基于葉綠體psbA-trnH序列和trnL-F序列的牡丹野生種間關(guān)系

馮玉蘭， 成 娟， 臧榮鑫， 王明明， 陳 紅， 何麗霞

(1. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030； 2. 甘肅省林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣總站，蘭州 730046)

基于葉綠體psbA-trnH序列和trnL-F序列的牡丹野生種間關(guān)系

馮玉蘭1， 成 娟2， 臧榮鑫1， 王明明1， 陳 紅1， 何麗霞2

(1. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030； 2. 甘肅省林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣總站，蘭州 730046)

對(duì)牡丹組全部9個(gè)野生種15個(gè)居群及鳳丹的葉綠體psbA-trnH和trnL-F序列進(jìn)行測序，并采用鄰位相連法分別構(gòu)建了 psbA-trnH序列和trnL-F序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示：1)兩段序列的基因樹均支持牡丹組劃分為兩個(gè)亞組的分類方法，與前人的研究結(jié)果一致。2)psbA-trnH序列基因樹表明大花黃牡丹與黃牡丹的親緣關(guān)系最近，這與大花黃牡丹曾被確定為黃牡丹的一個(gè)變種的歷史一致。3)革質(zhì)花盤亞組內(nèi)，基于psbA-trnH和trnL-F序列的研究結(jié)果大體一致，分歧主要在四川牡丹的地位問題。4)psbA-trnH序列和trnL-F序列基因樹分別表明楊山牡丹與鳳丹具有最近或較近的親緣關(guān)系。

芍藥屬；牡丹組；系統(tǒng)發(fā)育；psbA-trnH序列；trnL-F序列

牡丹屬芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect. Moutan DC.)，為多年生落葉灌木，所有種皆為我國特有[1]。牡丹組9 個(gè)種[2]分為兩個(gè)亞組，革質(zhì)花盤亞組(Subsect. Vaginatae)包括四川牡丹(Paeoniadecomposita)、卵葉牡丹(Paeoniaqiui)、稷山牡丹(Paeoniajishanensis)、楊山牡丹(Paeoniaostii)和紫斑牡丹(Paeoniarockii)5個(gè)種，肉質(zhì)花盤亞組(Subsect. Delavayanae)包括大花黃牡丹(Paeonialudlowii)、紫牡丹(Paeoniadelavayi)、狹葉牡丹(Paeoniapotanini)、黃牡丹(Paeonialutea)4個(gè)種。牡丹廣泛分布于中國四川、云南、西藏、陜西、甘肅等地[3]。

目前對(duì)于芍藥屬牡丹組各野生種親緣關(guān)系研究已取得一定進(jìn)展，但對(duì)牡丹野生種的起源、進(jìn)化以及牡丹組的分類系統(tǒng)等問題還存在許多分歧[4]。這是由于依據(jù)經(jīng)典分類學(xué)，單純用表型性狀去推測具有不同基因型的分類群之間的系統(tǒng)演化關(guān)系會(huì)遇到許多問題。因此，關(guān)于牡丹野生種間的親緣關(guān)系還需進(jìn)一步探討與研究。

植物葉綠體基因組(cpDNA)具有單系遺傳，分子水平上具有明顯差異以及適用于不同分類階元系統(tǒng)發(fā)育研究的特點(diǎn)[5]，被認(rèn)為是研究種間甚至種內(nèi)材料系統(tǒng)進(jìn)化和親緣關(guān)系的理想工具[6]。葉綠體psbA-trnH 序列是位于psbA和trnH間的一段非編碼序列，與編碼區(qū)基因相比可提供更多的系統(tǒng)發(fā)育信息。在芍藥屬中，psbA-trnH 區(qū)間的進(jìn)化速率要高于 matK 基因，稍慢于 ITS，同時(shí)序列中的 gap 編碼還可提高物種的鑒定率[7-8]。葉綠體trnL-F序列是由 trnL內(nèi)含子與trnL-F非編碼間區(qū)以及被分隔的trnL3′端外顯子區(qū)所組成，這段序列不受功能的限制，表現(xiàn)出進(jìn)化速率大于功能編碼區(qū)的特點(diǎn)，可用于屬間及屬下分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究[9]。

