CODEHOP法設(shè)計(jì)引物克隆中華絨螯蟹5-ht1和5-ht2受體基因片段及序列分析

徐澤文， 楊筱珍， 黃 堅(jiān)， 李 彤， 楊志剛， 王 春， 成永旭

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，上海 201306)

CODEHOP法設(shè)計(jì)引物克隆中華絨螯蟹5-ht1和5-ht2受體基因片段及序列分析

徐澤文， 楊筱珍， 黃 堅(jiān)， 李 彤， 楊志剛， 王 春， 成永旭

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，上海 201306)

根據(jù)已報(bào)道的中華絨螯蟹近緣物種的5-ht1r和5-ht2r氨基酸序列保守區(qū)，利用CODEHOP設(shè)計(jì)了兩對簡并引物，采用RT-PCR法擴(kuò)增得到了中華絨螯蟹5-ht1r和5-ht2r部分片段并克隆到pMD-19T載體。測序結(jié)果表明擴(kuò)增到的中華絨螯蟹5-ht1r和5-ht2r片段長分別為366 bp和177 bp，編碼121和58個(gè)氨基酸。經(jīng)BLASTp分析顯示，中華絨螯蟹5-ht1r與羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的5-ht1r同源性高達(dá)98%，而中華絨螯蟹5-HT2R與斷溝龍蝦(Panulirusinterruptus)和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)5-ht2r同源性高達(dá)95%。

CODEHOP；中華絨螯蟹；5-ht1r；5-ht2r；克隆

在十足目甲殼類動(dòng)物中，所有機(jī)體器官系統(tǒng)受到神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的綜合調(diào)控。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)控制著機(jī)體蛻皮、生長和性成熟等多種生理過程，而神經(jīng)激素的合成與釋放受到生物胺的調(diào)節(jié)[1-2]。5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine, 5-HT)作為一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，其普遍存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物當(dāng)中，通過影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中神經(jīng)激素的合成與釋放能夠間接對多種生理作用和行為進(jìn)行調(diào)控[3-5]。有研究報(bào)道5-HT能夠刺激副交感神經(jīng)進(jìn)而誘導(dǎo)未孕家兔(Oryctolaguscuniculus)的子宮收縮[6]；對歐洲黑蜂(Apismelliferamellifera)的研究發(fā)現(xiàn)5-HT可以抑制其進(jìn)食，刺激腸道肌肉收縮對其消化產(chǎn)生影響[7]；將羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)幼體浸泡于一定濃度的5-HT后，促進(jìn)了其生長以及體色的形成[8]。這些調(diào)控均是通過5-HT與其多種不同受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。

在哺乳動(dòng)物當(dāng)中，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)和信號機(jī)制的不同將5-HT受體分為7類，其中6類是G-蛋白偶聯(lián)受體(5-HT1, 5-HT2, 5-HT4,5-HT5, 5-HT6, 5-HT7)，另外一類(5-HT3)是配體門控離子通道[9]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)5-HT1和5-HT2受體，參與了5-HT調(diào)節(jié)少數(shù)魚和蝦類爭勝行為[10]、神經(jīng)細(xì)胞再生與凋亡[11-12]和色素?cái)U(kuò)散[13]的生理過程，但目前有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物中5-HT受體的報(bào)道較少。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹或大閘蟹，屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、絨螯蟹屬(Eriocheir)，由于其具有很高的營養(yǎng)價(jià)值且風(fēng)味獨(dú)特，是中國一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)品種。目前有關(guān)中華絨螯蟹5-HT功能的研究較少，梁攀等[14]研究發(fā)現(xiàn)將中華絨螯蟹仔蟹浸泡于5-HT一段時(shí)間后可能會(huì)促進(jìn)其生長；孫金生等[15]利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，檢測到5-HT能夠調(diào)控中華絨螯蟹神經(jīng)節(jié)髓端X器官的內(nèi)分泌細(xì)胞興奮性及分泌活動(dòng)，誘導(dǎo)CHH和MIH的釋放；楊麗麗等[16]的研究表明注射低劑量5-HT能夠減少中華絨螯蟹的蛻殼時(shí)間，而高劑量的5-HT會(huì)增加蛻殼時(shí)間。這些報(bào)道說明5-HT對中華絨螯蟹的生長和發(fā)育有一定影響，但均未涉及到5-HT受體類型以及5-HT與哪些受體結(jié)合發(fā)揮其生理作用。本研究利用CODEHOP法設(shè)計(jì)了兩對簡并引物，首次克隆得到了中華絨螯蟹5-ht1r和5-ht2r的部分cDNA片段，為后續(xù)進(jìn)一步研究5-HT在中華絨螯蟹生長、繁殖以及行為等方面所起的作用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用中華絨螯蟹成蟹取自上海海洋大學(xué)崇明基地。取其腸道組織，迅速放入液氮中速凍后，置于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

