草菇谷胱甘肽還原酶基因受低溫影響的表達(dá)研究

趙 妍, 馬丹丹, 2, 姜 威, 顏素雅, 陳明杰

(1. 國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所， 上海 201403； 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 《食用菌學(xué)報(bào)》， 上海 201403)

草菇谷胱甘肽還原酶基因受低溫影響的表達(dá)研究

趙 妍1, 馬丹丹1, 2, 姜 威1, 顏素雅1, 陳明杰1

(1. 國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所， 上海 201403； 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 《食用菌學(xué)報(bào)》， 上海 201403)

谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)在真菌抵御逆境脅迫中起到重要作用，通過(guò)比對(duì)在草菇全基因組中獲得編碼gr的核苷酸序列。以對(duì)低溫耐受性不同的草菇菌株V23(低溫敏感型)和VH3(耐低溫型)為試驗(yàn)材料，研究了低溫脅迫對(duì)草菇菌絲gr的影響，并比較了該基因在V23和VH3中的表達(dá)差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：在低溫處理的最初2 h，低溫敏感型菌株V23的gr相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)降低，到低溫處理4～8 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量分別上升至V23 0 h對(duì)照的1.78倍、1.05倍和1.36倍；耐低溫型菌株VH3的gr相對(duì)表達(dá)量，在低溫脅迫的最初2 h時(shí)也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，到低溫處理4～6 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量分別上升至VH3 0 h對(duì)照的1.47倍和1.41倍，但在低溫處理8 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量又降低至VH3 0 h對(duì)照的0.72倍。在正常生長(zhǎng)和低溫處理?xiàng)l件下，V23的gr相對(duì)表達(dá)量始終高于VH3，初步推測(cè)本試驗(yàn)中g(shù)r的高表達(dá)可能與草菇的耐低溫能力無(wú)關(guān)。

草菇；低溫；谷胱甘肽還原酶基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

草菇[Volvariellavolvacea(Bull.) Singer]又名稻草菇、中國(guó)菇，起源于中國(guó)熱帶與亞熱帶地區(qū)。它肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，不僅能烹制成各種美味佳肴，更具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與保健功效[1]。目前草菇主產(chǎn)區(qū)遍布東南亞各國(guó)，中國(guó)是其最主要的生產(chǎn)國(guó)與出口國(guó)[2]。由于草菇屬高溫菇種，其菌絲生長(zhǎng)與子實(shí)體分化發(fā)育的最適溫度均在32℃左右，因此草菇不耐低溫貯藏。在常規(guī)低溫貯藏條件下，草菇菌絲體會(huì)發(fā)生自溶死亡，子實(shí)體亦會(huì)液化、產(chǎn)生異味，從而失去商業(yè)價(jià)值[3]。草菇這種不耐低溫貯運(yùn)的特性，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，因此對(duì)其低溫應(yīng)答機(jī)制的研究成為亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。

低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生過(guò)多的活性氧(ROS)物質(zhì)，如O2·-、OH·、1O2、H2O2等。ROS具有較高的毒性，能夠引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)發(fā)生氧化[4]，對(duì)糖類、DNA及細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損傷，從而影響細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此為了維持體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡，生物體常借助酶促清除系統(tǒng)和非酶促清除系統(tǒng)去除多余的ROS。酶促清除系統(tǒng)主要由抗氧化酶組成，如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)等；非酶促清除系統(tǒng)主要由抗氧化劑組成，如抗壞血酸(ASA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和類胡蘿卜素等[5-6]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽小分子，能與過(guò)氧化物和自由基結(jié)合，從而維持含巰基蛋白質(zhì)的生物活性[7]。GR作為催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成GSH的重要酶類，在實(shí)現(xiàn)ASA再生，保障APX清除H2O2的過(guò)程中起到重要的作用[8]。研究表明，在南極衣藻(Chlamydomonassp. ICE-L)適應(yīng)低溫的過(guò)程中，GSH含量及GR活性與低溫適應(yīng)之間具有正相關(guān)性[9]；此外，韓春然等[10]研究了GSH對(duì)酵母抗凍能力的影響，結(jié)果表明添加GSH的冷凍面團(tuán)中的酵母菌落數(shù)、產(chǎn)氣能力均顯著高于未添加的冷凍面團(tuán)，而冷凍面團(tuán)的重量損失則低于未添加組。目前催化GSH生成的gr在草菇應(yīng)答低溫脅迫中的表達(dá)及作用尚不清楚。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室已有的草菇基因組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，擬采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)低溫處理不同時(shí)間下草菇V23和VH3菌絲體的gr表達(dá)變化進(jìn)行研究，探討gr與草菇耐低溫能力間的相關(guān)性，為草菇低溫自溶的遺傳改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與試劑

草菇菌株V23和VH3由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供。VH3是由V23經(jīng)紫外線、60Co-γ射線、硫酸二乙酯對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行復(fù)合誘變而來(lái)，相對(duì)V23較耐低溫[11-12]。

