線照射肺癌細(xì)胞；使用CCK-8實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂成集落實(shí)驗(yàn)(錨定非依賴性生長(zhǎng))和Trans-well實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA153反義核酸對(duì)電離輻射殺傷肺癌細(xì)胞的影響；RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA153的反義核酸對(duì)miRNA153、其靶標(biāo)蛋白PTEN以及細(xì)胞存活/凋亡耐受調(diào)控蛋白Survivin表達(dá)的影響。結(jié)果CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中等劑量射線(4 Gy)照射能夠殺傷肺癌細(xì)胞A549、H460、H1299和H358，下調(diào)miRNA153的表達(dá)能夠增強(qiáng)輻射對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用；軟瓊脂成集落和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miRNA153的反義核酸能夠上調(diào)輻射對(duì)A549細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)和侵襲的抑制作用。分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miRNA153的反義核酸能夠顯著降低miRNA153的表達(dá)水平，提高腫瘤抑制因子PTEN并降低細(xì)胞存活因子Survivin的表達(dá)。結(jié)論降低miRNA153的表達(dá)能夠上調(diào)輻射對(duì)肺癌細(xì)胞系的體外殺傷作用。

miRNA153沉默；肺癌細(xì)胞；電離輻射

肺癌嚴(yán)重危害人類健康，隨著環(huán)境污染加劇以及各類環(huán)境激素類物質(zhì)的擴(kuò)散，其發(fā)病率和死亡率都逐年升高，位居人類惡性腫瘤的前列[1]。由于大多數(shù)肺癌患者初診即為進(jìn)展期，失去了外科手術(shù)等根治性治療的機(jī)會(huì)，因此放射治療等在肺癌綜合治療中具有重要意義[2]。Kang等[3]和Bussink等[4]的報(bào)道都顯示，相當(dāng)比例的病人對(duì)放射治療并不敏感。盡管目前有臨床研究應(yīng)用分子靶向藥物配伍放射治療，但治療效果仍然較差[2,4-6]。為此，闡明肺癌放射治療耐受的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的指示分子并開發(fā)新的治療和干預(yù)策略(肺癌輻射增敏)具有重要意義。MicroRNAs(miRNAs)是細(xì)胞增殖調(diào)控、分化和癌變(Transformation)等生理過程的重要調(diào)控因子[7]。其作用廣泛，功能多樣，能夠作為疾病發(fā)生的指示分子(Indicator)和治療靶標(biāo)(Target)[8-9]。研究表明，miRNA153能夠通過下調(diào)PTEN基因的表達(dá)并誘導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生、增殖與進(jìn)展[10]。Chen等[11]的結(jié)果顯示，miR-153不僅能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，還能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的抗腫瘤藥物多藥耐藥作用(Multi-drug resistance)。miRNA的反義核酸技術(shù)能夠利用特異性反義序列下調(diào)目標(biāo)miRNA的水平，這使得利用基因治療相關(guān)技術(shù)通過miRNA干預(yù)疾病的進(jìn)展成為可能[12]。根據(jù)組織學(xué)和病理特征，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌[13-14]。其中，非小細(xì)胞肺癌占肺癌發(fā)病總數(shù)的80%以上，是肺癌最主要的類型[13-14]。為此，本研究主要使用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，觀察下調(diào)miRNA153對(duì)A549輻射敏感性的影響，并在其他類型肺癌細(xì)胞H460、H1299和H358等模型上進(jìn)行檢測(cè)。