目前尚未有利用葉綠體DNA這兩個(gè)間隔子序列對(duì)牡丹組全部野生種種間親緣關(guān)系的分析。因此，本研究使用牡丹組全部9個(gè)野生種15個(gè)居群及鳳丹的葉綠體psbA-trnH和trnL-F序列進(jìn)行分析，通過比較牡丹野生種的核苷酸序列組成和排列信息，以期對(duì)其進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究，為芍藥屬牡丹組植物野生種間親緣關(guān)系提供直接的分子證據(jù)，并為牡丹組植物的進(jìn)化和演化分析提供新的依據(jù)。

表1 材料來源

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

供試材料為牡丹9個(gè)野生種共15個(gè)居群及鳳丹，均取自甘肅省林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣總站牡丹種質(zhì)資源圃。樣品編號(hào)、名稱及引種地見表1。

1.1.2 試劑

天根植物組DNA提取試劑盒、天根Taq PCR Kit、天根純化試劑盒

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取

取新鮮的牡丹葉片，洗凈晾干后，經(jīng)液氮研磨，采用天根植物組DNA提取試劑盒(50次/盒)對(duì)樣品進(jìn)行總DNA的提取。共得到16個(gè)DNA樣品(見圖1-a)。

圖1 總DNA提取結(jié)果(a); psbA-trnH引物PCR擴(kuò)增及純化結(jié)果(b,c); trnL-F引物PCR擴(kuò)增結(jié)果(d,e); 以及克隆文庫藍(lán)白斑篩選(f); M 為DNA Marker 2000; 1-32為擴(kuò)增序列編號(hào)；CK為對(duì)照。

Fig 1 Total DNA (a), PCR products amplified by psbA-trnH Primers (b) and purified products (c), PCR products amplified by trnL-F primers (d,e), and blue-white selection (f).

1.2.2 PCR反應(yīng)

針對(duì)葉綠體不同區(qū)斷分別采用2套引物(psbA-trnH 區(qū)( 引物為：psbA-trnH )、 trnL-F區(qū)(引物為： trnL-F ))，按照天根Taq PCR Kit 說明書對(duì)所提DNA(5倍稀釋)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR總體系為25 uL， 其中：buffer 2.5 uL； dNTP 2 uL； Primer 1 uL； ddH2O 18.1 uL；DNA template 1 uL；Taq polymerase 0.4 uL。psbA-trnH PCR程序?yàn)椋?4℃ 預(yù)變性5min； 94℃變性30s, 54℃退火30s, 72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。trnL-F PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s, 50℃退火1min, 72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳監(jiān)測，其中， psbA-trnH引物擴(kuò)增序列為1～16號(hào)(見圖1-b，6′、10′為6、10號(hào)DNA樣品的重復(fù)擴(kuò)增)；trnL-F引物擴(kuò)增序列為17～32號(hào)(第一次擴(kuò)增后23、26號(hào)可以用，其余重新擴(kuò)增，見圖1-d,e，22′、26′為6、10號(hào)DNA樣品的重復(fù)擴(kuò)增)。

1.2.3 純化與連接

采用天根純化試劑盒對(duì)psbA-trnH 引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化(30uL洗脫,見圖1-c)，純化后連接至 pGEM-T 載體 ( Promega, USA)，連接體系為：buffer 5uL；vector 0.5uL；T4 ligase 0.5 uL；ddH2O 3uL；DNA template 1uL；total 10 uL。連接時(shí)間為14h(4°C冰箱中)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建克隆文庫(見圖1-f)，每一克隆文庫隨機(jī)挑取 1個(gè)陽性克隆斑利用T7載體引物進(jìn)行DNA序列測序(上海美吉生物技術(shù)公司)。

trnL-F 引物擴(kuò)增產(chǎn)物無需純化，直接連接至pGEM-T 載體，連接體系同上。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同psbA-trnH。在進(jìn)行DNA序列測序時(shí)，采用T7/SP6載體引物雙向測定。