RNAisoTMPlus(總RNA提取)試劑盒、Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTPs、rTaq聚合酶、pMD-19T 載體、Agarose瓊脂糖、DL2000 Marker均購自大連寶生物工程有限公司(Takara)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TOP10感受態(tài)細(xì)胞、氨芐青霉素、X-Gal、IPTG購自天根生化科技有限公司；LB培養(yǎng)基購自上海生工生物工程有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

從冰箱中取出凍存的中華絨螯蟹組織，利用RNAisoTMPlus試劑盒提取總RNA。操作步驟參照說明書上的方法進(jìn)行，并用Recombinant DNase I (Takara)去除所抽提總RNA樣品中殘留的微量DNA。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整度，使用微量紫外分光光度計(jì)(Q5000)檢測RNA的純度。確認(rèn)RNA無降解后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，以1 μg中華絨螯蟹腸道總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板合成第一鏈cDNA，其余置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 簡并引物設(shè)計(jì)

首先查找中華絨螯蟹的近緣物種的氨基酸序列，本研究選取了一些節(jié)肢動(dòng)物門的氨基酸序列。

1)5-ht1r氨基酸序列：羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii(GeneBank登錄號：ACB38667.1)、克氏原螯蝦Procambarusclarkii(GeneBank登錄號：ABX10973.1)、斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon(GeneBank登錄號：AAV48573.1)和斷溝龍蝦Panulirusinterruptus(GeneBank登錄號：AAS18607.1)。

2)5-ht2r氨基酸序列：羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii(GeneBank登錄號：ABM01873.1)、克氏原螯蝦Procambarusclarkii(GeneBank登錄號：ABX10972.1)、斷溝龍蝦Panulirusinterruptus(GeneBank登錄號：AAS57919.1)、果蠅Drosophilamelanogaster(GeneBank登錄號：AGP51353.1)、意大利蜂Apismellifera(GeneBank登錄號：CBX90121.1)、家蠶Bombyxmori(GeneBank登錄號：XP_004923092.1)和印度跳蟻Harpegnathos saltator (GeneBank登錄號：EFN80760.1)。

使用CODEHOP在線程序(http://blocks. fhcrc.org/blocks/)設(shè)計(jì)上下游簡并引物(表1)。設(shè)計(jì)的基本流程如下:查找相應(yīng)基因在NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫—下載近緣物種該基因所編碼的氨基酸序列(格式應(yīng)一致如FASTA格式)—遞交備選序列—Block Maker—Block result — CODEHOP—設(shè)置相應(yīng)參數(shù)—搜索簡并引物—篩選合適的上下游引物。對搜索主要參數(shù)的設(shè)定為：Maximum core degeneracy: 128, Target clamp temperature: 60℃, codon usage table:Litopenaeusvannamei。進(jìn)行引物的篩選時(shí)應(yīng)盡可能遵循簡并度較小、Tm值較高、上下游引物間距離盡可能大的原則。引物的合成由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 5-ht1r和5-ht2r克隆所用簡并引物