材料和方法

1 藥品、試劑和設(shè)備 miRNA153反義核酸(Antagomirs/Inhibitor)購自美國(guó)Applied Biosystems公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8試劑購自美國(guó)Amerresco公司；Lipofectamine-RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑購自美國(guó)Invitrogen公司；miRNA153檢測(cè)使用TaqMan?miRNA Assays試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)；RT-PCR試劑盒購自美國(guó)Promega公司；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)試劑盒(包括SDS-蛋白電泳使用Loading Buffer、蛋白Marker以及PVDF膜)購自美國(guó)Bio-Rad公司；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)所用抗體(PTEN、Survivin以及GAPDH)購自美國(guó)Santa Cruz公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京，Qiangen公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；Trans-well細(xì)胞24孔培養(yǎng)板和小室、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6 cm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿以及6孔細(xì)胞培養(yǎng)板等購自美國(guó)Corning公司。多功能酶標(biāo)儀(Wallac公司)；TS-100倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 肺癌細(xì)胞株A549、H460、H1299及H358均購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含2 mmol/L的L-谷氨酰胺和10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中；置于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。先分別將0.5μl的Lipofectamine-RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑和200 ng核酸(由0.5μl無血清無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基溶解與稀釋)分別加入到2個(gè)EP管(含24.5μl無血清無抗生素培養(yǎng)基)中，充分混勻，室溫靜置15 min后，將兩管液體等比例混合，輕輕混勻后室溫下靜置15 min，備用。

3 細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn) 將A549等肺癌細(xì)胞培養(yǎng)于75 cm2培養(yǎng)瓶中，待其狀態(tài)較好時(shí)，接種于6孔板中，待每空細(xì)胞密度達(dá)到80% ～ 90%后換新鮮培養(yǎng)基，每孔1 ml；培養(yǎng)24 h后進(jìn)行射線照射；60Co-γ射線輻射實(shí)驗(yàn)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供實(shí)驗(yàn)條件，系列輻射劑量分別為0 Gy、2 Gy、6 Gy、8 Gy和10 Gy；輻射后更換含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液；置于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h時(shí)，每孔分別加入100μl CCK-8試劑，置于37℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，多功能酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[15-16]。輻射對(duì)細(xì)胞存活的抑制率(Inhibition rate)計(jì)算公式：抑制率(%)=(對(duì)照組A450nm-射線照射組A450nm)/對(duì)照組A450nm×100%。細(xì)胞相對(duì)存活率(Relative cell survival rate)=100%-抑制率。

4 軟瓊脂成集落實(shí)驗(yàn) 按照Zhu等[17]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：預(yù)配置1.2%和0.7%的瓊脂溶液，滅菌；預(yù)先使用1.2%的瓊脂鋪6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(每皿約2 ml)，待其凝固，4℃保存?zhèn)溆?；射線照射后的A549細(xì)胞消化和計(jì)數(shù)后，以500/皿的細(xì)胞密度使用預(yù)配置的含20% FBS的2倍DMEM重懸細(xì)胞，與預(yù)配置的0.7%的瓊脂溶液等體積混合，加于1.2%瓊脂的上層，培養(yǎng)17 ～ 20 d，當(dāng)克隆肉眼可見時(shí)，終止培養(yǎng)并計(jì)數(shù)、觀察和統(tǒng)計(jì)。

5 Trans-well實(shí)驗(yàn) 參照Zhang等[18]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞的侵襲能力。使用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋ECM(美國(guó)Sigma公司)膠(Gel)預(yù)鋪Transwell小室(每孔30μl)，4℃孵育過夜；使用射線照射A549細(xì)胞后，消化并使用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸至5×105/ml的細(xì)胞密度，加入Transwell小室中，每孔0.2 ml；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含有20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基后，將小室放入24孔板；37℃孵育4 ～ 6 h后使用結(jié)晶紫染色(無水乙醇配置，0.25%溶液)，每孔5個(gè)視野拍照，使用冰醋酸洗脫后在590 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值(O.D.590 nm)。相對(duì)侵襲細(xì)胞數(shù)(Relative invasion cell number)的計(jì)算公式：實(shí)驗(yàn)組A590nm/對(duì)照組A590nm。

6 反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[19-20]描述方法，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染核酸后，收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，DNA電泳檢測(cè)。

7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[15]描述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一抗稀釋條件：兔抗人PTEN單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人Survivin單克隆抗體(1∶2 000稀釋)、鼠抗人GAPDH多克隆抗體(1∶5 000稀釋)；二抗稀釋條件：HRP-羊抗兔單克隆抗體(1∶5 000稀釋)、HRP-羊抗鼠單克隆抗體(1∶5 000稀釋)。

