殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)的制備及表征

張錦捷， 曾慶祝

(廣州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 廣州 510006)

殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)的制備及表征

張錦捷， 曾慶祝

(廣州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 廣州 510006)

以自制的殼聚糖微球?yàn)檩d體，環(huán)氧氯丙烷(ECH)為活化劑，亞氨基二乙酸(IDA)為螯合配基，Zn2+為螯合金屬離子制備殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)。最佳活化工藝：M殼聚糖(g)∶VECH(mL)為1∶4、NaOH濃度為1.2 mol/L、活化溫度為50℃，活化時(shí)間為4 h，測(cè)得環(huán)氧基修飾密度達(dá)0.2472 mmol/g；最佳螯合工藝：IDA作為配基、濃度為0.6 mol/L、反應(yīng)溫度為70℃、反應(yīng)時(shí)間為6 h，ZnCl2作為螯合金屬鹽、濃度為0.1 mol/L、反應(yīng)時(shí)間為3 h，Zn2+螯合量達(dá)到最大值。通過(guò)紅外光譜表征，證明殼聚糖與Zn(II)發(fā)生了螯合配位反應(yīng)，生成了殼聚糖-Zn(II)配合物。

殼聚糖；Zn(II)；殼聚糖-Zn(II)；固定化金屬螯合親和層析(IMAC)

固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC )是由Porath等[1]于1975年首次提出，利用蛋白質(zhì)表面暴露的一些氨基酸殘基與載體上的金屬離子在不同條件下配位鍵的形成和解離，達(dá)到分離純化效果的技術(shù)。某些蛋白質(zhì)或氨基酸對(duì)一些過(guò)渡態(tài)金屬離子如Cu2+、Zn2+和Ni2+等具有包括范德華力、靜電作用、共價(jià)鍵等特異親和力；當(dāng)這些親和力強(qiáng)于H2O分子或帶負(fù)電的陰離子時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)與這些金屬離子結(jié)合成復(fù)合物[2-3]。不同蛋白質(zhì)對(duì)金屬離子的親和能力不同，其關(guān)鍵在于組氨酸、色氨酸和半胱氨酸這一類電子供體氨基酸能與金屬離子形成配位復(fù)合物[4]。在層析介質(zhì)上固定不同的金屬離子制成金屬螯合親和吸附劑，可選擇性地吸附表面裸露有巰基或咪唑基等基團(tuán)的多肽蛋白，用于層析純化蛋白質(zhì)。由于配基簡(jiǎn)單、吸附量大、交換載量大、分離條件溫和及通用性強(qiáng)等特點(diǎn)，IMAC被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品的分離純化，逐漸成為最有效的技術(shù)之一[5-6]。

殼聚糖是自然界中唯一被發(fā)現(xiàn)大量存在的陽(yáng)離子堿性多糖，其分子中含有氨基、乙酰胺基、羥基等活性基團(tuán)，因此具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)[7-8]。由于來(lái)源豐富，而且具有良好的生物活性、可降解性、可再生性、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)越性能，因此廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[9]。

鋅是人體必需微量元素，是多種酶的成分或酶的激活劑，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、組織再生、促進(jìn)食欲、促進(jìn)性器官和性機(jī)能的正常發(fā)育、保護(hù)皮膚健康、增強(qiáng)免疫功能等多方面都有重要作用。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多肽比氨基酸更易被人體吸收，而且微量元素(鋅)可以通過(guò)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)，具有毒性更小、易消化吸收、生物活性高等特殊優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)價(jià)值較大[10]。

本文以殼聚糖為原料，采用反相懸浮法制備得到顆粒均勻的殼聚糖微球；以環(huán)氧氯丙烷為活化劑進(jìn)行活化，再以活性配基為螯合活性介質(zhì)與Zn2+進(jìn)行螯合制備殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)；以螯合量為主要參考指標(biāo)對(duì)活化與螯合工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)制得的殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)進(jìn)行紅外光譜分析，為利用該介質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)多肽，篩選出適合與Zn(II)螯合的多肽組分奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

殼聚糖(脫乙酰度>90%，上海源聚生物科技有限公司)、冰乙酸、液體石蠟、Span80、乙酸乙酯、戊二醛(50%)、石油醚、NaOH、環(huán)氧氯丙烷(ECH)、亞氨基二乙酸(IDA)、乙二胺、氨基三乙酸(NTA)、ZnCl2、ZnSO4、ZnAC2，所用試劑均為分析純。