Redzol試劑盒購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；TaqDNA Polymerase in Storage Buffer B、pGEM?-T Easy Vector System I購(gòu)自Promega公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?PremixExTaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自碧迪醫(yī)療器械有限公司；其它試劑均為市售分析純。

1.2 草菇菌絲總RNA的提取與cDNA的合成

將培養(yǎng)好的草菇菌絲置于0℃分別處理0、2、4、6和8 h，收集備用?？俁NA的提取參照Redzol試劑盒說(shuō)明書，并用50 μL經(jīng)DEPC預(yù)處理的水溶解，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定RNA的濃度后，依據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書，去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3gr編碼基因的獲得

根據(jù)草菇基因組中同源物種的gr登錄號(hào)，在NCBI中獲得同源物種該基因的氨基酸序列，然后與草菇全基因組序列信息進(jìn)行比對(duì)，并使用NCBI中的blastx程序，按照GT-AG原則去除可能的內(nèi)含子，得到草菇gr的核苷酸編碼區(qū)序列。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

以微管蛋白(Tubulin, TUB)基因作為內(nèi)參基因，依據(jù)已得到的草菇gr的編碼區(qū)序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物

1.5 目的片段的擴(kuò)增與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備

以草菇cDNA為模板，擴(kuò)增獲得tub和gr基因的片段，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。將PCR的純化產(chǎn)物與pGEM?-T Easy Vector System I載體連接，制備標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒后構(gòu)建real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

1.6gr的實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定

使用質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒，將獲得的質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，在StepOne Plus熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋曲線。根據(jù)擴(kuò)增效率和擴(kuò)增趨勢(shì)線的斜率，確定采用ΔΔCT法對(duì)gr進(jìn)行相對(duì)定量[14]。Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR?PremixExTaqTMⅡ10 μL；10 μmol/L正反向引物各0.4 μL；50×Rox Reference Dye 0.4 μL；cDNA 模板2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性20 s；95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。以無(wú)菌雙蒸水代替模板作為陰性對(duì)照，每組樣品設(shè)置3個(gè)平行樣品孔。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取效果與目的片段的擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，提取RNA的28S、18S、5S條帶清晰，且A260/A280>1.9，表明RNA完整性較好(圖1)。擴(kuò)增得到的目的片段條帶單一，大小均在100 bp左右，測(cè)序結(jié)果與原始設(shè)計(jì)序列的長(zhǎng)度及堿基順序完全相同(圖2)。

圖1 草菇V23和VH3菌絲總RNA的電泳圖

圖 2 目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增片段

M—DL2000 Marker； 1—tub； 2—gr

其中微管蛋白基因的目的片段長(zhǎng)度為114 bp(CCAACACTACCGCTATCTCCTCGGCTTGGAGTCGCCTTGATCACAAGTTCGACCTCCTCTATTCGAAGCGTGCTTTCGTGCATTGGTACGTTGGTGAGGGTATGGAGGAAGGTG)

谷胱甘肽還原酶基因的目的片段長(zhǎng)度為125 bp(CAAAACGTGTCGCTGTCGTAGGTGCTGGGTACATTGCAGTCGAACTGGCTGGCATTTTCAATGCCCTGGGCAGTGAAACTCACTTGATCATTCGTTATGATCGTGTTTTGAGGCGATTTGACCCC)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶解曲線的構(gòu)建

含有g(shù)r的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.345，R2為1，基因擴(kuò)增效率為99.05%，與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近，并且接近于1。對(duì)相同稀釋點(diǎn)作差得到△CT(對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的CTgr-CTtub)，并以cDNA稀釋點(diǎn)作為橫坐標(biāo)，獲得線性方程的斜率為0.0038，表明gr可以使用△△CT法進(jìn)行定量。圖4是gr經(jīng)real-time PCR擴(kuò)增后的熔解曲線，熔解曲線在84℃時(shí)出現(xiàn)單一峰，表明gr呈特異性擴(kuò)增。

圖3 草菇谷胱甘肽還原酶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 草菇谷胱甘肽還原酶基因的擴(kuò)增熔解曲線

2.3 低溫脅迫下草菇谷胱甘肽還原酶基因的表達(dá)變化

低溫處理后草菇兩菌株的gr和tub經(jīng)熒光定量擴(kuò)增后得到CT值，計(jì)算獲得gr的相對(duì)含量。

2-△△CT[注：△△CT=(CTgr-CTtub)處理組-(CTgr-CTtub)對(duì)照組]

在正常生長(zhǎng)條件下即0 h對(duì)照組，草菇菌株V23菌絲內(nèi)的gr相對(duì)表達(dá)量要高于VH3；經(jīng)低溫處理后，兩菌株的gr相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，同一菌株內(nèi)低溫處理組的gr相對(duì)表達(dá)量均高于各自0 h對(duì)照組(低溫處理2 h和VH3中低溫處理8 h除外，圖5)。其中V23在低溫處理的最初2 h，gr的相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，在低溫處理4 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量上升至V23 0 h的1.78倍；隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然在6 h、8 h時(shí)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但是其含量始終高于對(duì)照組，分別達(dá)到對(duì)照組的1.05倍和1.36倍。VH3的gr相對(duì)表達(dá)量，在低溫脅迫的最初2 h時(shí)也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，到低溫處理4 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量上升至VH3 0 h的1.47倍；之后隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，gr的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢(shì)。草菇兩菌株在相同的低溫處理時(shí)間下，V23的gr相對(duì)表達(dá)量要明顯高于VH3。