1.2.4 測序和序列分析

最終獲得32條DNA序列。利用MEGA 6.06軟件，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 自展數(shù)( bootstrap) 為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 序列分析

2.1.1 psbA-trnH序列分析

本研究測得牡丹野生種15個(gè)居群及鳳丹的psbA-trnH序列長為443～463bp，變化由少數(shù)種的堿基缺失所致，對(duì)位排列后長度為471bp，空位始終作為缺失處理，GC 含量變化范圍為 33.0%～34.50%，保守位點(diǎn)437個(gè)，變異位點(diǎn)22 個(gè)，簡約信息位點(diǎn) 16 個(gè)，單獨(dú)位點(diǎn)6個(gè)，分別占序列總長度的92.8%，4.7%，3.4%和1.3%。

2.1.2 trnL-F序列分析

本研究測得牡丹野生種15個(gè)居群及鳳丹的trnL-F區(qū)序列長為1054～1074bp，變化由少數(shù)種的堿基缺失所致，對(duì)位排列后長度為1081 bp，空位始終作為缺失處理，GC 含量變化范圍為 35.5%～36.0%，保守位點(diǎn)1036個(gè)，變異位點(diǎn)37個(gè)，簡約信息位點(diǎn)5個(gè)，單獨(dú)位點(diǎn)32個(gè)，分別占序列總長度的95.8%，34.2%，0.5%和 3.0%。

2.2 分子系統(tǒng)樹

基于葉綠體psbA-trnH和trnL-F序列的牡丹組全部9個(gè)野生種共15個(gè)居群及鳳丹的系統(tǒng)發(fā)育樹分別見圖2、圖3。系統(tǒng)樹顯示, 全部野生種在聚類關(guān)系上分為兩大類: 狹葉牡丹、紫牡丹、黃牡丹及大花黃牡丹聚為第一大類；紫斑牡丹、楊山牡丹、鳳丹、四川牡丹、稷山牡丹及卵葉牡丹聚為第二大類。

基于psbA-trnH序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)表明：大花黃牡丹與黃牡丹親緣關(guān)系最近；紫牡丹與狹葉牡丹的親緣關(guān)系最近；稷山牡丹、卵葉牡丹以及紫斑牡丹的子午嶺、?？岛团R洮3個(gè)居群聚為一支；四川牡丹、楊山牡丹和‘鳳丹’及紫斑牡丹的舟曲、文縣和黨川3個(gè)居群聚為一支。

基于trnL-F序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)表明：大花黃牡丹與狹葉牡丹親緣關(guān)系最近；四川牡丹、稷山牡丹、卵葉牡丹以及紫斑牡丹的子午嶺、?？岛团R洮3個(gè)居群聚為一支；楊山牡丹和鳳丹及紫斑牡丹的舟曲、文縣和黨川3個(gè)居群聚為一支。

圖2 用鄰位相連法構(gòu)建的 psbA-trnH序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 用鄰位相連法構(gòu)建的trnL-F序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

根據(jù)李嘉玨等的分類方法可將牡丹組分為 9 個(gè)野生種[11]，其中肉質(zhì)花盤亞組包括狹葉牡丹、紫牡丹、黃牡丹及大花黃牡丹共4個(gè)種；革質(zhì)花盤亞組包括紫斑牡丹、楊山牡丹、四川牡丹、稷山牡丹及卵葉牡丹共5個(gè)種。本研究對(duì)9個(gè)野生種15個(gè)居群基于葉綠體psbA-trnH序列和trnL-F序列的基因樹分析支持牡丹組劃分為兩個(gè)亞組的分類方法，與前人的研究結(jié)果一致(圖2、圖3)[4, 12-13]。