1.2 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JJ-6數(shù)顯六聯(lián)電動(dòng)攪拌器 金壇市華歐實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH-4C數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市鴻科儀器廠；THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市華歐實(shí)驗(yàn)儀器廠；SHZ循環(huán)水式真空泵，河南鞏義市英裕豫華儀器廠；PHS-25數(shù)顯pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)的合成原理示意圖(圖1)。

圖1 殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)的合成原理

1.3.2 殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)的制備

1)交聯(lián)殼聚糖制備。稱取一定量的殼聚糖溶解于2%乙酸溶液中，靜置排除氣泡。在燒杯中分別加入液體石蠟、Span80和乙酸乙酯，攪拌約20 min后，加入上述殼聚糖溶液，升溫至55℃，在400 r/min速度下攪拌1 h；緩慢滴加戊二醛(50%)，再用2.5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后，加入石油醚攪拌5 min，趁熱抽濾，用石油醚洗滌后再用蒸餾水反復(fù)沖洗，抽干，收集備用。

2)殼聚糖微球的活化。稱取一定量上述制得的微球，加入一定濃度的NaOH與環(huán)氧氯丙烷，在恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行活化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水反復(fù)沖洗，直至濾液中無(wú)環(huán)氧基檢出，抽干，收集備用。

3)配基的鍵合。稱取一定量活化后的微球，加入一定濃度的NaOH/配基混合溶液，在恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行配基鍵合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水反復(fù)沖洗，抽干，收集備用。

4)金屬離子的螯合。稱取一定量鍵合配基后的微球，加入50 mL Zn2+溶液，常溫下震蕩反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水反復(fù)沖洗，抽干，即得殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)。

1.3.3 環(huán)氧基修飾密度的定量分析

環(huán)氧基修飾密度采用硫代硫酸鈉滴定法[11]測(cè)定。稱取活化后的微球0.5 g于錐形瓶中，加入約5 mL 1.3 mol/L硫代硫酸鈉與1～2滴酚酞指示劑，封口后在室溫下震蕩反應(yīng)30 min，用0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，由式(1)計(jì)算環(huán)氧基修飾密度：

(1)

式中：S為環(huán)氧基修飾密度(mmol/g)，MHCl為HCl的濃度(mol/L)，V0，Vl為滴定前、后HCl的體積(mL)，W為介質(zhì)的質(zhì)量(g)，ρ為介質(zhì)的密度( g/mL)。

1.3.4 Zn2+螯合量的測(cè)定

稱取一定量鍵合配基后的微球，加入50 mL ZnCl2溶液，常溫下震蕩反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，收集濾液并定容，利用原子吸收分光光度計(jì)在324.7 nm處測(cè)定濾液的吸光值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算Zn2+螯合量。

2 結(jié)果與分析

2.1 活化條件的考察

2.1.1 ECH用量對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響

其他條件不變，分別加入M殼聚糖(g)∶VECH(mL)為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的ECH，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著M殼聚糖(g)∶VECH(mL)的增加，環(huán)氧基修飾密度隨之增大，當(dāng)比例為1∶4時(shí)，環(huán)氧基修飾密度趨于平穩(wěn)，繼續(xù)加入ECH，環(huán)氧基修飾密度無(wú)明顯變化。

圖2 ECH用量對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響

2.1.2 NaOH濃度對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響

其他條件不變，分別加入0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L和1.4 mol/L的NaOH進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，環(huán)氧基修飾密度隨著NaOH濃度的增加而增大，在CNaOH=1.2 mol/L達(dá)到最大值，繼續(xù)加大NaOH濃度，環(huán)氧基修飾密度降低，可能是由于堿濃度過(guò)高導(dǎo)致環(huán)氧基斷開(kāi)。

圖3 NaOH濃度對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響

2.1.3 活化溫度對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響

其他條件不變，活化溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃，結(jié)果如圖4所示。

圖4 活化溫度對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響

由圖4可知，活化溫度對(duì)環(huán)氧基修飾密度影響較大，溫度過(guò)高時(shí)環(huán)氧基修飾密度下降趨勢(shì)明顯，可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致部分環(huán)氧基開(kāi)環(huán)；當(dāng)活化溫度為50℃時(shí)環(huán)氧基修飾密度最大。