圖 5 低溫處理不同時(shí)間下V23和VH3菌絲中谷胱甘肽

3 討論

低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)多的ROS物質(zhì)是加速草菇衰老的重要原因，ROS能使膜極性脂質(zhì)發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞膜的選擇滲透功能。GSH是一種非常重要的非酶促抗氧化劑[15-16]，它通過(guò)GR催化還原GSSG而得到。在GSH結(jié)構(gòu)中半胱氨酸側(cè)鏈基團(tuán)上連有一個(gè)活潑巰基，它是GSH許多重要生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在逆境下能保護(hù)體內(nèi)重要酶蛋白的巰基不被氧化、滅活，有助于酶活性的發(fā)揮[17]。在正常的生理?xiàng)l件下，GSH的濃度是GSSG濃度的10～100倍[18]，較高含量的GSH與細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)關(guān)系密切。

為了深入了解催化GSH生成的gr在草菇低溫應(yīng)答過(guò)程中的表達(dá)變化與作用，本試驗(yàn)以低溫敏感型菌株V23和耐低溫型菌株VH3為研究對(duì)象，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)低溫脅迫對(duì)gr表達(dá)的影響，并找出該基因在草菇2個(gè)菌株中的表現(xiàn)差異。定量結(jié)果顯示，除低溫處理8 h外，草菇菌株V23和VH3的gr相對(duì)表達(dá)量在低溫處理期間的變化趨勢(shì)一致。兩菌株的gr相對(duì)表達(dá)量均在低溫處理2 h時(shí)出現(xiàn)降低，表明在低溫脅迫初期，V23和VH3的gr基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，表達(dá)量出現(xiàn)下降。之后隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，同一菌株內(nèi)低溫處理組的gr相對(duì)表達(dá)量均高于各自的0 h對(duì)照組(VH3低溫處理8 h除外)，表明兩菌株的gr轉(zhuǎn)錄水平得到提高，可能將更多的GSSG還原為GSH以應(yīng)對(duì)低溫脅迫。但無(wú)論在正常生長(zhǎng)條件下，還是在整個(gè)低溫處理期間，V23菌株的gr相對(duì)表達(dá)量始終高于VH3，推測(cè)可能VH3中的GR活性更高，或者VH3借助其它抗氧化劑、抗氧化酶來(lái)清除過(guò)多的ROS物質(zhì)，使其比V23更耐低溫，這些還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)低溫脅迫下谷胱甘肽還原酶基因表達(dá)變化的研究，為深入探索草菇低溫自溶機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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The relative expression of glutathione reductase gene inVolvariellavolvaceaduring low temperature stress

ZHAO Yan1, MA Dan-dan1, 2, JIANG Wei1, YAN Su-ya1, CHEN Ming-jie1

(1. National Engineering Research Center of Edible Fungi; Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture; Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding;Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China;2. Editorial Department of ACTA EDULIS FUNGI, Institute of Edible Fungi,Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China)

Glutathione reductase (GR) plays an important role in response to abiotic stress in fungi. The nucleotide sequence ofgrgene was obtained by BLAST search in whole-genome database ofVolvariellavolvacea. The study was performed to examine differential transcriptional responses ofgrgene to low temperature stress in mycelia of twoVolvariellavolvaceastrains, V23 (cold-sensitive) and VH3 (cold-tolerant). The relative expression levels ofgrgene in the two strains were measured by real-time PCR. Results showed that the relative expression ofgrgene in V23 decreased at 2 h. Compared to V23 at 0 h, it increased from 4 h to 8 h, with the fold of 1.78, 1.05 and 1.36, respectively. The relative expression ofgrgene in VH3 also decreased at 2 h. Compared to VH3 at 0 h, it increased from 4 h to 6 h, with the fold of 1.47 and 1.41, respectively. However, it decreased again at 8 h with 0.72 fold of VH3 at 0 h. The relative expression ofgrgene in V23 was higher under both normal condition and low temperature stress than that in VH3, which indicated that the higher expression ofgrgene in this study may not be associated with the better adaptation ofVolvariellavolvaceato low temperature stress.

Volvariellavolvacea; low temperature; glutathione reductase gene; real-time quantitative PCR

2014-07-10；

2014-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301828)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(2011第1-2號(hào))

趙 妍，博士，助理研究員，主要從事食用菌生理生化與功能基因研究，E-mail:jiandan289@126.com；

陳明杰，博士，研究員，主要從事食用菌遺傳育種與功能基因研究，E-mail:mjchen@saas.sh.cn。

S646.1+3

A

2095-1736(2015)01-0044-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.044