圖 160Co-γ射線(電離輻射)對(duì)A549細(xì)胞存活的抑制作用 A：A549 細(xì)胞受不同劑量照射后48 h進(jìn)行CCK-8檢測(cè)； B：A549受4 Gy強(qiáng)度60Co-γ照射后不同時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA122；aP＜0.05圖 2 miRNA153的反義核酸對(duì)60Co-γ射線抑制A549細(xì)胞存活的影響(照射后72 h，進(jìn)行CCK-8檢測(cè)) (aP＜0.05)Fig. 1 Effect of inhibitory activity of60Co-γ IR (Ionizing radiation) on A549 cell survival a: A549 cells were irradiated by different amount of60Co-γ IR, and then detected by CCK-8 analysis after 48h; b: A549 cells were irradiated by 4 Gy amount of60Co-γ IR, and then detected and analyzed at each time point.aP＜0.05Fig. 2 miRNA153 anti-sense nuclear acids enhanced the inhibitory activity of60Co-γ IR on A549 cell survival (A549 cells, which were transfected with control or miRNA513 anti-sense nuclear acid, were irradiated by 4 Gy amount of60Co-γ IR and then were detected by CCK-8 assays.aP＜0.05)

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析比較多組間的，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 電離輻射對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用 A549細(xì)胞的射線照射量-效曲線如圖1A所示，照射后48 h后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，60Co-γ能夠劑量依賴性地殺傷A549細(xì)胞，其中間作用劑量約為4 Gy和6 Gy。結(jié)合Kang等[3]的方法，我們最終選定4 Gy作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)劑量。進(jìn)一步時(shí)間-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖1B)，4 Gy照射后對(duì)A549細(xì)胞的抑制率在72 h時(shí)最為明顯。因此，我們選定72 h為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。

圖 3 miRNA153的反義核酸對(duì)60Co-γ射線抑制A549細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)的影響(軟瓊脂成集落實(shí)驗(yàn))； A ～ C：代表性照片； D：克隆計(jì)數(shù)結(jié)果；aP＜0.05Fig.3 miRNA153 anti-sense nuclear acids enhanced the inhibitory activity of60Co-γ IR on anchorage-independent growth of A549 (A549 cells were analyzed by soft-agar assays). The Results were shown in photographs (A-C) and colony numbers (D) ().aP＜0.05

2 miRNA153的反義核酸能上調(diào)射線照射對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用 4 Gy射線照射能夠顯著殺傷A549細(xì)胞，抑制其存活、錨定非依賴性生長(zhǎng)和侵襲作用(圖2 ～圖4)；與對(duì)照組相比，miRNA153的反義核酸能夠上調(diào)射線照射對(duì)A549細(xì)胞存活(圖2)、錨定非依賴性增殖(軟瓊脂成集落)(圖3)以及侵襲(Transwell)(圖4)的殺傷和抑制作用。

3 miRNA153的反義核酸對(duì)miRNA153及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miRNA153的反義核酸能夠在A549細(xì)胞中降低miRNA153的表達(dá)水平(圖5A)；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，miRNA153的反義核酸能夠提高miRNA153作用靶基因PTEN的表達(dá)(圖5B)，下調(diào)腫瘤促存活蛋白Survivin的表達(dá)(圖5B)。這表明，利用反義核酸能夠有效下調(diào)miRNA153的表達(dá)，并調(diào)控相關(guān)腫瘤增殖、存活調(diào)控因子的表達(dá)水平。

圖 4 miRNA153的反義核酸對(duì)60Co-γ射線抑制A549細(xì)胞侵襲能力的影響(Trans-well實(shí)驗(yàn)) A ～ C：代表性照片； D：相對(duì)侵襲細(xì)胞數(shù)；aP＜0.05Fig. 4 miRNA153 anti-sense nuclear acids enhanced the inhibitory activity of60Co-γ IR on A549 cell invasion (A549 cells were analyzed by Transwell assays). The Results were shown in photographs (A-C) and relative invasion cell number (D) ().aP＜0.05

圖 5 miRNA153反義核酸對(duì)miRNA153和PTEN、Survivin表達(dá)的影響 A：RT-PCR檢測(cè)miRNA153表達(dá)水平；B：蛋白印跡檢測(cè)miRNA153的作用靶標(biāo)蛋白PTEN以及細(xì)胞存活調(diào)控因子Survivin的表達(dá)量Fig. 5 Effects of miRNA153 anti-sense nuclear acids on miRNA153, PTEN and Survivin. The expression level of miRNA153 was determined by RT-PCR assays (A). The expression of microRNA153 targeted genes PTEN and cell survival regulator Survivin (B) was detected by western blot