簡并度(Degeneracy)—簡并引物的種類數(shù)，等于該簡并引物內(nèi)所有簡并堿基的簡并個(gè)數(shù)之積，即共有多少種不同的引物[17]。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR采用Eppendorf PCR擴(kuò)增儀(Mastercycler pro S)，以中華絨螯蟹腸道cDNA為模版，使用所設(shè)計(jì)的簡并引物進(jìn)行5-ht1r和5-ht2r片段的擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為25 μL: cDNA模板1 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L)4 μL， 10×PCR buffer 2 μL， rTaq(5 U/μL) 0.25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。5-ht1r的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。5-ht2r的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，從58℃下降至54℃退火30 s，每2個(gè)循環(huán)降低2℃，72℃延伸30 s，共6個(gè)循環(huán)。接著按94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的檢測與克隆

在1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測PCR產(chǎn)物，將目的片段產(chǎn)物按照回收試劑盒(Tiangen)進(jìn)行回收純化。取3 μL回收產(chǎn)物與pMD-19T載體16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，而后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。通過菌液PCR對目的基因片段的插入情況進(jìn)行鑒定，挑選結(jié)果為陽性克隆的菌液送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.5 序列分析

將測序產(chǎn)物首先用NCBI的VecScreen去除載體序列，使用序列處理在線工具包SMS(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)將獲得的目的基因核酸序列翻譯為氨基酸序列，然后進(jìn)行BLASTp同源性比較，使用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa /clustalo/)、MEGA 6進(jìn)行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA片段的擴(kuò)增與序列測定

利用設(shè)計(jì)的2對簡并引物進(jìn)行5-ht1r和5-ht2r部分cDNA片段的RT-PCR，結(jié)果兩對引物均擴(kuò)增出特異性的條帶，且片段大小與預(yù)測的結(jié)果相一致(圖1)。通過電泳圖可以看到，兩對引物的特異性較好，沒有擴(kuò)增出非特異性條帶。將擴(kuò)增到的5-ht1r和5-ht2r的部分cDNA片段分別割膠回收并克隆進(jìn)入pMD-19T載體，通過對陽性克隆測序并經(jīng)BLAST比對分析兩條分別為5-ht1r和5-ht2r的部分片段，獲得的片段長度分別為366 bp和177 bp。

圖1 5-ht1r和5-ht2r RT-PCR電泳圖

1—5-ht1rRT-PCR (5-ht1rF+5-ht1rR)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖; M1—DL500分子量標(biāo)準(zhǔn); 2—5-ht2rRT-PCR (5-ht2rF+5-ht2rR)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖; M2—DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 序列及同源性分析

將5-ht1r和5-ht2r兩個(gè)基因片段測序獲得其核酸序列后，經(jīng)推導(dǎo)其蛋白序列長度分別為121個(gè)氨基酸和58個(gè)氨基酸(見圖2和圖4)。而后將它們的氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對分析，結(jié)果顯示中華絨螯蟹5-ht1r氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的多個(gè)物種的5-ht1r具有很高的同源性，其中與羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的同源性高達(dá)98%，與斷溝龍蝦(Panulirusinterruptus)和斑節(jié)對蝦的(Penaeusmonodon)同源性也分別達(dá)到了97%和94%。而5-ht2r的氨基酸序列與斷溝龍蝦和克氏原螯蝦5-ht2r同源性最高，達(dá)95%，與羅氏沼蝦同源性為93%。使用序列在線工具包對5-ht1r和5-ht2r氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果見圖3和圖5。序列分析結(jié)果表明這兩種受體的基因在十足目甲殼類中具有很高的保守性。