2.1.4 活化時(shí)間對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響

其他條件不變，活化時(shí)間分別為2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，環(huán)氧基修飾密度隨著時(shí)間的增加先增大后減小，在4 h時(shí)達(dá)到最大值。這是由于環(huán)氧基在堿性條件下會(huì)發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)，時(shí)間越長(zhǎng)開(kāi)環(huán)越嚴(yán)重，導(dǎo)致環(huán)氧基修飾密度下降。

圖5 活化時(shí)間對(duì)環(huán)氧基修飾密度的影響

Fig 5 Effect of activation time on epoxy group density

綜合上述數(shù)據(jù)確定最佳活化條件為：M殼聚糖(g)∶VECH(mL)為1∶4，NaOH濃度為1.2 mol/L，活化溫度為50℃，活化時(shí)間為4 h。

按照此最佳活化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，環(huán)氧基修飾密度達(dá)0.2472 mmol/g。

表1 最佳活化條件下的平行實(shí)驗(yàn)

2.2 螯合條件的考察

2.2.1 配基對(duì)Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，分別與IDA、乙二胺、NTA螯合，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同配基對(duì)Zn2+螯合量的影響

由圖6可知，與 IDA螯合時(shí)Zn2+螯合量最大，因此選擇IDA為螯合配基。

2.2.2 IDA濃度對(duì)Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，IDA濃度分別為0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L和1.0 mol/L，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，隨著IDA濃度的增大，Zn2+螯合量先增加后降低，在0.6 mol/L時(shí)達(dá)到最大值。

圖7 IDA濃度對(duì)Zn2+螯合量的影響

2.2.3 與IDA反應(yīng)溫度對(duì)Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，與IDA反應(yīng)溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃和80℃，結(jié)果如圖8所示。

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)Zn2+螯合量的影響

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Zn2+螯合量的影響

由圖8可知，反應(yīng)溫度對(duì)Zn2+螯合量影響不大，但溫度大于70℃可能會(huì)導(dǎo)致殼聚糖微球表面發(fā)生降解，使得Zn2+螯合量降低。

2.2.4 與IDA反應(yīng)時(shí)間對(duì)Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，與IDA反應(yīng)時(shí)間分別為4 h、5 h、6 h、7 h和8 h，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，隨著與IDA反應(yīng)時(shí)間的增加，Zn2+螯合量先增大后降低，在6 h時(shí)達(dá)到最大值。

2.2.5 Zn鹽對(duì)Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，分別與ZnCl2、ZnSO4、ZnAC2進(jìn)行螯合，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，與ZnCl2進(jìn)行螯合反應(yīng)時(shí)，Zn2+螯合量最大，因此選擇ZnCl2為螯合鋅鹽。

圖10 不同鋅鹽對(duì)Zn2+螯合量的影響

圖11 ZnCl2濃度對(duì)Zn2+螯合量的影響

2.2.6 ZnCl2濃度對(duì)Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，ZnCl2濃度分別為0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L和0.25 mol/L，結(jié)果如圖11所示。

由圖11可知，隨著ZnCl2濃度增大，Zn2+螯合量先增大后趨于平穩(wěn)，在濃度為0.1 mol/L時(shí)，Zn2+螯合量達(dá)到最大值。

2.2.7 與ZnCl2螯合時(shí)間對(duì)Zn2+螯合量的影響

其他條件不變，與ZnCl2螯合時(shí)間分別為1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，結(jié)果如圖12所示。

圖12 與ZnCl2螯合時(shí)間對(duì)Zn2+螯合量的影響

由圖12可知，與ZnCl2螯合時(shí)間對(duì)Zn2+螯合量影響不大，反應(yīng)達(dá)到3 h后Zn2+螯合量基本不變，因此選擇3 h為最佳螯合時(shí)間。

綜合上述數(shù)據(jù)最佳螯合條件為：IDA作為配基、濃度為0.6 mol/L、反應(yīng)溫度為70℃、反應(yīng)時(shí)間為6 h，ZnCl2作為螯合金屬鹽、濃度為0.1 mol/L、反應(yīng)時(shí)間為3 h，Zn2+螯合量達(dá)到最大值。