圖 6 miRNA153的反義核酸對(duì)60Co-γ射線抑制肺癌細(xì)胞H460、H1299以及H358存活的影響(CCK-8檢測(cè)) A： H460； B： H1299； C：H358；aP＜0.05Fig. 6 miRNA153 anti-sense nuclear acids enhanced the inhibitory activity of60Co-γ IR on the survival of lung cancer cell H460 (A), H1299 (B) and H358 (C), and H358 cells were detected by CCK-8 assays.aP＜0.05

4 miRNA153的反義核酸能上調(diào)射線對(duì)多種肺癌細(xì)胞的殺傷作用 為進(jìn)一步證實(shí)miRNA153反義核酸在肺癌細(xì)胞中的作用，H460、H1299和H358細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照組和miRNA153反義核酸組后，使用4 Gy射線照射。結(jié)果顯示(圖6)，與對(duì)照組相比，miRNA153的反義核酸能夠上調(diào)射線照射對(duì)H460(圖6A)、H1299(圖6B)和H358(圖6C)細(xì)胞的殺傷作用。

討 論

微小RNA(microRNA)是一類識(shí)別靶標(biāo)基因3′末端18 ～ 25個(gè)堿基序列的小RNA分子[7-8]。miRNA為RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡[7-8]。miRNA是重要的腫瘤調(diào)控因子，Qian等[21]系統(tǒng)總結(jié)了miRNA的功能和調(diào)控機(jī)制，包括miR-20a、miR-145、miR-24和miR-25等都有可能參與調(diào)控肺癌的發(fā)生與進(jìn)展。miRNA153是新型腫瘤調(diào)控因子，Anaya-Ruiz等[12]、Kim等[22]和Wu等[10]均報(bào)道，miRNA153能夠促進(jìn)乳腺癌、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，異常表達(dá)(Aberrent expression)的miRNA153能夠作為乳腺癌進(jìn)展和患者預(yù)后的指示分子(Indicator)。miRNA153不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，Chen等[11]的報(bào)道也顯示，miRNA153還能夠調(diào)控肝癌細(xì)胞的多藥耐藥作用(Multi-drug resistance)。近年來，隨著技術(shù)進(jìn)步，包括“sponges”或“antagomirs”等策略能夠通過作用于miRT序列沉默內(nèi)源miRNA表達(dá)，這使得miRNA作為疾病干預(yù)靶標(biāo)成為可能。Anaya-Ruiz等[12]利用miRNA153的Inhibitor(抑制劑)沉默(Silencing)miRNA153的表達(dá)，能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的細(xì)胞凋亡作用。本研究利用類似技術(shù)，檢測(cè)降低miRNA153的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞系輻射敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA153的反義核酸能夠上調(diào)射線照射對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、錨定非依賴性生長(zhǎng)和侵襲的抑制作用。進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行分析，miRNA153的反義核酸能夠顯著下調(diào)miRNA153的水平，進(jìn)而提高miRNA153作用靶標(biāo)腫瘤抑制蛋白PTEN的表達(dá)水平。此外，miRNA153的反義核酸還能降低細(xì)胞存活調(diào)控蛋白Survivin的表達(dá)。PTEN是IGF/PI3K/AKT信號(hào)通路的主控負(fù)調(diào)控因子，能夠降低PI3K的磷酸化[23]。作為強(qiáng)勢(shì)的腫瘤抑制基因，Nagata等[23]證實(shí)，PTEN是PI3K信號(hào)通路的主要負(fù)調(diào)控因子，其差異表達(dá)可能是HER2陽性乳腺癌患者對(duì)曲妥珠單抗(Herceptine)敏感性差異的原因。PI3K信號(hào)通路是乳腺癌存活、增殖和侵襲的調(diào)控樞紐，能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞存活因子Survivin的表達(dá)。結(jié)合前述，傳統(tǒng)研究主要關(guān)注于電離輻射后的DNA損傷修復(fù)作用機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路，如P21、P53以及ATM等損傷修復(fù)相關(guān)調(diào)控因子。這些雖然在正常組織/細(xì)胞中維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，但在腫瘤細(xì)胞中有可能誘導(dǎo)對(duì)放療的耐受。電離輻射不僅能造成DNA斷裂，也能誘導(dǎo)過氧化物或者自由基造成蛋白質(zhì)等生物大分子的烷基化或相互交聯(lián)[3]。電離輻射脅迫下，細(xì)胞中通過各種感受機(jī)制感受DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子損傷，進(jìn)而活化相關(guān)應(yīng)答機(jī)制[3]，最終誘導(dǎo)Survivin、BCL-2、IAP和Livin等細(xì)胞存活蛋白的表達(dá)[24]。在這一過程中，PI3K/ AKT信號(hào)通路及Notch-1/NF-κB信號(hào)通路起到了重要的作用[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA126和miRNA34a等也能夠調(diào)控PI3K/AKT以及Notch-1/ NF-κB信號(hào)通路[21]。miRNA126和miRNA34a等的差異表達(dá)有可能是腫瘤放療敏感性差異的主要機(jī)制，而本研究首次報(bào)道了miRNA153在腫瘤細(xì)胞輻射增敏中的作用，表明利用反義核酸技術(shù)降低miRNA153等細(xì)胞存活及凋亡耐受調(diào)控miRNA的表達(dá)能增加細(xì)胞對(duì)輻射等脅迫因素的敏感性。