肉質(zhì)花盤亞組內(nèi)，本研究基于psbA-trnH序列的結(jié)果表明大花黃牡丹與黃牡丹的親緣關(guān)系最近(圖2)，這與大花黃牡丹曾被確定為黃牡丹的一個(gè)變種的歷史一致[14]。而基于trnL-F序列的結(jié)果表明，大花黃牡丹與黃牡丹的親緣關(guān)系較近；黃牡丹和狹葉牡丹的親緣關(guān)系也較近(圖3)。

革質(zhì)花盤亞組內(nèi)，基于psbA-trnH和trnL-F序列的研究結(jié)果大體一致(圖2、圖3)，其中稷山牡丹、卵葉牡丹以及紫斑牡丹的子午嶺、?？岛团R洮3個(gè)居群聚為一支；楊山牡丹和鳳丹及紫斑牡丹的舟曲、文縣和黨川3個(gè)居群聚為一支。分歧主要在四川牡丹的地位問題，基于psbA-trnH序列的結(jié)果表明，四川牡丹與紫斑牡丹的關(guān)系最近，與Tank等的gpat分析結(jié)果一致[15-16]；而基于trnL-F序列的結(jié)果表明，四川牡丹與卵葉牡丹的關(guān)系較近。目前的報(bào)道中有關(guān)四川牡丹與其他野生種間的關(guān)系尚無一致的結(jié)論[16]。關(guān)于楊山牡丹和鳳丹的關(guān)系一直有兩種觀點(diǎn)，其中一種觀點(diǎn)認(rèn)為鳳丹是楊山牡丹的同種異名[17]，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為鳳丹是楊山牡丹演化的栽培亞種[18]。本實(shí)驗(yàn)基于葉綠體psbA-trnH序列的基因樹分析表明楊山牡丹與鳳丹親緣關(guān)系最近，而基于葉綠體trnL-F序列的基因樹分析則顯示鳳丹不僅與楊山牡丹具有很近的親緣關(guān)系，也與紫斑牡丹的黨川和文縣居群具有較近的親緣關(guān)系。

綜上所述，由于牡丹種質(zhì)在長期的自然選擇和人工選擇下積累了豐富的遺傳變異[19-20]，僅憑某一水平或某一手段無法準(zhǔn)確推測各分類群間的親緣關(guān)系，必須根據(jù)植物學(xué)形態(tài)特征及多種分子水平上的分類方法對(duì)其進(jìn)行更深入的研究，為牡丹種質(zhì)資源利用及品種改良等提供科學(xué)依據(jù)。

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Phylogenetic Relationships ofPaeoniaSect. Moutan Based on Chloroplast psbA-trnH and trnL-F Sequences

FENG Yu-lan1， CHENG Juan2, ZANG Rong-xin1, WANG Ming-ming1, CHEN Hong1, HE Li-xia2

(1. Life Science and Engeneering College, Northwest University of Nationalities, Lanzhou 730030, China;2. Forestry Research Institution of Gansu Province, Lanzhou 730046, China)

The psbA-trnH sequences and trnL-F sequences of nine species in Sect. Moutan DC. and one cultivar Fengdan’ were sequenced, then the phylogenetic trees based on two sequences were constructed by Neighbor-joining (NJ) methods in MEGA 6.06, respectively. The results showed as follows: 1) Nine species in Sect. Moutan DC. were divided into two Subsects from two phylogenetic trees, consistent with previous research results. 2)Paeonialudlowii, that had been identified as a variation ofPaeonialutea, was most closely related toPaeonialuteabased on psbA-trnH sequences. 3) The results were largely consistent in Subsect. Vaginatae, except the relationship betweenPaeoniadecompositaand other four species bases on two sequences. 4)Paeoniaostiihad the closest or very closer relationship with the cultivar Fengdan’ based on psbA-trnH sequences and trnL-F sequences, respectively.

Paeonia; Sect. Moutan; phylogenetic relationships; psbA-trnH sequences; trnL-F sequences

2014-08-09；

2014-10-17

西北民族大學(xué)2012年度中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(zyz2012068)

馮玉蘭，碩士研究生,講師,研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)，E-mail:fyl@xbmu.edu.cn。

S685.11;Q943.2

A

2095-1736(2015)01-0055-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.055