圖2中華絨螯蟹5-ht1r片段核苷酸序列及編碼的氨基酸序列

圖3不同物種5-ht1r氨基酸序列的相似性比較

Drosophilamelanogaster(AAY84887.1)：果蠅；Antheraeapernyi(ABY85410.1)：柞蠶；Gryllusbimaculatus(BAJ83479.1)：雙斑蟋；Periplanetaamericana(CAX65666.1)：美洲大蠊；Penaeusmonodon(AAV48573.1)：斑節(jié)對蝦；Panulirusinterruptus(AAS18607.1)：斷溝龍蝦；Procambarusclarkii(ABX10973.1)：克氏原螯蝦；Macrobrachiumrosenbergii(ACB38667.1)：羅氏沼蝦。

圖4中華絨螯蟹5-ht2r片段核苷酸序列及編碼的氨基酸序列

圖5不同物種5-ht2r氨基酸序列的相似性比較

2.3 5-HT1R和5-HT2R的進(jìn)化關(guān)系分析

根據(jù)5-HT1R和5-HT2R氨基酸序列的比對結(jié)果，利用MEGA 6軟件中的Bootstrap和Neighbor-Joining法構(gòu)建5-HT1R和5-HT2R基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖6可以看出中華絨螯蟹5-HT1R與羅氏沼蝦、斷溝龍蝦5-HT1R聚為一枝，與克氏原螯蝦5-HT1R再聚為一枝，之后再與斑節(jié)對蝦的5-HT1R聚為一枝，這些物種均是節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱的種類，符合物種的親緣關(guān)系。而在5-HT2R系統(tǒng)進(jìn)化樹中(圖7)，進(jìn)化樹首先分為兩大枝，一枝由節(jié)肢動(dòng)物門各物種組成，另一枝則由哺乳動(dòng)物和爬行動(dòng)物組成。節(jié)肢動(dòng)物又分為甲殼綱與昆蟲綱的二枝，中華絨螯蟹與同屬于十足目的其它蝦類共處于甲殼綱這一枝下，與哺乳動(dòng)物和爬行動(dòng)物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合傳統(tǒng)分類上物種親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。

圖6 采用N-J法構(gòu)建的5-HT1R氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

箭頭所指為中華絨螯蟹,自展值為1000。

圖7 采用N-J法構(gòu)建的5-HT2R氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

箭頭所指為中華絨螯蟹,自展值為1000。

3 討論

利用氨基酸序列的保守性設(shè)計(jì)簡并引物是克隆未知序列的常規(guī)方法，但是使用傳統(tǒng)設(shè)計(jì)簡并引物的方法往往由于簡并度過高，引物的特異性不好，致使引物的有效利用率過低。有時(shí)為了降低引物的簡并度不得不減少引物的長度，但這又使得引物的Tm值較低，容易產(chǎn)生假陽性。筆者曾經(jīng)使用傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)簡并引物對中華絨螯蟹的5-ht1r和5-ht2r進(jìn)行擴(kuò)增，但均未克隆到相關(guān)的基因片段。與通常設(shè)計(jì)的簡并引物不同，利用CODEHOP法設(shè)計(jì)的簡并引物由5′端非簡并性夾板結(jié)構(gòu)和3′核心簡并區(qū)組成。5′端非簡并性夾板結(jié)構(gòu)最大程度地保持了與預(yù)測保守氨基酸的編碼序列；3′核心簡并區(qū)則是根據(jù)約4～5個(gè)保守氨基酸設(shè)計(jì)的簡并引物。CODEHOP法設(shè)計(jì)引物的優(yōu)點(diǎn)在于既減少了引物的簡并度，又提高了引物的退火溫度，保障了PCR產(chǎn)物的特異性，使得在PCR聚合反應(yīng)的晚期，引物與產(chǎn)物的非特異性結(jié)合減少。本研究改用CODEHOP法設(shè)計(jì)了數(shù)對引物，擴(kuò)增出了所需要的特異片段。在使用CODEHOP設(shè)計(jì)簡并引物時(shí)需要注意的兩點(diǎn)：1)參考所研究物種相近物種的核酸序列以及本物種的密碼子偏好性，對通過CODEHOP在線設(shè)計(jì)得到多對簡并引物作出適當(dāng)?shù)男薷?，以降低其簡并度，然后再進(jìn)行基因克??；2)利用CODEHOP設(shè)計(jì)并修改好簡并引物后，結(jié)合采用降落(touchdown ,TD)PCR[18]的方法不但能提高PCR的特異性，而且對于某些在常規(guī)PCR時(shí)不能擴(kuò)增出來的基因，也能有較好的擴(kuò)增效果。本研究中在使用擴(kuò)增出5-ht2r片段的簡并引物時(shí)，初始并未采用降落PCR的方法，而是使用常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果未發(fā)現(xiàn)特異性的片段條帶。后來在使用同樣模板的情況下，利用該對簡并引物結(jié)合降落PCR的方法成功擴(kuò)增出了 5-ht2r的片段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用CODEHOP法設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增未知序列是一種高效且簡便的方法。