2.3 殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)紅外光譜分析

圖13 殼聚糖(a)、IDA-殼聚糖(b)、殼聚糖-Zn(II)(c)紅外光譜圖

由圖13殼聚糖(a)、IDA-殼聚糖(b)的紅外光譜圖可以發(fā)現(xiàn)，位于1150 cm-1歸屬于-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，與IDA鍵合后移至1108 cm-1，峰值減弱，說(shuō)明-OH參與了活化與鍵合配基反應(yīng)；IDA-殼聚糖(b)的紅外光譜圖在2930 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)歸屬于-COOH的吸收峰，說(shuō)明產(chǎn)物中引入了-COOH；由IDA-殼聚糖(b)、殼聚糖-Zn(II)(c)的紅外光譜圖可以發(fā)現(xiàn)，位于1598.24 cm-1歸屬于叔胺的變形振動(dòng)吸收峰，與Zn(II)螯合配位之后，移至1631.66 cm-1，且波強(qiáng)度減弱，峰形變寬，氨基參與了配位反應(yīng)，Zn(II)與N原子之間形成了N-Zn(II)配位鍵；位于1425 cm-1歸屬于-COOH的伸縮振動(dòng)吸收峰，與Zn(II)螯合配位之后，吸收峰移至1455 cm-1，且峰值減弱，說(shuō)明Zn(II)與O原子之間形成了O-Zn(II)配位鍵。綜合以上圖譜變化，證明殼聚糖與Zn(II)發(fā)生了螯合配位反應(yīng)，生成了殼聚糖-Zn(II)配合物。

3 結(jié)論

以自制的殼聚糖微球?yàn)檩d體、環(huán)氧氯丙烷(ECH)為活化劑、亞氨基二乙酸(IDA)為螯合配基、Zn2+為螯合金屬離子制備殼聚糖-Zn(II)親和層析介質(zhì)，并對(duì)親和層析介質(zhì)的活化過(guò)程以及螯合配基與金屬離子過(guò)程的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確定出最優(yōu)的制備工藝。

1)活化工藝。在1.2 mol/L的NaOH溶液中，加入MRCM(g)∶VECH(mL)為1∶4的環(huán)氧氯丙烷，在50℃的恒溫水浴中振蕩反應(yīng)4 h，最終環(huán)氧基修飾密度可達(dá)0.2472 mmol/g。

2)螯合工藝。IDA為螯合配基，濃度為0.6 mol/L，在70℃水浴中震蕩反應(yīng)6 h； ZnCl2為螯合金屬鹽，濃度為0.1 mol/L，在常溫下震蕩螯合反應(yīng)3 h，Zn2+螯合量達(dá)到最大。

通過(guò)紅外光譜表征，證明殼聚糖與Zn(II)發(fā)生了螯合配位反應(yīng)，生成了殼聚糖-Zn(II)配合物。

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Preparation and characterization of chitosan-zinc(II) affinity chromatography medium

ZHANG Jin-jie, ZENG Qing-zhu

(College of Chemical Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China )

The chitosan-zinc(II) affinity chromatography medium chelates with Zn2+using self-made chitosan microspheres as substrate. The iminodiacetic acid(IDA)was attached onto chitosan microspheres activated by epichlorohydrin(ECH). The optimal epoxy density above 0.2472 mmol/g gel was achieved at the proportion of epoxy chloropropane and chitosan microspheres for 1∶4 in the solution consisting of 1.2 mol/LNaOH at 60℃ for 6 h. The study on linkaging of IDA, as ligands, demonstrated that the supporter was synthesized in the solution with 0.6 mol/L IDA at 70℃ for 6 h. When chelating of ZnCl2, as chelating metal salts, synthesized in the solution with 0.1 mol/L ZnCl2for 3 h, the adsorption of Zn2+was up to the maximum. Infrared by IR spectra, the chelating ligand reaction of chitosan and zinc(II) and the generation of the chitosan-zinc (II) complexes were achieved.

chitosan; zinc(II); chitosan-zinc(II); IMAC

2014-06-25；

2014-07-25

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(12C12011620)；廣州市科信局重大專項(xiàng)(2012Y2-00008)

張錦捷，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸じ碑a(chǎn)物的高值化利用；

曾慶祝，教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)副產(chǎn)品加工與應(yīng)用，E-mail：635642890@qq.com。

Q629.12

B

2095-1736(2015)01-0095-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.095