綜上所述，本研究利用miRNA153的反義核酸技術(shù)，探討其在輻射增敏中的意義，對(duì)闡明參與電離輻射相關(guān)miRNA的作用機(jī)制具有重要意義。

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Up-regulation of microRNA153 causes radio-sensitization of lung cancer cells in vitro experiments

LIU Lei. Email: doctorliulei@163.com

ObjectiveTo declare whether silencing of miRNA153 via its anti-sense nuclear (inhibitor) induces the radio-sensitization of lung cancer cells.MethodsThe anti-sense nuclear acid (inhibitor) of miRNA153 was transfected into lung cancer cells, which were irradiated by 60Co-γ. The CCK-8 analysis, soft-agar and Transwell assays were performed to identify the effect of miRNA153 silencing on radio-sensitization in lung cancer cells. RT-PCR and Western blot assays were used to detect the effect of anti-sense nuclear acid (inhibitor) of miRNA153 on miRNA153, its target protein PTEN and the expression of Survivin cell proliferation of survival regulators.ResultsCCK-8 analysis revealed that the irradiation of medium dose ray (4 Gy) could kill the lung cancer cells (A549, H460, H1299 and H358), and the down-regulation of expression of miRNA153 could enhance the radio-sensitization in lung cancer cells. The soft-agar and Transwell assays proved that the up-regulation of rays could inhibit the anchorage-independent growth and invasion of A549 cells. And the molecular mechanism experiment indicated that the anti-sense nuclear acid of miRNA153 significantly disrupted the endogenous expression of miRNA153 and Survivin, and in turn upregulated the expression of PTEN.ConclusionSilencing of miR-153 significantly enhances the sensitivity of lung cancers.

miRNA153 silencing; lung cancer cells; ionizing radiation

R 73-3

A

2095-5227(2015)10-1033-06 DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2015.10.019

時(shí)間：2015-07-10 10:42

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150710.1042.001.html

GAO Rui1, FENG Fan2, JIA Hui2, ZHANG Fan3, WANG Tao4, DONG Guofu4, MA Debin1, MA Hongda2, HAN Yaling1, LIU Lei1
1Department of Respiratory Diseases, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;2Department of Pharmacy, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;3Department of Medical Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;4Military Medical Science Academy of the Chinese PLA, Beijing 100850, China

2015-04-22

“十二五”全軍醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(BWS12J007)

Supported by the "12th Five-Year" Medical Science Research Foundation of PLA(BWS12J007)

高蕊，女，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病和肺部腫瘤。Email: zgydgaorui@163.com

劉蕾，女，博士，副主任醫(yī)師。Email: doctorliulei@163. com