5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine, 5-HT) 作為體內(nèi)重要血管活性物質(zhì)和神經(jīng)系統(tǒng)的重要遞質(zhì)，廣泛參與機(jī)體各種機(jī)能活動(dòng)的調(diào)節(jié)和某些病理生理過程。5-HT對心血管以及消化系統(tǒng)具有十分重要的作用，可因其作用部位、用藥劑量以及實(shí)驗(yàn)條件的不同而產(chǎn)生極其復(fù)雜的結(jié)果。早在20世紀(jì)50年代就發(fā)現(xiàn)5-HT的復(fù)雜作用是通過作用于體內(nèi)特異性的5-羥色胺受體(5-Hydroxytryptamine receptor, 5-HTR)而實(shí)現(xiàn)的[19]。5-HT及其受體對于神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控具有十分重要的作用，本實(shí)驗(yàn)利用中華絨螯蟹近緣物種的氨基酸序列，運(yùn)用CODEHOP法設(shè)計(jì)簡并引物，經(jīng)RT-PCR獲得了中華絨螯蟹5-ht1r和5-ht2r的部分片段，為獲得這兩種基因的全序列以進(jìn)一步研究它們與5-HT對中華絨螯蟹的生理調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。

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CODEHOP PCR primers for cloning 5-ht1and 5-ht2receptor fragments inEriocheirsinensis

XU Ze-wen, YANG Xiao-zhen, HUANG Jian, LI Tong,YANG Zhi-gang, WANG Chun, CHENG Yong-xu

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China )

According to the conserved amino acid sequences of known 5-Hydroxytryptamine receptors, CODEHOP (Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)software was used to design degenerate primers to obtain partial cDNA fragments of 5-HT1and 5-HT2receptors (5-ht1rand 5-ht2r) in Chinese mitten crab (Eriocheirsinensis). The fragments of 5-ht1rand 5-ht2rwere amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and then cloned into pMD-19T vector. The sequencing results revealed that 5-ht1rand 5-ht2rfragments contain 366 and 177 base pairs, which encode 121 and 58 amino acids respectively. BLAST analysis indicated that the amino acid homology of 5-ht1rwas 98% similar toMacrobrachiumrosenbergiiandProcambarusclarkia, and the 5-ht2rwas most similar toPanulirusinterruptusandProcambarusclarkia(95%).

CODEHOP;Eriocheirsinensis; 5-ht1r; 5-ht2r; cloning

2014-08-13；

2014-09-01

國家自然科學(xué)基金(31272677)；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2012GB2C000147)；上海市科委科技合作專項(xiàng)(13231203504)；上海市學(xué)術(shù)帶頭人計(jì)劃(12XD1402700)

徐澤文，碩士研究生，主要從事中華絨螯蟹消化道功能方面的研究，E-mail：seb_341225@126.com；

成永旭，博士，教授，研究方向?yàn)榧讱?dòng)物營養(yǎng)繁殖，E-mail: yxcheng@shou.edu.cn。

Q78；S917.4

A

2095-1736(2015)01-0001-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.001